Name: マウスの腸からの樹状細胞およびマクロファージの単離とキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶマウス腸管から樹状細胞とマクロファージを迅速に単離する方法。上皮とLamin propriaの分離、コラゲナーゼ消化、フローサイトメトリーによる解析で、細胞表面抗原発現と生存性を保ちながら免疫応答を評価する。

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細胞ソーティングにご協力いただいたAaron Rae氏（エモリー大学小児科学科およびアトランタ小児医療センター・フローサイトメトリーコア）に感謝いたします。本研究は、NIHグラントAA01787001、Crohn's and Colitis Foundation of Americaからのキャリア開発賞、およびT.L.D.に対するエモリー・エグルストン小児研究センターのシードグラントによる支援を受けて行われました。

1。腸上皮細胞の解離および解離試薬や機器の調製： <ul><li>室温へのCa 2 + / Mg 2 +のフリーのPBS（CMF PBS）暖かい。 </li><li> 5％FBS（CMF HBSS / FBS）と室温に2mMのEDTAと暖かいのCa 2 + / Mg 2 +のフリーのHBSS。 </li><li> 37暖かいオービタルシェーカー℃、 </li></ul> 注：ステップ1.1から1.7までは、細胞死の程度を最小限に抑え、最大の細胞収率を達成するために、できるだけ早く実行する必要があります。 <ol><li>腹部と胸部の上にCO 2チャンバーとスプレー70％エタノールでマウスを安楽死させる。 </li><li>バックシザーと皮腹膜を露出する皮膚と腹部の真ん中に小さな水平方向の切開を行います。 </li><li>幽門括約筋で切断して上部小腸から胃を分離するために進んでください。ピンセットで腸間膜を離れていじめると、再びカット大腸から小腸全体を解放するために回腸盲腸弁。肛門縁で切断して、再度大腸が解放されるまで腸間膜を離れていじめる。 </li><li>縦方向にはさみを使用して大腸を開いてカットし、室温でCMF PBSで腸管腔から糞便の内容と粘液を洗い流してください。 </li><li>肉眼的に小腸の抗腸間膜表面に沿ってパイエル板を分析し、長手方向に小腸を開いてカットするはさみや鉗子を使用しています。 </li><li>室温で糞便の内容とCMF、PBS中の粘液の小腸内腔を洗浄します。 </li><li>別々に予め温めておいたCMF HBSS / FBSおよび2mM EDTA 30mlを含む別の50 mlコニカルチューブに約1.5cmの部分と所定の位置に大きい/小さい腸を切った。 50 mlコニカルチューブあたり1以上の腸を追加しないでください。 </li><li>水平オービタルシェーカーに各50 mlコニカルチューブを配置し、℃、&lt;37℃で20分間、250 rpmで振とう/ LI&gt; <li>廃棄物のバケットを介して単一のメッシュワイヤーストレーナーを配置し、腸の1.5cmの部分を回復することを介して各50 mlコニカルチューブの内容物を注ぐと2で予め温めておいたCHBSS / FBSの30ミリリットルを含む別の50 mlコニカルチューブに置くmMのEDTA。 </li><li> 1.8を繰り返します。 </li></ol> 2。組織の消化と腸細胞の単離試薬や機器の準備： <ul><li>コラゲナーゼ溶液： のDNase Iの40μg/ mlのであらかじめ温めておいたCMF HBSS / FBSに溶解した1.5​​ mg / mlのタイプVIIIのコラゲナーゼ</li><li>予め温めておいたCMF HBSS / FBSおよび2mM EDTA。 </li><li> 37℃で予め温めておいたオービタルシェーカー℃、 </li><li>氷冷CMF HBSS / FBS。 </li></ul><ol><li>揺れの第二ラウンドの後、ストレーナーを介して各50 mlコニカルチューブの内容物を注ぎ、小さなプラスチックに腸の1.5cmの部分を転送するペーパータオルを使用して、過剰なメディアを離れてたたく後、ボートの重量を量る。 </li><li>急速に1をミンチ腸の0.5センチメートル部分は重量のボートで直接はさみを使用して、コラゲナーゼ溶液20mlにミンチ腸を追加します。水平方向に37℃で10〜20分間、200 rpmでオービタルシェーカーとダイジェストに各50 mlコニカルチューブを配置℃で最適化に関する以下の説明を参照してください。 </li><li> 50mlコニカルチューブに直接100μmのセルストレーナーを介して任意の残りの腸組織、フィルタの徹底した解離を確保するために簡単にボルテックスします。 </li><li> CMF HBSS / FBSおよび4℃で5分間1500rpmで遠心分離℃でそれぞれ50 mlコニカルチューブオフトップ固体ペレットを遠心分離の後にコロンのサンプルで観察されていない場合、サンプルは3.5分間再度遠心分離する必要があります。もう一度、この洗浄ステップを繰り返します。 </li><li>上清を捨て、氷の上に氷冷CMF HBSS / FBSと場所をサンプル中の細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>高速セルsorti用の磁気ビーズ濃縮のためのFACS収集/分析または第4項については、セクション3に進みますNG。 </li></ol> 3。樹状細胞とマクロファージのマルチカラーフローサイトメトリー分析のための抗体染色試薬や機器の準備： <ul><li>氷冷PBS CMF。 </li><li>氷冷染色緩衝液（CMF PBS + 5％FBS）。 </li><li> LIVE / DEAD修正可能アクア死細胞染色キットを使用して、1:1000希釈で氷冷CMF PBSで染色死細胞を準備します。 </li><li> CD45-PerCPで、CD103-PEは、CD11c-APC、MHC-II（IA B）のAlexa Fluor 700、CD11bを以下の蛍光標識モノクローナル抗体（mAb）の氷冷染色バッファーに追加することによって、抗体染色カクテルを準備します。 -eFluor 450 F4/80-PE-Cy7。 </li></ul><ol><li> 5 mlのポリスチレン丸底（FACS）チューブに細胞を移す。 </li><li>氷冷CMF PBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li>死んだ細胞とインキュベートしたサンプルは、暗所で氷上で15分間染色する。 </li><li>氷冷CMF PBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li>氷冷染色で2.4G2anti-FcγRIII/IIで細胞をブロックする氷上で10分間バッファ。 </li><li>氷冷染色緩衝液で細胞を洗浄します。 </li><li>暗闇の中で氷上で20分間、抗体染色のカクテルでサンプルをインキュベートします。 </li><li>回氷冷染色緩衝液で細胞を洗浄し、氷冷染色バッファー400μlのサンプルを再懸濁し、FACSチューブに40μmのフィルターキャップを通過します。 </li><li>第5節、 図1にゲート戦略で定義されているLSR IIフローサイトメーター（BD）のサンプルを取得します。 </li></ol> 4。腸からの樹状細胞とマクロファージの濃縮試薬や機器の準備： <ul><li>氷冷染色緩衝液（CMF PBS + 5％FBS）。 </li></ul><ol><li>製造元の指示に従って、CD11bをおよびCD11c MACSビーズでステップ2.5から得られた単一細胞懸濁液をインキュベートします。 </li><li>遠心分離に続いて氷冷染色緩衝液で細胞を洗浄します。 </li><li>上清を捨て、1mlの氷冷染色バッファーで細胞ペレットを再懸濁40μmのセルストレーナーに続いて100μmのセルストレーナーを通過します。 </li><li> MACS LS磁気カラムを用いて、ポジティブセレクションにより磁気ビーズ付着細胞を濃縮。 </li><li>ステップ4.2を繰り返し、上清を捨てる。 </li><li> 、ステップ3.7で説明表面マーカーモノクローナル抗体で細胞をインキュベートします。 </li><li>氷冷染色緩衝液で2回磁気ビーズ濃縮細胞を洗浄します。アジ化ナトリウムをせずに500μLの氷冷染色バッファーで細胞ペレットを再懸濁し、そしてFACSチューブに40μmのセルストレーナーを通過します。 </li><li>腸のDCおよび/または興味のあるマクロファージサブセットをソートするためにBD ARIA IIセルソーターでソーティングFACSに進みます。 </li></ol> 5。 LP APCのためのゲーティング戦略 注 ：染色腸の細胞は、正と負の集団を分離するためにゲートの適切な配置を支援するために、ネガティブコントロールとして利用することができるのでご注意ください。 <ol><li> 図に示すように、1、ドットプロットを作成し、二重のイベントの除外（ 図1BおよびC）に続いて染色死細胞（ 図1A）のために陽性の細胞を除外します。その後、前方および側方散乱は（ 図1D）の残骸を除外することを確認することに応じて目的の細胞のゲート。 </li><li> CD45上の別のドットプロットし、さらにゲートを作成して+とIA B +細胞は、表現型APCを特徴づける（ 図1E）。 </li><li>独立したドットプロットで、特定のDCおよびマクロファージサブセット（;図1F R1、R2、およびR3）を区別するために、CD11bをおよびCD11c発現について分析します。 R1の細胞は、CD11cはある+ CD11bを鈍い/ -細胞。地域、R2はまた、CD11bを発現し、R1がR2の細胞の細胞のように、これらの細胞はCD11cの表面発現の同様のレベルを持っていることをそのような線引きされています。 -その後、R3領域はCD11bの+と/鈍いのCD11cているセルに指定されています。 </li><li>不定冠詞領域R1、R2、およびそれぞれ、マクロファージやDC集団を区別するために、F4/80とCD103発現のためにR3をさらにalyze。のCD11c + CD11bを鈍い/ - R1急行αEインテグリン高レベルのCD103とF4/80の低レベル（ 図1G）の細胞。 CD11bを+のCD11c + R2の細胞がCD103とF4/80（ 図1H）彼らの二分式に基づいて樹状細胞やマクロファージの両方で構成されています。最後に、CD11bを+ CD11cは鈍い/ - R3の細胞は、F4/80 +とCD103の表現型のプロファイルに基づいてマクロファージを構成する- （ 図1I）16。 </li></ol> 6。代表的な結果<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4040/4040fig1.jpg" /> 図1。腸の樹状細胞やマクロファージのゲーティング戦略。死細胞（A）とダブレット（BおよびC）は、最初の分析から除外して、小さなintestiた内部の細胞は、転送することがそれに応じてゲートされ、側方散乱（D）と、APCはCD45のように定義されたIA + B +（E）。マクロファージや樹状細胞はCD11bをおよびCD11c（F）の発現により同定した。 R1（G）、R2（H）とR3（I）個体群の事前ゲートセルのCD103とF4/80の発現を解析した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4040/4040fig2.jpg" /> 図2。細胞収率と抗体染色の質は消化時間に依存します。CD11bをおよびCD11c染色パターンと下の（A、D）の全細胞収量、最適な-（B、E）以上消化し ​​ます（C、F）腸組織。 腸の細胞は、BD LSR IIのFACSにより分析したC57BL / 6マウス小腸および樹状細胞やマクロファージから単離した。電圧と補償は染色、単一の蛍光色素で染色した脾細胞を使用して設定された。死んだ細胞（ 図1A）とダブレットた（ 図1BおよびC）は最初から除外された分析。興味のある細胞は、その後に転送するようによると、側方散乱（ 図1D）CD45ゲーティングに続いて+とIA B +細胞（ 図1E）を分析した。その後、CD11bをおよびCD11cの発現がCD45の間で評価されたIA + bの 3つの領域を（R1、R2、およびR3。図1F）線引きする+細胞。 3地域におけるCD103とF4/80の発現は、それぞれ、樹状細胞やマクロファージを区別するために評価した。のCD11c + CD11bを鈍い/ - R1の細胞は、インテグリンαE、CD103、およびF4/80の低レベル（ 図1G）の高いレベルを表明した。 CD11bを+のCD11c + CD11bを+のCD11c /鈍いながらR2の細胞は、CD103とF4/80（ 図1H）彼らの二分式に基づいて樹状細胞やマクロファージの両方で構成されていた- R3の細胞はF4 /の表現型プロファイルに基づいてマクロファージを構成する80 +とCD103 - （ <strオング&gt;図。 1I）16。 R3ゲートにR2ゲートとマクロファージ内マクロファージは、同様の前方および側方散乱特性を持っているおよびCD11c発現により区別できます。これらのサブセットの機能的な二分法は、完全には理解のままです。 全細胞収量およびCD11bおよびCD11cの発現に及ぼす組織の消化時間の関係を図2に示されています。 3分（下の消化）のために消化し ​​た腸組織は、低総細胞数（ 図2D）を得たと特性（ 図2A）のために利用できるため、いくつかの樹状細胞やマクロファージ。 11分のための組織消化では、CD11bをおよびCD11cの高レベルで発現した（ 図2C）表現型が異なっていた樹状細胞とマクロファージの集団で生きている細胞（ 図2E）の堅牢な収量を生産した。対照的に、50分（以上消化）の消化は、同様の細胞収率をもたらした時のCO最適化された消化（ 図2E及びF）にmparedしかしながら、CD11bをおよびCD11cを使用して異なる細胞集団の描写（ 図2C）CD11cは減少の発現など、よりあいまいになり、死んだ細胞の数は、（データは示さず）増加しました。

