代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

本手順の総合的な目的は、細胞周期のキネティクスと進行を測定することです。まず、チミジンの代わりに細胞のDNAに取り込まれるromo、deoxy、ウリジン、またはBRDUを用いて、細胞をパルス・チェイス標識します。その後、BRDUに対する抗体で細胞を免疫染色し、染色直後にフローサイトメトリーで解析します。

S期の細胞のみがラベルされ、ラベルされた細胞は細胞周期を経てG2期へと進みます。これらの細胞は、有糸分裂後に4NのDNA量を持つとして検出されます。その後、DNA量は2Nに減少します。したがって、フローサイトメトリーによって得られた蛍光プロファイルの解析を用いることで、細胞周期進行のキネティクスを決定することが可能です。

化学物質を用いて細胞同期化を行う他のプロトコルと比較した本手法の主な利点は、細胞分裂機構に不測の影響を及ぼす可能性のある生理学的摂動が生じない点にあります。我々が最初にこの手法を採用したのは、化学的同期化を用いて細胞周期の進行速度を研究しようとした際に、解析の妨げとなる予期せぬ結果が得られたときでした。本手法は、細胞生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

例えば、異なる細胞種の間で増殖速度に差が生じる根拠は何でしょうか。これを明らかにするために、まずBRDUを用いて細胞をパルス・チェイス標識します。各タイムポイントにつき1枚の10 centimeterプレートと、以下の各コントロールにつき1枚のプレートを用意し、標識を開始してください。

BRDUのみ、PIのみ、BRDU陰性、PI陰性。各プレートに5 × 10⁵個のMCF-7細胞を添加し、添加剤含有DMEMで播種する。細胞を回復させ、接着させるため、プレートを24〜48時間インキュベートする。細胞が60%コンフルエントに達したら、培地を10 µMを含む新鮮なDMEMに交換する。

BRDUを添加し、細胞を37 °C、5% CO2条件下で1時間インキュベートして、DNAへのBRDU取り込みを行わせます。1時間後に陰性対照または0時間時点として使用するため、1枚のプレートは未処理のままにしておいてください。パルスラベル用培地を除去し、PBSで細胞を軽く洗浄してから、2～8時間の各タイムポイントまで保持します。

新鮮な増殖培地を添加し、インキュベーターに戻します。その後、次セクションで述べる方法に従い、0時間および1時間目のタイムポイントのプレートを直ちに回収します。細胞を回収するために、培地を吸引し、プレートを洗浄します。

まずPBSで洗浄し、次にトリプシンを用いて細胞をプレートから剥離させ、DMEMで回収します。390 ×gで5分間遠心分離し、上清を除去します。その後、1〜5 mLの氷冷PBSで細胞を洗浄し、390 ×gで5分間遠心分離します。遠心後、上清を除去し、細胞を100 µLの氷冷した液で再懸濁します。

1% FBSを含む冷PBSを使用します。FBSは細胞の凝集を防ぐ役割を果たします。この手順において最も重要な点の一つは、回収した細胞から単一細胞懸濁液を確実に調製することです。

事実を確認するためです。これを達成するには、細胞をエタノールに一滴ずつ直接加えてください。これは極めて重要です。次に、細胞を固定するため、ピペットを使用して細胞を5 mLの氷冷した溶液に一滴ずつ加えてください。

15 mLコニカルチューブに70%エタノールを入れます。細胞を氷上で30分間インキュベートするか、4°Cで一晩保存します。このステップは、異なるタイムポイントからのサンプル回収を一時停止させるのに最適であり、サンプルを数日間エタノール中に保持できるため、その後のプロトコルの残りの工程であるBRDUおよびプロピジウムヨード染色を、すべてのサンプルで同時に行うことが可能になります。

4 °Cから細胞を取り出し、90 ×gで5分間、3回遠心分離します。遠心後、固定液の大部分を吸引し、約 50 µLを残します。その後、ボルテックスします。

ボルテックス処理を行いながら、ペレットをほぐしてDNAを変性させます。2N HCl Triton X 100を1 mLゆっくりと滴下し、その後、サンプルを室温で30分間インキュベートします。3,090 ×gで5分間遠心分離して細胞をペレット化し、次に上清を吸引して除去します。

