Name: 複雑な脳の地形を明らかにするためWholemount免疫組織化学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶホールマウント免疫組織化学法による小脳の三次元遺伝子発現パターン可視化。組織切片法とは異なり再構成不要で複雑な脳地形を明らかにし、神経回路の構造理解に貢献する革新的な神経科学研究手法です。

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RVSはイェシーバー大学のアルバート·アインシュタイン医科大学からのスタートアップ資金を新たな捜査官でサポートされています。

1。動物の灌流および小脳の解剖<ol><li>蛋白質に応じて、灌流が成功した染色1,2のために不可欠である可能性があります。経心臓的に灌流は麻酔薬の適切な使用を必要とする侵襲的、非生存の手順です。正しいトレーニング、制度の承認、およびIACUC承認はすべての手順を実行する前に必要です。それは、常に実験的な要件を識別し、適切なトレーニングを取得するにヘルプを表示するには、金融機関の獣医師に相談することをお勧めします。手順の前に、動物は、深く麻酔し、そのような足や尾のピンチのような刺激に応答しない必要があります。を使用してはさみで腹部の皮膚や筋肉の壁にカットを作成し、次にそれぞれの側で胸骨に隣接して切断することによって胸郭を開き続けています。さらに、実験者は横隔膜を囲む筋膜を切断することにより大容量の内部作業スペースを作成することができます。腹部と胸壁スペリオを持ち上げることによってRLY、心臓は現在公開されます。流出するとすぐに左心室に灌流針を挿入するための血液を可能にするために右心房に小さなカットを行います。基本的な水圧ポンプ（詳細については、 表1を参照）灌流ソリューションを提供することが好ましい。最初に、0.1Mリン酸と血液を洗い流す流体を明確に実行されるまで（PBS、 表3を参照）緩衝生理食塩水。次に、水圧ポンプをオフにしてすぐにPBSで希釈した4％パラホルムアルデヒドのコンテナ（PFA、 表3を参照）へのソリューション提供チューブを切り替えて固定を提供するために戻ってポンプを回します。ポンプの使用は必要ありません：実際に、PBSおよび4％PFAで満たされた2つのシリンジは徐々にソリューションを提供するために使用することができます。 </li><li>それは慎重に組織に任意の病変を導入することなく、頭蓋骨の脳を解剖することが重要です。解剖時の脳に小さな裂傷が徐々に目に見える岩の割れ目に展開されているトラップは、抗体と組織の処理（ 図2、例えば赤色のアスタリスク）の間に人為的な染色の原因となります。小脳の解剖のために、それは頭の真ん中に皮膚を切って、ゆっくり頭蓋骨を露出させるフラップを離れてからかうように典型的である。背側正中線に沿って、また横方向に頭蓋骨の両側に沿って前方へ後から頭蓋骨を切り取ります。これは小脳をニッキングの危険性を実行時にブレグマを超えて切断しないでください。鉗子を使用すると、そっと離れて髄膜に接続されている脳組織を離れて引き裂くないように注意して脳から頭蓋骨の前部を持ち上げます。脳の腹側の脳神経を切断する。 </li><li>脳の残りの部分から小脳の分離は、2つの理由から重要です。まず、in situでの丘で、ビューから隠されている前葉における発現パターンの探査が可能になります。二つ目は小さく、孤立した領域に組織を分離するmに対してできることですいくつかのタンパク質の染色を容易にすることができる鉱石を完全に固定。この最後の解剖ステップを通して、ケアは鉗子の先端を小脳に触れないように注意する必要があります。スーペリア、下丘の中央に鉗子のペアの先端を挿入します。鉗子の2番目のセットでゆっくりと小脳から下丘を離れていじめる。次に、その前方側がダウンして直面していると脳幹が上向きになるように小脳を置きます。脳幹と小脳の小葉IX / Xの間に第四脳室に鉗子を挿入します。両側に鉗子でつまんで柄をカットして、そっと離れて脳幹から小脳を持ち​​上げます。小脳が分離された後、24〜48時間の最低4℃で4％PFAに浸漬することにより、それをポスト修正。小脳は、長時間の4％PFAに格納することができます。髄膜の前または発現パターンの視認性のために染色後のいずれかを削除する必要があります。実験では、小脳が処理中にニックれることを強い可能性がある染色する前に、髄膜を除去するために選択した場合。彼らは弱いバックグラウンド染色を取得し、後処理虚弱になった後見つけることが容易になるので、染色手順の最後に離れて髄膜を剥離することがはるかに簡単です。 </li></ol> 2。 Wholemount染色のための組織を処理する wholemount染色のアプローチは、組織切片の免疫組織化学染色よりも長い時間がかかるので、（ 表2）提供されるサンプルカレンダーに示すように各実験のためにタイムラインを計画しておくと便利です。開始する前に、心に留めておくべきいくつかの重要なものがあります。 1）組織を含むマイクロチューブは、凍結/融解プロセス中を除いて、すべての回でnutator上で回転させなければなりません。 