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利害の衝突が宣言されません。

<img src="/files/ftp_upload/4040/4040fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。細胞収率と表面抗原の発現を最適化するための重要な要素。細胞収率と表面抗原の発現を直接組織消化の期間に影響される、コラゲナーゼの固有の特性、ミンチ組織の程度、炎症の有無、これは、組織の整合性と細胞性に影響を与える可能性があります。不十分な組織の消化は、分析のための細胞の不足につながるかもしれませんが長引く組織の消化が減少し、細胞生存率と表面抗原の発現につながる可能性があります。 ここでは、マルチカラーフローサイトメトリーを用いて表現型の特性評価のために、精製した細胞での機能研究を実施するためにソートMACSビーズと細胞を用いて濃縮するためのマウス腸管樹状細胞とマクロファージの迅速分離するための方法論を詳述。コラゲナーゼの濃度を最適化すると組織の消化の期間は生存率および表面抗原の発現を損なうことなく、強固な細胞収率を生成する必要があります。下の消化は、低総細胞数および特性（ 図2AおよびD）</stron...

<table><tbody><tr><td>1X PBS, Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;およびMg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-free</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド含有ハンクス平衡塩溶液 (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3001603</td><td></td></tr><tr><td>重曹 (炭酸水素ナトリウム)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>0.85% NaCl含有 1M HEPES</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td>熱不活化</td></tr><tr><td>0.5M EDTA (pH 8.0)</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ type VIII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche Group</td><td>14785000</td><td>ストック溶液: 100mg/ml</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua 死細胞染色キット (405 nm 励起用)</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td>1:1000で希釈して使用</td></tr><tr><td>CD45-PerCP mAb (30F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>1:100で希釈して使用</td></tr><tr><td>CD103-PE mAb (M290)</td><td>BD Biosciences</td><td>557495</td><td>1:100で希釈して使用</td></tr><tr><td>Fc&amp;#947;RIII/II mAb (2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>1:200で希釈して使用</td></tr><tr><td>CD11c-APC mAb (N418)</td><td>eBioscience</td><td>17-0114-82</td><td>1:100で希釈して使用</td></tr><tr><td>MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb</td><td>eBioscience</td><td>56-5321-82</td><td>1:100で希釈して使用</td></tr><tr><td>CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-82</td><td>1:200で希釈して使用</td></tr><tr><td>F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8)</td><td>eBioscience</td><td>25-4801-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11b マイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-601</td><td></td></tr><tr><td>CD11c マイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>シングルメッシュワイヤーストレイナー</td><td>Chefmate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型秤量皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-116</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m セルストレイナー</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m セルストレイナー</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ポリスチレン製ラウンドボトムチューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>1:100で希釈して使用</td></tr><tr><td>MaxQ 4450 ベンチトップオービタルシェーカー</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS MACS カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの腸からの樹状細胞およびマクロファージの単離とキャラクタリゼーション

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

腸内に付随して残りの侵襲的な病原体1,2に向かって炎症反応をマウントする態勢を整えながら、共生植物や食物抗原に対する寛容の促進に関与している自然免疫と適応免疫細胞のユニークな集団を常駐します。抗原提示細胞、特に樹状細胞やマクロファージは、感知し、適切に細菌3月14日に応答する能力を介して腸管免疫恒常性を維持する上で重要な役割を果たしている。腸の樹状細胞とマクロファージの効率的な分離は、これらの細胞の表現型と機能を特徴づける重要なステップです。樹状細胞とマクロファージを含む腸管免疫細胞を、単離の多くの効果的な方法は6,10,15-24を説明してきたが、多くは否定的な細胞表面抗原の発現、細胞の生存、および/ ​​または細胞収量に影響を与える可能性がある長い消化時間に依存しています。ここでは、詳細viabl大量の迅速分離するための方法論をE、腸の樹状細胞やマクロファージ。腸の樹状細胞とマクロファージの表現型の特性が直接マルチカラーフローサイトメトリー分析のために特定の蛍光標識モノクローナル抗体を用いて分離された腸の細胞を染色することにより行われる。さらに、高純度のDCおよびマクロファージの集団は細胞選別が続くとCD11b CD11cは磁気活性化細胞選別ビーズを利用した機能性研究のために隔離されています。

本稿では、マウス腸管樹状細胞（DCs）およびマクロファージを迅速に単離するための手法を詳細に説明します。腸管DCsおよびマクロファージの表現型解析には多色フローサイトメトリー分析を用い、機能研究のための高純度な細胞集団を得るには、磁気ビーズによる濃縮後、セルソート（細胞分取）を行います。

腸管内には、共生細菌叢に対する耐性の促進に関与する、自然免疫細胞および獲得免疫細胞の特有の集団が存在し、...