次に、細胞ペレットを1 mLの0.1 M四ホウ酸ナトリウムに再懸濁します。遠心分離後、再び細胞を吸引し、上清を廃棄します。その後、細胞ペレットを75 µLのBRDU染色液に再懸濁します。

室温で45分間、遮光して混合・インキュベートします。前述と同様に遠心分離して細胞をペレット化し、5 µg/mLのプロピジウムヨードを含むPBS 1 mLで細胞ペレットを再懸濁します。PI陽性サンプルをフローサイトメーターで解析する際は、前方散乱光（FSC）対側方散乱光（SSC）のプロットを作成し、細胞のサイズ分布が適切であることを確認してください。

これら両方のパラメータはリニアスケールでプロットしてください。同時に、FL three H 対 FL two W のプロットを表示し、PI染色と蛍光パルス幅を確認します。このプロットを用いてゲートを作成し、細胞周期の正常な分布パターン内にあると考えられる細胞分画を単離します。

一般に、この分布パターンは、PI染色の2Nおよび4NのDNA含量を示す2つの細胞クラスターによって特徴付けられ、これらはそれぞれ細胞周期のG1期とG2期を表しています。これら2つのクラスターの間に位置する一連の細胞は、細胞周期のS期に起こるDNA複製中の細胞を示しています。Y軸にFL1 HまたはFITCを対数スケールで、X軸にPIを線形スケールで表示し、ゲート処理された細胞を示すプロットを作成してください。

このプロットは、各種コントロールを用いて残りのパラメータを設定し、データを収集するために使用します。解析にあたっては、PI単独染色サンプルをフローサイトメーターのローディングポートにセットし、x軸上のG1が約200に位置するようにゲインを調整してください。これは、PI染色のヒストグラムプロットで確認するとより容易に可視化できます。

次に、BRDUのみのサンプルをローディングポートにセットし、測定を開始します。BRDU陽性細胞とBRDU陰性細胞の2つの集団がプロット上に表示されるようにゲインを調整してください。理想的には、BRDU陰性細胞が10¹の直上または直下に位置するようにします。

最後のコントロールは、BrdU/PI陰性サンプルです。この陰性コントロールを実行し、細胞がいずれの上方または右方のクアドラントに現れないことを確認してください。各種プロットのパラメーター設定が完了すれば、フローサイトメーターのキャリブレーションが完了し、BrdUおよびPI染色細胞の処理準備が整ったことになります。各サンプルについて、PIゲートされた細胞から最低10,000個のデータを収集してください。

次に、FlowJoやFACSDivaなどのソフトウェアを用いて、PI対FL2プロットからPI陽性としてゲートした細胞について、FITC対PIのプロットを作成し、細胞周期にある集団を区別します。続いて、2つ目のゲートを作成し、BrdU陽性集団を単離します。

次に、細胞周期進行の時間経過を追跡するため、G1期またはG2期の含有量を持つBrdU陽性細胞数を時間の関数としてプロットし、2つの大腸がん細胞株HT 29とLS 180の間で細胞周期進行のキネティクスを比較します。細胞は、BrdUパルス除去後の8時間にわたり、1時間ごとに回収されました。

2つのプロファイルのキネティクスを比較すると、HT 29細胞株の対応する時点ではこのピークが見られないのに対し、LS 180細胞ではBRDU後t = 4時間でG1期ピークの出現が顕著に認められます。これは、細胞周期のG2期における細胞周期進行の加速を示しています。大腸がん細胞株LS 180において、乳がん細胞株のサイクリングプロファイルを生成するために。

MC7細胞を8時間にわたり1時間ごとに回収しました。BRDUパルス処理後、免疫ラベル化およびDNA対比染色の実施後、細胞を蛍光シグナルに基づいてソートしました。

ここでわかるように、CF seven細胞は、テストした2つの大腸がん細胞株のいずれよりも著しく遅い速度でサイクルしていました。このビデオを視聴することで、タイムポイントでの回収を伴うDNAの代謝標識により、細胞周期キネティクスをどのように追跡できるかについて、十分に理解できたはずです。