2）いくつかのソリューションは、（溶液のレシピについては、 表3を参照）、各実験のために新鮮行わなければなりません。 3）プロトコルを通じて、ソリューションを変更したときに、優しく小脳に触れないようにではなく、鉗子で小脳を除去するよりも過ごしたソリューションを注ぐ。その後、別のコンテナに新しいソリューションを混合した後、穏やかにチューブに新鮮な溶液を追加するには、ピペットを使用しています。 2.1 1日目： <ol class="lalpha"><li> nutatorを穏やかに揺らし6-8時間室温でデントの修正3の小脳を修正します。メタノールは、抗原を破壊するである場合は、抗原の検索メソッドを使用して2.3Aを通して2.1Aステップを置き換えることを検討してください。抗原検索のために使用される熱とバッファは、抗体の浸透のための組織を準備するのに役立ちます。 </li><li>一晩4デントのブリーチ3ブリーチ小脳℃の</li></ol> 2.2 2日目： <ol class="lalpha"><li> 30分ごとに室温で100％メタノールの2回のラウンドで小脳を脱水。 </li><li>その後、件名、ソリューションの浸透を高めるために凍結/融解サイクルを一連の組織。慎重に30分間ドライアイス凍結容器にチューブを配置します。その後、チューブを取り外し、15分のためにベンチに室温で放置します。凍結/解凍の手順を4回（少なくとも）を実行する必要があります。 </li><li>組織の融解最後の後、一晩-80℃の冷凍庫にチューブを配置します。 </li><li>組織は、°C、すぐに凍結/融解のステップの前または後に-80℃で長期間保存することができます。それ以外の場合、プロトコルは継続すべきである。 </li></ol> 2.3 3日目： <ol class="lalpha"><li>室温で60-90分ごとに、50％MeOH/50％PBSで15％MeOH/85％PBS、100％PBS、それを洗浄することにより、小脳を再水和。 </li><li>次に、成体マウス小脳、対象2〜3分間、PBS中の10μg/mlのプロテ​​イナーゼKによる酵素消化に対する組織のために。全く消化ステップは、若い動物の小脳（マウスでP5または以下）のために必要ではありません。長いdigestionが大きな脳のために提案されています。例えば、消化は、霊長類の脳4の5-6分のように高くなる可能性があります。 </li><li>消化後、すぐにプロテイナーゼKを削除するには、室温で10分間ずつPBSで3回小脳を洗う</li><li> 4℃で一晩（ 表3を参照）PMTに組織をブロック℃、それが安価であるので、ミルクパウダーは、しばしばタンパク質の作業のためのブロッキング剤を選択する最初の選択肢であり、効果的にバックグラウンド染色を低減し、通常抗体の結合または抗原へのアクセスを妨げることはありません。実験者は追加コストを認識しておく必要があり、最初の交差反応性免疫グロブリンおよび対雑音比を最適な信号を生成する能力について血清の品質をテストする必要がありますが、動物の血清はまた、使用することができます。 </li></ol> 2.4日4-5： <ol class="lalpha"><li> 4℃（LARGで48時間、5％DMSOを添加した光電子増倍管で希釈した一次抗体で組織をインキュベートER小脳）が増加したインキュベーション時間が必要になります。 </li></ol> 2.5 6日目： <ol class="lalpha"><li>バインドされていない一次抗体を除去するために4℃で2-3時間でPMTごとに小脳に2〜3回洗浄します。 </li><li>その後、4℃、5％DMSO℃で一晩（大きな小脳が増加インキュベーション時間が必要な場合があります）とPMTを含む溶液中で二次抗体で組織をインキュベートします。 </li></ol> 2.6 7日目： <ol class="lalpha"><li> 4℃で2-3時間でPMTごとに小脳に2-3回を洗う</li><li>組織の1-2時間PBT（ 表3を参照）、最終的な洗浄を与えます。このステップでは、過剰な牛乳を除去し、染色の透明性を高めます。 </li><li>最適な染色強度に達するまで、最後に、DAB（3,3 &#39; - ジアミノベンジジン）溶液中で組織をインキュベートします。褐色の反応生成物は約10分以内にはっきりと見えるはずです。光が析出する発色の原因としては、暗闇の中でDABを使用するのが最適ですバックグラウンド染色を増やすことができ、TE、。 </li></ol> 2.7 最適な染色強度に達したときに、0.04％アジ化ナトリウムを含むPBS中で小脳を配置することによって反応を停止します。組織はこのソリューションでは、長期保存することができます。アジ化ナトリウムは、細菌増殖の強力な阻害剤であるが、それはまた、西洋ワサビペルオキシダーゼを阻害するとして、このステップまでは避けるべきである。 2.8オプションの増幅の手順： 通常のプロトコルに従うが、これらの手順は、上記の手順2.5B-2.7の代わりに実行する必要があります。 <ol class="lalpha"><li> 4℃で一晩組織をインキュベート℃、5％DMSOとPBSTでビオチン標識二次抗体のC（ 表3を参照）。 </li><li> 2〜3時間室温でPBST 3-4変化の各組織を洗浄します。 </li><li> 4℃で一晩小脳をインキュベートPBSTでABC複雑なソリューションのC。 </li><li>で2-3時間ごとに組織をすすぐPBSの3-4の変化で室温。 </li><li>上記のように、新たに調製したDAB溶液中で組織をインキュベートします。 </li><li>染色が最適である場合には、0.04％アジ化ナトリウムを含むPBSで小脳を洗浄することにより反応を停止します。 </li></ol> 3。イメージング染色された組織<ol><li> Wholemount画像を使用してキャプチャすることができ、例えば、ライカDFC3000 FXカメラは、ライカアプリケーションスイートFXソフトウェアを実行しているライカMZ16 FAの実体顕微鏡に取り付けられた。必要に応じて、デコンボリューション顕微鏡は、各画像が鮮明な焦点にのみ、単一の小葉を持つことに、別の焦点面に複数の連続した​​画像を取得するために使用することができます。次に、画像は歪みを除去するためにレンダリングされた単一のスタックとソフトウェアに圧縮することができます。最終的な合成画像は、明確な焦点で表示されているすべてのパターニングと小脳の表面発現パターンを説明します。 </li><li> PBS（または与える別の媒体に浸漬しながらWholemount染色された組織を撮像する必要があります最適な屈折率）。簡単にイメージングのためのwholemountを配置するために、プラスチック製のシャーレに1％寒天ゲルを作る。ゲルに小さな穴をカットします。穴は、小脳が所望の向きに挟まれるようになります。 </li><li>生データは、Adobe Photoshop CS4にインポートして、コントラストと明るさのレベルに調整されます。 </li></ol>動物すべての動物実験は医学のアルバートアインシュタイン大学の制度のガイドラインに従って承認されたIACUC動物のプロトコルの下で行われた。男性と女性の非近交系スイスウェブスター（タコ、アルバニー、NY）マウス我々のコロニーで維持され、すべての試験に用いた。安楽死させた成体ラットは、親切に博士Bryenヨルダン（アルバート·アインシュタイン医科大学）によって提供されていました。すべての動物は、少なくとも1ヶ月であった。 4。代表的な結果小脳は、4つの横のゾーンに分子の発現によって区画されています。前方のゾーン（A〜Z：〜葉IV）、中央ゾーン（CZ：〜葉VI-VII）、後方ゾーン（PZ：〜葉VIII-背IX）と結節ゾーン（NZ：〜葉IX腹とX 5）。各ゾーンには、矢状ストライプ1,2,5,6（ 図1）のユニークな配列が含まれています。プルキンエ細胞におけるZebrinII式では、AZとPZ（ 図2）とCZとNZ（ 図2）の均一な発現のストライプを明らかにする。プルキンエ細胞の矢状組織は求心性線維の末端フィールドの地形によってミラー化されます。コカインとアンフェタミン調節転写産物（CART）のペプチドは、登山繊維（ 図3a）のサブセットに発現していることが小脳皮質7（ 図3b）の分子層におけるプルキンエ細胞の樹状突起のストライプのプロジェクト。このような増幅7のような適切な変更と共に、wholemountプロトコルは旧姓なく、オリーブ小脳のパターンの可視化を可能にする染色組織切片（ 図3b）から骨の折れる、時間のかかる再構成のためのD。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig1.jpg" /> 図1：A. ZebrinII / aldolaseC式では、小脳の横断面における矢状バンドを明らかにする。スケールバー= 500μmである。B. ZebrinII / aldolaseCは、プルキンエ細胞の細胞体と樹状突起で排他的に発現している。スケールバー=150μmの（GL =顆粒層、PCL =プルキンエ細胞層、ML =分子層）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig2.jpg" /> 図2。ZebrinII / aldolaseCが前方（AZ）、中央（CZ）、小脳の後部（PZ）のゾーンの画像にプルキンエ細胞のストライプを表示するために染色wholemount小脳。ここで我々はまた、小脳をニッキングの負の結果の例を示します。得られた人工染色が示されている赤いアスタリスク（*）である。スケールバー= 1ミリメートル（LS =単小葉、PML =傍小葉、COP =コピュラpyramidis）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig3.jpg" /> 図3 A. CARTは、分子層の光ファイバ端末の登山で表されます。スケールバー= 100μmである。（ML =分子層、PCL =プルキンエ細胞層、GL =顆粒層）NZでCARTの発現B. Wholemount免疫組織化学。スケールバー= 2ミリメートル（COP =コピュラpyramidis、PML =傍小葉、PFL = paraflocculus、FL =片葉）。

