マウスの腸からの樹状細胞およびマクロファージの単離とキャラクタリゼーション
2012年5月21日
ここでは、マウスの腸管樹状細胞(DC)とマクロファージを迅速に単離するための方法論について詳しく説明します。腸管DCおよびマクロファージの表現型特性評価は、マルチカラーフローサイトメトリー分析を使用して行われ、磁気ビーズ濃縮とそれに続く細胞選別は、機能研究のための高純度の集団を生成するために使用されます。
この手順の全体的な目標は、表現型および機能的特性評価のために、マウス腸樹状細胞またはDCおよびマクロファージを迅速に単離することです。これは、最初に腸組織を採取することによって達成されます。2番目のステップは、腸上皮をラミン固有から解離することです。
次に、手順の最終ステップで腸の固有ラミンが消化されます。Lamin propria細胞は、蛍光で染色され、標識抗体で染色され、特定の細胞集団に対してゲーティングされます。最終的には、腸内DCおよびマクロファージ集団をより正確に特徴付け、精製して、サイトカイン産生抗原の提示と免疫細胞の調節を評価するための機能研究を行うことができます。
したがって、既存の方法に対するこの技術の主な利点は、組織消化の迅速さにより、最適な細胞表面抗原発現、細胞生存率、および/または細胞性が保証されることです。マウスを安楽死させ、つま先つま先つまみ反射で死亡を確認した後、動物の腹部と胸部に70%エタノールを試験的に噴霧します。次に、ハサミを使用して腹部の中央に小さな水平切開を行い、皮膚をはがして腹膜を露出させます。
腹膜を裂孔括約筋で切って胃を上部小腸から分離し、鉗子を使用して腸間膜をからかい取った後、ハサミを使用して腹膜を開きます。回盲弁で再度切断して、小腸全体を大腸から解放します。大腸から腸間膜を引き離し続け、肛門の端に切り込み
を入れます。はさみを使用して結腸を縦方向に切り開き、室温のC-M-F-P-B-Sを使用して腸管腔から糞便内容物と粘液を洗い流します。次に、はさみと鉗子を使用して巨視的にします。小腸の抗腸間膜表面に沿ってパイアパッチを解剖し、小腸を縦方向に切り開きます。
次に、小腸の内腔から糞便内容物と粘液を取り除き、室温C-M-F-P-B-Sを増やします。これとは別に、小腸と大腸を約1.5センチメートルに切断し、FBSと2ミリモルEDTAを備えた戦前の30ミリリットルのC-M-F-H-B-S-Sを含む個々の50ミリリットルの円錐管に入れます。各50ミリリットルの円錐形チューブをオービタルシェーカーに水平に置き、チューブを250RPMで摂氏37度で20分間振とうします。
次に、廃棄物バケツの上に単一のメッシュワイヤーストレーナーを置きます。各50ミリリットルの円錐管の内容物をメッシュに通して腸片を回収し、次にそれらを30ミリリットルのプレウォームC-M-F-H-B-S-Sと2ミリモルEDTAのFBSを含む新しい個々の50ミリリットルの円錐管に入れます。最後に、チューブをオービタルシェーカーにさらに20分間戻します。
2回目の振とうの後、各チューブの内容物をストレーナーに注ぎます。再度、ペーパータオルを使用して余分なメディアを軽くたたき、次に腸の断片を小さなプラスチック製のホエイボートに移します。この技術の最も難しい側面は、成功を確実にするための組織消化であり、消化期間、コラゲナーゼの特性、組織の完全性、および消化される組織のサイズのすべての異なるパラメータを考慮する必要があります。
腸片を切り刻み、次にミンチ腸を20ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を含む50ミリメートルの円錐管に加えます。円錐管を水平にオービタルシェーカーに入れ、腸片を200RPMで摂氏37度で10〜20分間消化します。次に、チューブを短時間ボルテックスして、残っている腸組織が完全に解離するようにしてから、100ミクロンのセルストレーナーを介して細胞スラリーを直接ろ過して50ミリリットルの円錐管に入れます。
最後に、FBS入りのC-M-F-H-B-S-Sで円錐管を補充し、細胞溶液を摂氏4度でGの425倍で5分間2回遠心分離します。次に、上清を注ぎ、細胞ペレットをFBSを使用して氷冷したC-M-F-H-B-S-Sに再懸濁し、サンプルを氷の上に置きます。目的の表面タンパク質について細胞を染色した後。
まず、ここに示すように、死細胞染色に陽性の細胞を除外したドットプロットを作成します。次に、こことここに示すように、ダブレットイベントを除外します。次に、前方散乱チャンネルと側方散乱チャンネルを使用して、目的の細胞をゲートし、デブリを除外します。
次に、CD 45陽性抗原とIAB陽性抗原に別のドットプロットゲーティングを作成します。セルを別々のドットプロットで表示することで、特定のDCサブセットとマクロファージサブセットを区別するための領域が作成されます。ここに示すR1領域は、CD11C陽性CD11Bの鈍い陰性細胞を捕捉する。
R 2領域は、R one領域の細胞と同様のレベルのCD 11 Cの表面発現を有するが、CD 11 Bも発現する細胞を描写する。これらの3つの領域は、F、4、80、およびCD1 0、3の発現についてさらに解析し、マクロファージおよびDC集団をそれぞれ区別することができる。このドットプロットに見られるように、R one領域のCD 11 C陽性のCD 11 Bの鈍い陰性細胞は、α ein CD 1 0 3の高レベルとF4 80の低レベルを発現します。
このドットプロットは、R 2領域のCD 11 B陽性CD11 C陽性細胞が、CD 1 0 3とF 4 80の二値発現に基づいてDCSとマクロファージの両方で構成されることを示しています。最後に、それらのF 4 80陽性およびCD1 0 3陰性の表現型プロファイルR 3に基づいて、ゲート型CD11B陽性CD11Cデル陰性細胞はマクロファージで構成され、全細胞収量に対する組織消化の持続時間とCD11BおよびCD11Cの発現との関係は、以下の6つの図に示されている。3分間消化された腸組織は、低い総細胞数をもたらし、その結果、特性評価に利用できるDCとマクロファージがほとんどありません 11分間の組織消化は、生細胞の堅牢な収量を生み出し、表現型的に異なる高レベルのCD 11 BおよびCD 11 Cを発現するdcおよびマクロファージの集団を生み出します。
対照的に、50分間の消化では、最適化された消化と比較して、同様の細胞収量が得られます。しかし、CD 11 BとCD 11 Cを用いた異なる細胞集団の描写はより困難になります。CD11 Cの発現が減少し、死細胞の数が増加すると。
したがって、腸組織消化のパラメーターを最適化すると、堅牢な細胞収量を迅速に達成できます。その結果、マウスの腸内DCとマクロファージの迅速な単離は、無傷の表面抗原を持つ免疫細胞の機能特性を評価するのに役立ちます。
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概要
この記事では、マウスの腸管樹状細胞（DC）とマクロファージの迅速な分離のための方法論について詳述します。この手順には、腸組織の収穫、腸上皮の分離、そしてこれらの免疫細胞の正確な特徴付けと精製のためのラミナプロプリアの消化が含まれます。
主要な研究要素
科学の分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- 神経科学
背景
- 腸管の樹状細胞とマクロファージは免疫応答において重要な役割を果たします。
- 正確な分離は機能的研究に不可欠です。
- 多色フローサイトメトリーが表現型の特徴付けに使用されます。
- 磁気ビーズ濃縮が細胞の純度を高めます。
研究の目的
- マウスの腸管DCとマクロファージを迅速に分離すること。
- これらの細胞を表現型および機能的に特徴付けること。
- サイトカイン産生と抗原提示を評価すること。
使用された方法
- マウスからの腸組織の収穫。
