複雑な脳の地形を明らかにするためWholemount免疫組織化学

本手順の全体的な目的は、完全な脳構造全体における遺伝子発現の複雑なパターンを明らかにすることです。まず、動物に灌流を行い、脳を摘出します。次に、小脳を解剖し、ホールマウント染色プロトコルを用いて処理します。

最終ステップは、組織化学的呈色反応を用いて遺伝子発現を可視化することです。最終的に、明視野顕微鏡を用いて表面の遺伝子発現パターンを撮影します。組織切片の免疫組織化学などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、再構築の必要なく、複雑なパターンを三次元的に可視化できることです。

手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるJoshua Whiteです。動物を安楽死させ、頭蓋骨から脳を取り出した後、まずピンセットの先を上胼胝体と下胼胝体の中間に挿入し、小脳を脳の他の部分から分離します。次に、もう一本のピンセットを使用して、胼胝体と皮質を小脳からゆっくりと剥離させます。

小脳の前側が下を向き、脳幹が上を向くように配置します。次に、脳幹と小脳の第9および第10葉の間に、ピンセットを第四脳室に挿入します。ピンセットで両側を挟んで脚を切断し、小脳を脳幹から慎重に持ち上げて分離させます。

小脳を4%パラアルデヒドに浸し、4°Cで最低24時間から48時間後固定します。ドラフトチャンバー内で作業する場合、小脳は4%パラアルデヒド中で長期間保存することが可能です。パラアルデヒド溶液をゆっくりと捨て、高濃度固定液に交換します。

小脳と固定液が入ったチューブをムターターに設置し、6〜8時間緩やかに揺らして回転させます。インキュベーション時間が経過した後、濃縮固定液を捨て、濃縮漂白剤に交換します。小脳をこの溶液に入れ、4°Cで一晩インキュベートし、翌日に再び回転させます。

チューブ内の溶液を100% methanolに交換します。チューブをムタター（mutator）に設置し、室温で30分間緩やかに振盪させます。インキュベーション時間が経過した後、溶液を新しい100% methanolに交換し、再度インキュベーションを行い、小脳の脱水処理を確実に行います。

次に、チューブをドライアイスを入れた容器に置き、100% methanol中で組織を30分間凍結させ、凍結融解を行います。その後、ピンセットでチューブをドライアイスから取り出し、ベンチトップに置いて15分間融解させます。染色液の浸透を高めるため、この凍結融解の手順を少なくとも4回繰り返します。

最後の融解後、チューブを-80°Cのフリーザーに一晩保存します。組織は、凍結融解ステップの直前または直後であれば、-80°Cで長期間保存することが可能です。それ以外の場合は、プロトコルを続行してください。

翌日、小脳を50%メタノール/50%PBS、15%メタノール/85%PBS、次いで100%PBSの順に浸し、室温でそれぞれ60～90分間、ロッキングしながら再水和させます。次に、成マウスの小脳組織の場合、PBSに溶解した10 µg/mLのプロテアーゼKを用い、室温で2～3分間、ロッキングしながら酵素消化を行います。

この消化ステップは、P5以下のマウスの小脳では不要です。消化後、過剰な消化を防ぐため、直ちにプロテイナーゼKを捨て、小脳をPBSで10分間ずつ3回洗浄します。最後の洗浄後、溶液をPBS-MTおよびROCKに交換し、翌日の組織ブロッキングに向けて4°Cで一晩静置します。

PBSMTブロッキング溶液を捨て、PBSMTで希釈し5% DMSOを添加した一次抗体中で、4℃で48時間、ロッキングしながら組織をインキュベートします。インキュベーション時間が経過した後、結合していない一次抗体を除去するため、4℃でロッキングしながら、PBSMTで2〜3時間×2〜3回の洗浄を小脳に行います。

その後、組織を5% DMSOを含むPBSMT溶液中の二次抗体で、4°Cにて一晩インキュベートします。翌日、緩慢に揺らしながら、前述と同様に小脳をPBSMTで洗浄します。最後に、4°Cで緩慢に揺らしながら、PBTで1〜2時間最終洗浄を行います。

この工程で過剰なミルクを除去し、染色の鮮明さを向上させます。最後に、組織をDAB溶液中でインキュベートします。最適な染色強度に達するまで、DABは暗所で用いるのが最適です。

光によって発色剤が沈殿し、背景染色が増加する可能性があるため注意してください。最適な染色強度に達すると、10分以内に褐色の反応生成物が明確に視認できるようになります。小脳を0.4%アジ化ナトリウムを含むPBSに入れ、反応を停止させます。

組織はこの溶液で長期保存することが可能です。ホールマウント染色した組織は、PBSまたは最適な屈折率が得られる他の媒体に浸した状態でイメージングしてください。イメージング時にホールマウント試料を容易に固定するために、プラスチック製のペトリ皿で1%アガロースゲルを作成します。

次に、ゲルに小さな穴を開け、そこに小脳をイメージングに最適な方向で固定し、小脳をPBSで覆います。これで、染色された組織を光学顕微鏡でイメージングする準備が整いました。ZEIN two Adelaide c.

免疫組織化学染色により、小脳の横断切片における矢状帯が明らかになります。図中にはlabials 4、5、および3がラベル付けされています。方向確認のため、スケールバーは500 micronsを示しています。

ZEIN 2。AdelaideのCは、kinji細胞のsataおよび樹状突起のサブセットにのみ発現しています。この画像において、スケールバーは150 micronsを表しています。

この画像は、zein twoで染色された小脳のホールマウント標本であり、小脳の前帯、中央帯、後帯の画像においてプルキンエ細胞の縞状配列を示しています。ローマ数字は小脳小葉を表します。LSはlobulus simplexです。

PMLはparamedian labialを指します。COPはcopular parametersおよびラベルを示しています。Crust oneとcrust twoは2つの半球LOEの名称を表し、P oneおよびP threeの呼称は、特定のBR twoストライプを示すために使用される標準的な命名法に基づいています。

詳細については、Sillitoe and Hawks 2002をご参照ください。スケールバーは1 mmを示しています。ここでは、小脳をコカインおよびアンフェタミン調節転写産物ペプチドに対する抗体で免疫染色しています。

確認することができます。この細胞は、PCLとラベル付けされたプルキニエ細胞層を通過し、mlとラベル付けされた分子層で終止する登攀線維のサブセットにおいて発現しています。ここで、スケールバーは100 micronsを表しています。

この画像から、陽性繊維が小脳皮質の分子層において、PFLおよびflと表記された領域を含む、ビキニ細胞樹状突起のストライプを投射していることがわかります。この操作を行う際は、小脳に切り傷をつけないよう注意することが重要です。外部に損傷が生じると、複雑な染色パターンの視認性が損なわれます。

このビデオを視聴することで、無傷の脳内において、ニューロンおよびそれらに接触する繊維における遺伝子発現の複雑で興味深いパターンを明らかにする方法について、十分に理解できるはずです。