<ol><li>Sillitoe, R. V., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+Immunohistochemistry%3A+A+high-throughput+screen+for+patterning+defects+in+the+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).</li>
<li>Kim, S. -H., Che, P., Chung, S. -H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Mount+Immunohistochemistry+of+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Whole-Mount Immunohistochemistry of the Brain.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (2006).</li>
<li>Dent, J. A., Polson, A. G., Klymkowsky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-mount+immunocytochemical+analysis+of+the+expression+of+the+intermediate+filament+protein+vimentin+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus.</a> Development. 105, 61-74 (1989).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Malz, C. R., Rockland, K., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+compartmentation+of+the+primate+and+tree+shrew+cerebellum%3A+a+common+topography+of+zebrin+II+in+Macaca+mulatta+and+Tupaia+belangeri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Antigenic compartmentation of the primate and tree shrew cerebellum: a common topography of zebrin II in Macaca mulatta and Tupaia belangeri.</a> J. Anat. 204, 257-269 (2004).</li>
<li>Ozol, K., Hayden, J. M., Oberdick, J., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transverse+zones+in+the+vermis+of+the+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transverse zones in the vermis of the mouse cerebellum.</a> J. Comp. Neurol. 412, 95-111 (1999).</li>
<li>Apps, R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+cortical+organization%3A+a+one-map+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).</li>
<li>Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+expression+of+a+cocaine-+and+amphetamine-regulated+transcript+peptide+reveals+complex+circuit+topography+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Patterned expression of a cocaine- and amphetamine-regulated transcript peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex.</a> J. Comp. Neurol. 519, 1781-1796 (2011).</li>
<li>Sarna, J. R., Marzban, H., Watanabe, M., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+stripes+of+phospholipase+Cbeta3+and+Cbeta4+expression+by+Purkinje+cell+subsets+in+the+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Complementary stripes of phospholipase Cbeta3 and Cbeta4 expression by Purkinje cell subsets in the mouse cerebellum.</a> J. Comp. Neurol. 496, 303-313 (2006).</li>
<li>Demilly, A., Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilament+heavy+chain+expression+reveals+a+unique+parasagittal+stripe+topography+in+the+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Neurofilament heavy chain expression reveals a unique parasagittal stripe topography in the mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 10, 409-421 (2011).</li>
<li>Larouche, M., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+clusters+to+stripes%3A+the+developmental+origins+of+adult+cerebellar+compartmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">From clusters to stripes: the developmental origins of adult cerebellar compartmentation.</a> Cerebellum. 5, 77-88 (2006).</li>
<li>Marzban, H., Chung, S., Watanabe, M., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+Cbeta4+expression+reveals+the+continuity+of+cerebellar+topography+through+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Phospholipase Cbeta4 expression reveals the continuity of cerebellar topography through development.</a> J. Comp. Neurol. 502, 857-871 (2007).</li>
<li>Blank, M. C., Grinberg, I., Aryee, E., Laliberte, C., Chizhikov, V. V., Henkelman, R. M., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+developmental+programs+are+altered+by+loss+of+Zic1+and+Zic4+to+cause+Dandy-Walker+malformation+cerebellar+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multiple developmental programs are altered by loss of Zic1 and Zic4 to cause Dandy-Walker malformation cerebellar pathogenesis.</a> Development. 138, 1207-1216 (2011).</li>
<li>Sawada, K., Sakata-Haga, H., Fukui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating+array+of+tyrosine+hydroxylase+and+heat+shock+protein+25+immunopositive+Purkinje+cell+stripes+in+zebrin+II-defined+transverse+zone+of+the+cerebellum+of+rolling+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nagoya.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Alternating array of tyrosine hydroxylase and heat shock protein 25 immunopositive Purkinje cell stripes in zebrin II-defined transverse zone of the cerebellum of rolling mouse.</a> Nagoya. Brain Res. 1343, 46-53 (2010).</li>
<li>Sawada, K., Fukui, Y., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+distribution+of+corticotropin-releasing+factor+immunopositive+climbing+fibers+in+the+mouse+cerebellum%3A+Analysis+by+whole+mount+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial distribution of corticotropin-releasing factor immunopositive climbing fibers in the mouse cerebellum: Analysis by whole mount immunohistochemistry.</a> Brain Res. 1222, 106-117 (2008).</li>
<li>Marzban, H., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+architecture+of+the+posterior+zone+of+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">On the architecture of the posterior zone of the cerebellum.</a> Cerebellum. 10, 422-434 (2011).</li>
<li>Pakan, J. M., Graham, D. J., Wylie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+visual+mossy+fiber+projections+and+zebrin+expression+in+the+pigeon+vestibulocerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Organization of visual mossy fiber projections and zebrin expression in the pigeon vestibulocerebellum.</a> J. Comp. Neurol. 518, 175-198 (2010).</li>
<li>Iwaniuk, A. N., Marzban, H., Pakan, J. M., Watanabe, M., Hawkes, R., Wylie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+the+cerebellar+cortex+of+hummingbirds+%28Aves%3A+Trochilidae%29+revealed+by+the+expression+of+zebrin+II+and+phospholipase+C+beta+4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of the cerebellar cortex of hummingbirds (Aves: Trochilidae) revealed by the expression of zebrin II and phospholipase C beta 4.</a> J. Chem. Neuroanat. 37, 55-63 (2009).</li>
<li>Sarna, J. R., Larouche, M., Marzban, H., Sillitoe, R. V., Rancourt, D. E., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Purkinje+cell+degeneration+in+mouse+models+of+Niemann-Pick+type+C+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Patterned Purkinje cell degeneration in mouse models of Niemann-Pick type C disease.</a> J. Comp. Neurol. 456, 279-291 (2003).</li>
<li>Sarna, J. R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Purkinje+cell+loss+in+the+ataxic+sticky+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterned Purkinje cell loss in the ataxic sticky mouse.</a> Eur. J. Neurosci. 34, 79-86 (2011).</li>
<li>El-Bizri, N., Guignabert, C., Wang, L., Cheng, A., Stankunas, K., Chang, C. P., Mishina, Y., Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SM22alpha-targeted+deletion+of+bone+morphogenetic+protein+receptor+1A+in+mice+impairs+cardiac+and+vascular+development%2C+and+influences+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">SM22alpha-targeted deletion of bone morphogenetic protein receptor 1A in mice impairs cardiac and vascular development, and influences organogenesis.</a> Development. 135, 2981-2991 (2008).</li>
<li>Mondrinos, M. J., Koutzaki, S., Lelkes, P. I., Finck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-engineered+model+of+fetal+distal+lung+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A tissue-engineered model of fetal distal lung tissue.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, 639-650 (2007).</li>
<li>Coppola, E., Rallu, M., Richard, J., Dufour, S., Riethmacher, D., Guillemot, F., Goridis, C., Brunet, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epibranchial+ganglia+orchestrate+the+development+of+the+cranial+neurogenic+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epibranchial ganglia orchestrate the development of the cranial neurogenic crest.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 107, 2066-2071 (2010).</li>
<li>Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+guidance+of+embryonic+corneal+innervation%3A+roles+of+Semaphorin3A+and+Slit2%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental guidance of embryonic corneal innervation: roles of Semaphorin3A and Slit2.</a> Dev. Biol. 344, 172-184 (2010).</li>
<li>Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+mapping+of+afferent+topography+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions.</a> Brain Struct. Funct. 216, 159-169 (2011).</li>
<li>Davis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemistry.</a> Methods Enzymol. 225, 502-516 (1993).</li>
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我々は、開示することは何もありません。