- ラミナプロプリアからの腸上皮の分離。
- 細胞集団を得るためのラミナプロプリアの消化。
- フローサイトメトリーのための蛍光共役抗体による細胞の染色。
主な結果
- 腸管DCとマクロファージの高純度な集団の成功的な分離。
- フローサイトメトリーを用いた正確な表現型の特徴付け。
- これらの免疫細胞の機能的側面を研究する能力の向上。
- サイトカイン産生と免疫調節に関する洞察。
結論
- この方法論は免疫細胞の迅速かつ効率的な分離を可能にします。
- 腸管免疫応答の詳細な機能研究を促進します。
- 腸管DCとマクロファージの免疫における役割の理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid isolation of viable intestinal dendritic cells and macrophages enables accurate phenotypic and functional characterization of gut immune populations. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in immunology-focused discovery programs by preserving surface antigen expression and cell viability. The method provides a reproducible system for evaluating immunomodulatory compounds in a disease-relevant context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of dendritic cell and macrophage subsets in intestinal tolerance and inflammation pathways.
- Operational Value: Provides purified cell populations for functional assays assessing cytokine production and antigen presentation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative flow cytometry readouts for DC and macrophage activation states.
- Operational Value: Supports assay standardization through magnetic bead enrichment and multi-color staining protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates preclinical evaluation of gut-targeted immunomodulators using physiologically relevant immune cells.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical workflows via standardized isolation and characterization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by providing a reliable source of intestinal immune cells for hypothesis testing and pathway clarification.
- Discovery Biology: Supports functional validation of targets involved in mucosal immunity and immune regulation.
- Screening: Delivers reproducible, high-yield cell preparations for compound screening and phenotypic profiling.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cell surface markers and functional outputs via flow cytometry.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical studies through consistent immune cell preparation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for intestinal immunology projects across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by preserving native cell surface antigen expression and viability.
- Operational Value: Reduces variability through rapid, standardized tissue digestion and isolation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of immunomodulatory effects in a relevant tissue context.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates targeting gut immunity pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic digestion, and flow cytometry.
- Dependent on access to orbital shakers, cell strainers, and magnetic separation equipment.
- Necessitates standardization of digestion time and collagenase activity across labs.
- Involves adaptation considerations when applying to different mouse strains or intestinal regions.
- Limited by the need for fresh tissue and immediate processing to maintain cell integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Dissection and Dissociation of Intestinal Epithelial Cells
3:56
Tissue Digestion and Isolation of Intestinal Cells
5:47
Gating Strategy for Laimna Propria Antigen-presenting Cells
7:55
Results: Cell Yield and Antibody Staining Quality Depends on Digestion Time
8:58
Conclusion