この手順の全体的な目的は、表現型および機能的特性を解析するために、マウスの腸管樹状細胞（dc）およびマクロファージを迅速に単離することです。まず腸管組織を採取し、次に腸管上皮を固有層から分離させることでこれを達成します。次に、手順の最終段階として腸管固有層を消化します。固有層細胞を蛍光標識抗体で染色し、特定の細胞集団をゲーティングします。最終的に、腸管DCおよびマクロファージ集団をより正確に特性評価し、サイトカイン産生、抗原提示、および免疫細胞の調節を評価するための機能研究に向けて精製することが可能になります。本手法の既存手法に対する主な利点は、組織消化が迅速であるため、細胞表面抗原の発現、細胞生存率、または細胞状態を最適に維持できることです。マウスを安楽死させ、足指つまみ反射で死亡を確認した後、動物の腹部と胸部に70% ethanolをスプレーしてください。次に、鋏を用いて腹部中央に小さな水平切開を加え、皮膚を剥いで腹膜を露出させます。幽門括約筋で切断して胃と上部小腸を分離し、ピンセットで腸間膜を剥離した後、ハサミで腹膜を開きます。次に、回盲弁で再び切断し、小腸全体を大腸から切り離します。引き続き大腸から腸間膜を剥離し、肛門縁で切断します。ハサミを用いて結腸を縦方向に切り開き、室温のC-M-F-P-B-Sを使用して腸管腔内の糞便内容物と粘液を洗浄します。次に、ハサミとピンセットを用いて、小腸の腸間膜反対側に沿ってパイエル板を肉眼的に切り出し、小腸を縦方向に切り開きます。次に、室温のC-M-F-P-B-Sを用いて、小腸管腔内の糞便および粘液を洗浄します。別途、小腸と大腸を約1.5 cmの断片に切り分け、FBSと2 mM EDTAを含む、あらかじめ加温したC-M-F-H-B-S-S 30 mLが入った個別の50 mLコニカルチューブに入れます。各50 mLコニカルチューブをオービタルシェーカーに水平に設置し、37 °Cで250 RPMにて20分間振盪します。次に、廃棄用バケツの上にメッシュワイヤーストレーナーを1つ置きます。各50 milliliterコニカルチューブの内容物をメッシュに通して腸管片を回収し、2 millimolar EDTAを含むFBS添加Prewarm C-M-F-H-B-S-S 30 millilitersを入れた新しい個別の50 milliliterコニカルチューブに移します。最後に、チューブをオービタルシェーカーに戻し、さらに20分間振とうします。2回目の振盪後、各チューブの内容物をストレーナーに通して注ぎます。再びペーパータオルで余分な培地を吸い取り、その後、腸管片を小型のプラスチック製ウェーボートに移します。この手法で最も困難な点は組織の消化であり、成功させるためには、消化時間の設定、コラゲナーゼの特性、組織の完全性、および消化させる組織のサイズといったあらゆるパラメータを考慮し、ハサミを用いて迅速に操作する必要があります。腸管片を細切し、その刻んだ腸管を20 mLのコラゲナーゼ溶液を含む50 mmコニカルチューブに加えます。コニカルチューブをオービタルシェーカーに水平に設置し、37 °Cで200 RPMにて10〜20分間、腸管片を消化させます。次に、チューブを短時間ボルテックスして、残った腸管組織を完全に解離させ、その後、細胞スラリーを100 µmのセルストレーナーでろ過し、50 mLコニカルチューブに直接回収します。最後に、コニカルチューブの残りの容量をFBS添加C-M-F-H-B-S-Sで満たし、細胞懸濁液を4°C、425 ×gで5分間、2回遠心分離します。次に、上清を捨て、細胞ペレットを氷冷したFBS添加C-M-F-H-B-S-Sで再懸濁し、サンプルを氷上に置きます。その後、目的の細胞表面タンパク質で細胞を染色します。まず、ここで示すように、死細胞染色陽性の細胞を除外するドットプロットを作成します。次に、ここでおよびここで示すように、ダブレットイベントを除外します。続いて、前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）チャネルを用いて、デブリを除外しながら目的の細胞をゲートします。次に、CD 45陽性およびIAB陽性の抗原提示細胞をゲートして別のドットプロットを作成します。個別のドットプロットで、特定のDCおよびマクロファージサブセットを区別するための領域を設定します。ここで示されているR1領域は、CD 11 C陽性かつCD 11 B dull negativeの細胞を抽出したものです。R2領域は、R1領域の細胞と同様のレベルでCD11Cを表面発現しているが、同時にCD11Bも発現している細胞を定義します。R3領域は、CD11B陽性かつCD11C dull negativeである細胞を示します。これら3つの領域をさらにF4/80およびCD103の発現について解析することで、それぞれマクロファージ集団とDC集団を区別することができます。このドットプロットに見られるように、R1領域のCD11C陽性CD11B dull negative細胞は、高レベルのαE CD103と低レベルのF4/80を発現します。このドットプロットは、R2領域のCD 11 B陽性CD 11 C陽性細胞が、CD 1 0 3およびF four 80の二分的な発現に基づき、DCとマクロファージの両方で構成されることを示しています。最終的に、F four 80陽性かつCD 1 0 3陰性の表現型プロファイルR3に基づき、ゲートされたCD 11 B陽性CD 11 C陰性細胞はマクロファージで構成されます。組織消化時間と全細胞回収数、およびCD 11 BとCD 11 Cの発現との関係を、以下の6つの図に示します。3分間消化した腸組織では全細胞数が少なくなり、その結果、特性解析に利用可能なDCおよびマクロファージが少なくなります。11分間の組織消化では、生存細胞が高い回収率で得られ、CD 11 BおよびCD 11 Cを高レベルで発現し、表現型として明確に区別されるDCおよびマクロファージの集団が得られます。対照的に、50分間の消化では、最適化した消化と同程度の細胞回収率が得られます。しかし、CD 11 BおよびCD 11 Cを用いた異なる細胞集団の区別はより困難になります。これは、CD 11 Cの発現が減少し、死細胞数が増加するためです。このように、腸管組織の消化パラメータを最適化することで、効率的に十分な細胞回収量を得ることができます。その結果、マウス腸管のdcsおよびマクロファージを迅速に単離することは、表面抗原が保持された免疫細胞の機能的特性を評価する上で有用です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ミルテニーMACのキットを用いてリンパ球の分離は、全体のリンパ組織のホモジネートから細胞を浄化するために信頼性の高い方法です。国内でのみ有効のシステムを使用して精製した細胞は通常、≥96パーセント純粋です。ここで、我々は、CD4 +...

CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

マウス肺樹状細胞の高度に精製された調製物が記載されている。特定の重点は、従来の樹状細胞サブセットの分離に与えられます。...

マウス肺樹状細胞の分離

パイエル板の細胞の特定の亜集団（PPS）、腸管関連リンパ組織の主要な誘導部位の免疫学的機能を理解する上で関心が高まっている。ここでは、フローサイトメトリー解析と免疫染色のためのPPの凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルの概要を説明します。...

マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

このプロトコルは、濃度の単一細胞懸濁液を遠心分離し、最後に、磁気および/または目的の細胞集団のFACS選別に続いて、組織の酵素消化の異なるステップを介して、ヒト胸腺から抗原提示細胞を単離する方法を詳述する。...

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

明確な樹状細胞サブセットは、リンパ器官に稀な集団として存在するため、免疫学的実験に十分な数と純度で単離することが困難です。ここでは、マウス脾臓樹状細胞の現在知られている主要なサブセットをすべて単離するための高効率、高収率の方法について説明します。...

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

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マウスの小腸リンパ球の単離およびフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

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腸管関連リンパ組織パイエル排水腸間膜リンパ節など誘導サイトと粘膜を含むエフェクター...

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コラゲナーゼEを用いてマウスコロンからのラミナプロプリア単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞

この研究は、単離された灌流マウスの脳脈絡叢に対するフローサイトメトリーおよび2つの異なるゲーティング戦略を使用する。このプロトコルは、この脳構造に移入する主要な免疫細胞サブセットを識別します。...

微小解剖マウス脈絡叢からの免疫細胞の単離と特性評価

学ぶマウス腸管から樹状細胞とマクロファージを迅速に単離する方法。上皮とLamin propriaの分離、コラゲナーゼ消化、フローサイトメトリーによる解析で、細胞表面抗原発現と生存性を保ちながら免疫応答を評価する。

マウスの腸からの樹状細胞およびマクロファージの単離とキャラクタリゼーション

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