我々の開発および成人の脳内タンパク質の発現を明らかにするための多彩な免疫組織化学的アプローチを用いて成功したwholemount染色するために必要な技術的な詳細を説明してきました。このアプローチを使用することにより、複雑な分子の発現パターンを解析することができ、脳の地形は、手間と時間がかかり、組織切片の手順を必要とせずに感謝しています。 このプロトコルは、大人の1,2,8,9と早期生後マウスの小脳10,11,12の両方で、いくつかのプルキンエ細胞タンパク質発現のパターンを明らかにするために使用されています。当社独自の研究はまた、顆粒細胞抗原の発現1〜250μmの顆粒層の軟膜表面下に存在する順向性にトレースされた苔状繊維2を調べるためのwholemountアプローチの有用性を実証した。さらに、いくつかの研究は、タンパク質の正常な染色のためにオリジナルのプロトコルに変更を加えたIn個のプルキンエ細胞1,13（抗原検索）と求心性線維7,14（信号の増幅; <...

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料 </td><td> プロトコルの機能 </td></tr><tr><td>灌流ポンプ（フィッシャーScientific/13-876-2） </td><td>一貫性のあるゆっくりと血流を可能にします。 </td></tr><tr><td>鋭い先端はさみ（FST/14081-08） </td><td>潅流および解剖の一般的な使用。 </td></tr><tr><td>鈍先端鉗子（FST/91100-12） </td><td>灌流針を挿入するための心を安定させます。 </td></tr><tr><td>鉗子（デュモンAA/11210-10によってFST） </td><td>頭蓋骨から脳の解剖時に使用するために、脳の残りの部分から小脳を分離する。彼らは解剖時の小脳へのダメージを最小限に抑えることが少し丸みのヒントを持っているので、これらは不可欠です。 </td></tr><tr><td> Nutator（フィッシャーサイエンティフィック） </td><td>潜伏期間中に運動を組織を維持するために使用されます。 </td></tr><tr><td> 1.5 mlチューブ（ザルスタット/スクリューキャップマイクロチューブ） </td><td>彼のすべてのステップtochemistryプロトコルは、これらのマイクロチューブで行われます。丸い底は小脳が運動に留まることが保証されます。 </td></tr><tr><td>穴あきスプーン（FST/10370-17） </td><td>穏やかに過ごしたソリューションをデカントしながらマイクロチューブにwholemountsを維持するために使用されます。 </td></tr><tr><td>ライカMZ16 FA顕微鏡</td><td> wholemount染色を調べるために使用されます。 </td></tr><tr><td>ライカDFC3000 FXカメラ</td><td> wholemount画像をキャプチャするために使用されます。 </td></tr></tbody></table> 表1。 <table border="1"><tbody><tr><td colspan="9"> 典型的なwholemount実験例のカレンダー </td></tr><tr><td> 1日目</td><td colspan="4">デントの修正、室温、8時間</td><td colspan="4">デントの漂白剤、4℃、一晩</td></tr><tr><td> 2日目</td><td colspan="3"> 100パーセントメタノール、室温、2倍、30分ごとに</td><td colspan="3"> 100％メタノール、凍結/融解、 4X、30 min/15分</td><td colspa<html> N = &quot;2&quot;&gt; 100％メタノール、-80℃、一晩</td></tr><tr><td> 3日目</td><td> 50パーセントMeOH/50％PBS、室温、60から90分</td><td colspan="2"> 15パーセントメタノール/ 85％PBS、室温、60から90分</td><td colspan="2"> 100パーセントPBS、室温、60から90分</td><td> PBSで10μg/mlのプロテ​​イナーゼK、室温、2〜3分</td><td> 3倍の100パーセントPBS、室温、10分ごとに</td><td> PMT、4℃、一晩</td></tr><tr><td>日4月5日</td><td colspan="8"> PMT + 1°抗体+ 5％DMSO、4℃、48時間</td></tr><tr><td> 6日目</td><td colspan="3"> PMT、4℃、2〜3倍、2〜3時間ごと</td><td colspan="5"> PMT + 2°抗体+ 5％DMSO、4℃、24時間（またはABC複合体を増幅ステップを始める） </td></tr><tr><td> 7日目</td><td colspan="2"> PMT、4℃、2〜3倍、2〜3時間ごと</td><td colspan="3"> PBT、室温、2時間</td><td colspan="3">最適な染色で可視化されるまで、PBS中の新鮮なDABでインキュベート</td></tr></tbody></table>_content &quot;&gt; 表2。 <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> レシピは （* =たびに新鮮な準備） </td></tr><tr><td> PBS（リン酸緩衝生理食塩水） </td><td> 0.1Mリン酸は、脱イオン水で緩衝化生理食塩水。 pHは7.2（シグマ錠剤; P4417） </td></tr><tr><td> PFA（パラホルムアルデヒド） </td><td>行われ、格納されて、ワーキング溶液をPBS中4％に希釈し、20％溶液として凍結して（; T353フィッシャーサイエンティフィック） </td></tr><tr><td>デントの固定液3 * </td><td> 4部のメタノール 1部のジメチルスルホキシド（DMSO、フィッシャーサイエンティフィック、D159-4） </td></tr><tr><td>デントのブリーチ3 * </td><td> 4部のメタノール 1部のジメチルスルホキシド（DMSO、フィッシャーサイエンティフィック、D159-4） 1部の30％過酸化水素</td></tr><tr><td>酵素消化</td><td> PBS中で、Proteinase Kを10μg/ mlの（03115828001ロシュ·ダイアグノスティックス）。 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> PBSを含む： 0.1％ツイーン20（FisheR·サイエンティフィック、BP337、トリトンは、すべてのインスタンスにTween-20を代わりに使用することもできます）。 </td></tr><tr><td> PMT 25 * </td><td> PBSを含む： 2パーセント無脂肪のスキムミルク粉末（カーネーションが望ましい） 0.1％ツイーン20（フィッシャーサイエンティフィック、BP337） </td></tr><tr><td> PBT 25 * </td><td> PBSを含む： 0.2％ウシ血清アルブミン（シグマ社製; B9001S） 0.1％ツイーン20（フィッシャーサイエンティフィック、BP337） </td></tr><tr><td> DAB * </td><td> PBSの40mlに、3,3 - ジアミノベンジジンの1つの10 mg錠（D5905 Sigma-Aldrich社）を溶解する。 ）反応を開始する30％の過酸化水素10μlを加えて下さい。 </td></tr><tr><td> ABC複雑なソリューション</td><td>ベクタステインキット（ベクターラボラトリーズ社、PK-4000） </td></tr></tbody></table> 表3。

複雑な脳の地形を明らかにするためwholemount免疫組織化学

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

小脳の繰り返し、十分に理解細胞のアーキテクチャでは、脳の地形を探索するのに理想的なモデルシステムを確認します。比較的均一な細胞構築の基礎となると、遺伝子およびタンパク質発現の矢ドメインの複雑な配列です。小脳の分子区画は、求心性線維の解剖学的および機能的な組織によってミラーリングされています。完全に小脳組織の複雑さを理解するために我々は、以前はマウス小脳におけるパターン欠陥のハイスループット分析のためのwholemount染色アプローチを洗練された。このプロトコルは、詳細で正常にwholemount免疫染色を用いて成体マウス小脳におけるタンパク質の発現パターンを明らかにするために有用である試薬、ツール、および実用的な手順について説明します。手順はここで脳の微細な地形は、そのに明らかにすることができる方法の例としてzebrinII / aldolaseCの式を使用してこの方法の有用性を示す強調表示されたネイティブの三次元立体配座。についても説明し、分子の地形の比較研究のための求心性の予測および大型小脳におけるタンパク質発現の可視化を可能にするプロトコルへの適応があります。これらのアプリケーションを説明するために、ラット小脳の求心性染色からのデータが含まれています。

神経回路は、地形的に特定の分子プロファイルを持つ機能的なコンパートメントに編成されています。ここでは、多彩なwholemount免疫組織化学的染色のアプローチを使用してグローバル脳の地形を明らかにするための実用的かつ技術的な手順を提供しています。我々はよく理解され細胞構築、小脳の回路を用いる方法の有用性を示しています。

複雑な脳の地形を明らかにするためWholemount免疫組織化学

小脳の反復的で十分に解明された細胞構築は、脳のトポグラフィーを探索するための理想的なモデルシステムとなっています。その基盤となる...

本手順の全体的な目的は、完全な脳構造全体における遺伝子発現の複雑なパターンを明らかにすることです。まず、動物に灌流を行い、脳を摘出します。次に、小脳を解剖し、ホールマウント染色プロトコルを用いて処理します。最終ステップは、組織化学的呈色反応を用いて遺伝子発現を可視化することです。最終的に、明視野顕微鏡を用いて表面の遺伝子発現パターンを撮影します。組織切片の免疫組織化学などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、再構築の必要なく、複雑なパターンを三次元的に可視化できることです。手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるJoshua Whiteです。動物を安楽死させ、頭蓋骨から脳を取り出した後、まずピンセットの先を上胼胝体と下胼胝体の中間に挿入し、小脳を脳の他の部分から分離します。次に、もう一本のピンセットを使用して、胼胝体と皮質を小脳からゆっくりと剥離させます。小脳の前側が下を向き、脳幹が上を向くように配置します。次に、脳幹と小脳の第9および第10葉の間に、ピンセットを第四脳室に挿入します。ピンセットで両側を挟んで脚を切断し、小脳を脳幹から慎重に持ち上げて分離させます。小脳を4%パラアルデヒドに浸し、4°Cで最低24時間から48時間後固定します。ドラフトチャンバー内で作業する場合、小脳は4%パラアルデヒド中で長期間保存することが可能です。パラアルデヒド溶液をゆっくりと捨て、高濃度固定液に交換します。小脳と固定液が入ったチューブをムターターに設置し、6〜8時間緩やかに揺らして回転させます。インキュベーション時間が経過した後、濃縮固定液を捨て、濃縮漂白剤に交換します。小脳をこの溶液に入れ、4°Cで一晩インキュベートし、翌日に再び回転させます。チューブ内の溶液を100% methanolに交換します。チューブをムタター（mutator）に設置し、室温で30分間緩やかに振盪させます。インキュベーション時間が経過した後、溶液を新しい100% methanolに交換し、再度インキュベーションを行い、小脳の脱水処理を確実に行います。次に、チューブをドライアイスを入れた容器に置き、100% methanol中で組織を30分間凍結させ、凍結融解を行います。その後、ピンセットでチューブをドライアイスから取り出し、ベンチトップに置いて15分間融解させます。染色液の浸透を高めるため、この凍結融解の手順を少なくとも4回繰り返します。最後の融解後、チューブを-80°Cのフリーザーに一晩保存します。組織は、凍結融解ステップの直前または直後であれば、-80°Cで長期間保存することが可能です。それ以外の場合は、プロトコルを続行してください。翌日、小脳を50%メタノール/50%PBS、15%メタノール/85%PBS、次いで100%PBSの順に浸し、室温でそれぞれ60～90分間、ロッキングしながら再水和させます。次に、成マウスの小脳組織の場合、PBSに溶解した10 µg/mLのプロテアーゼKを用い、室温で2～3分間、ロッキングしながら酵素消化を行います。この消化ステップは、P5以下のマウスの小脳では不要です。消化後、過剰な消化を防ぐため、直ちにプロテイナーゼKを捨て、小脳をPBSで10分間ずつ3回洗浄します。最後の洗浄後、溶液をPBS-MTおよびROCKに交換し、翌日の組織ブロッキングに向けて4°Cで一晩静置します。PBSMTブロッキング溶液を捨て、PBSMTで希釈し5% DMSOを添加した一次抗体中で、4℃で48時間、ロッキングしながら組織をインキュベートします。インキュベーション時間が経過した後、結合していない一次抗体を除去するため、4℃でロッキングしながら、PBSMTで2〜3時間×2〜3回の洗浄を小脳に行います。その後、組織を5% DMSOを含むPBSMT溶液中の二次抗体で、4°Cにて一晩インキュベートします。翌日、緩慢に揺らしながら、前述と同様に小脳をPBSMTで洗浄します。最後に、4°Cで緩慢に揺らしながら、PBTで1〜2時間最終洗浄を行います。この工程で過剰なミルクを除去し、染色の鮮明さを向上させます。最後に、組織をDAB溶液中でインキュベートします。最適な染色強度に達するまで、DABは暗所で用いるのが最適です。光によって発色剤が沈殿し、背景染色が増加する可能性があるため注意してください。最適な染色強度に達すると、10分以内に褐色の反応生成物が明確に視認できるようになります。小脳を0.4%アジ化ナトリウムを含むPBSに入れ、反応を停止させます。組織はこの溶液で長期保存することが可能です。ホールマウント染色した組織は、PBSまたは最適な屈折率が得られる他の媒体に浸した状態でイメージングしてください。イメージング時にホールマウント試料を容易に固定するために、プラスチック製のペトリ皿で1%アガロースゲルを作成します。次に、ゲルに小さな穴を開け、そこに小脳をイメージングに最適な方向で固定し、小脳をPBSで覆います。これで、染色された組織を光学顕微鏡でイメージングする準備が整いました。ZEIN two Adelaide c.免疫組織化学染色により、小脳の横断切片における矢状帯が明らかになります。図中にはlabials 4、5、および3がラベル付けされています。方向確認のため、スケールバーは500 micronsを示しています。ZEIN 2。AdelaideのCは、kinji細胞のsataおよび樹状突起のサブセットにのみ発現しています。この画像において、スケールバーは150 micronsを表しています。この画像は、zein twoで染色された小脳のホールマウント標本であり、小脳の前帯、中央帯、後帯の画像においてプルキンエ細胞の縞状配列を示しています。ローマ数字は小脳小葉を表します。LSはlobulus simplexです。PMLはparamedian labialを指します。COPはcopular parametersおよびラベルを示しています。Crust oneとcrust twoは2つの半球LOEの名称を表し、P oneおよびP threeの呼称は、特定のBR twoストライプを示すために使用される標準的な命名法に基づいています。詳細については、Sillitoe and Hawks 2002をご参照ください。スケールバーは1 mmを示しています。ここでは、小脳をコカインおよびアンフェタミン調節転写産物ペプチドに対する抗体で免疫染色しています。確認することができます。この細胞は、PCLとラベル付けされたプルキニエ細胞層を通過し、mlとラベル付けされた分子層で終止する登攀線維のサブセットにおいて発現しています。ここで、スケールバーは100 micronsを表しています。この画像から、陽性繊維が小脳皮質の分子層において、PFLおよびflと表記された領域を含む、ビキニ細胞樹状突起のストライプを投射していることがわかります。この操作を行う際は、小脳に切り傷をつけないよう注意することが重要です。外部に損傷が生じると、複雑な染色パターンの視認性が損なわれます。このビデオを視聴することで、無傷の脳内において、ニューロンおよびそれらに接触する繊維における遺伝子発現の複雑で興味深いパターンを明らかにする方法について、十分に理解できるはずです。

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神経科学

全体の霊長類の脳で標的タンパク質の大規模な免疫検出は、任意の時点で複数のフリーフローティングセクションのバッチ染色のための創造的な装置の使用を組み合わせる方法を埋め込み、セクションなどの新たな組織を採用することで可能です。...

全モンキー脳の大規模なタンパク質の検出のためのバッチの免疫染色

我々は、トレーサーを提供するための実用的なガイドを提供...

マルチカラーで神経回路の地形を明らかにし

このビデオでは、一次抗体と二次抗体を使用して、蛍光標識されたアストロサイトによる固定マウス脳組織切片の免疫染色手順と、共焦点顕微鏡で染色されたアストロサイトの画像を取得する手順を示しています。...

マウス脳組織切片における蛍光標識アストロサイトの免疫染色

この記事では、高分解能、蛍光標識したマウスの脳の微細脳解剖と、再構築するための完全な実験手順について説明します。説明されたプロトコルは、試料調製及び清算、画像化、データ後処理およびマルチスケール視覚化のための取付片を備えている。...

共焦点光シート顕微鏡全体マウスの脳のミクロンスケールの分解能光トモ

ここで組織をクリア、蛍光標識と、それによって、大脳新皮質の細胞型の三次元組織の可視化を可能にするマウスの脳組織の大規模なイメージング手順をについて説明します。...

マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

マイクロ ct 画像に基づく法病変を特徴と、小動物の脳に電極を配置

本稿では、MRIによってイメージされた全脳解剖学のマクロ的な空間スケールと、ニューロン分布の顕微鏡空間スケールの2つの空間スケールを橋渡しする3Dスキャン技術を用いて実験的なプロトコルを紹介する。免疫組織化学染色および多電極アレイシステムおよび他の方法(〜10...

3Dスキャニング技術ブリッジングマイクロ回路とマクロスケールの脳画像を3D新規埋め込み重なりプロトコルで

このプロトコルは、IBA1およびTMEM119の免疫蛍光コシャリンのための段階的なワークフローを記述し、ミクログリア密度、分布、および形態の分析に加えて、ならびにマウス脳組織における末梢骨髄細胞浸潤の分析を説明する。...

マウス脳における微小グリア密度、形態および末梢骨髄細胞浸潤解析のためのIBA1およびTMEM119を用いた免疫蛍光染色

フリーフローティング技術により、研究者は固定組織切片で免疫組織化学を含む組織学的ベースの染色を行い、生物学的構造、細胞タイプ、タンパク質の発現と局在を視覚化できます。これは効率的で信頼性の高い組織化学的手法であり、脳、心臓、肝臓などの多数の組織の調査に役立ちます。...

自由浮遊組織切片を用いた組織学的染色

このプロトコルは、灌流、脳切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングを含むマウス脳組織学的研究のための効率的で再現可能なアプローチを記述する。...

マウス脳のフリーフローティング免疫染色

シリアル2光子断層撮影法(STPT)イメージングは、2光子イメージングと自動ステージ制御およびミクロトームスライスを組み合わせて、組織の塊を3次元形状でイメージングする技術です。ここでは、マーモセットの脳がその構造的特徴をよりよく理解するために、それを実装するためのプロトコルについて説明します。...

神経解剖学的解析のためのマーモセット脳全体の連続2光子断層撮影法

学ぶホールマウント免疫組織化学法による小脳の三次元遺伝子発現パターン可視化。組織切片法とは異なり再構成不要で複雑な脳地形を明らかにし、神経回路の構造理解に貢献する革新的な神経科学研究手法です。

複雑な脳の地形を明らかにするためWholemount免疫組織化学

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