単一の卵重亜硫酸塩の突然変異誘発

この手順の全体的な目標は、単一の卵子におけるDNAメチル化を分析することです。これは、最初に採取した卵子から卵丘細胞と石鹸パリタを除去することによって達成されます。2番目のステップは、卵子を2対1のaros溶解溶液に埋め込んで、微量のDNAが失われたり分解されたりするのを防ぐことです。

次に、重亜硫酸塩突然変異誘発が行われ、続いてネストされたポリメラーゼ連鎖反応による増幅が行われます。最後のステップは、PCR産物をライゲーションしてクローニングすることです。その後、クローンを選別し、PCR増幅してシーケンシングに送ります。

最終的に、バイサルファイト突然変異誘発とシーケンシングは、単一の卵子の関心領域のシトシンリン酸ギネまたはCPGジヌクレオチドでのDNAメチル化を示すために使用されます。この手法は、大きな細胞数のバイサルファイト突然変異導入などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、プールサイト、PCRバイアス、および化学療法細胞の汚染なしに、単一の卵子からデータを取得できることです。卵子採取の日には、溶液を作成する際に書かれたプロトコルに記載されている溶液を新たに調製し、手袋を頻繁に交換し、フィルターチップを使用してDNA汚染の可能性を減らし、開いているときはチューブを角度をつけ、使用しないときはすべてのチューブをキャップし直してください。

OSIの採取を開始するには、解剖したマウス卵管をM two培地に入れ、Mプーリーをリッピングして卵丘細胞複合体を抽出します。次に、30マイクロリットルのM二培地液中に0.3ミリグラム/ミリグラムのヒアルロニダーゼ溶液を用いて、卵丘細胞複合体から細胞を分離します。細胞を溶液中に保管するのは、卵丘細胞を長期間さらすと損傷を受ける可能性があるため、卵丘細胞を取り除くのにかかる時間だけです。

卵子を滴から滴に移すことにより、30マイクロリットルのM2培地で卵子を洗浄します。卵丘細胞を定期的に除去し、合計3回の洗浄を行います。酸性チロ溶液を使用してLUCITAのZを除去します。

まず、卵子を30マイクロリットルの溶液1滴に入れ、次に別の30マイクロリットルの溶液に移します。持ち運ばれる媒体は酸を希釈し、その効率を低下させます。長時間の曝露はそれらを損傷する可能性があるため、帯を取り除くのにかかる時間だけ細胞を溶液に保管してください。

帯の除去に続いて、30マイクロリットルのM two培地液で細胞を再度洗浄し、70°Cの熱ブロックに溶解溶液を最初に埋め込むグロスを行います。予熱された低融点(LMP Agros)を溶解溶液に加えると、2対1のAGROS溶解溶液が生成されます。次に、単一の卵子を最小限のM two培地のきれいなスライドガラスの上に置きます。

次のステップは、単一細胞をAgrosおよび溶解液に埋め込むことです。アグロスは摂氏65度未満の温度で硬化するため、これは迅速に行う必要があります。10マイクロリットルのAgros溶解液を顕微鏡下でピペットチップに取ります。

約1マイクロリットル以下のアグロス溶解溶液をスライドガラスに静かに排出し、最小限の媒体と混合できるようにします。卵子をピペットの先端にそっと拾い上げます。次に、10マイクロリットルすべてを300マイクロリットルの鉱油が入ったアイノールチューブに入れて、結果として得られるビーズが球形になるようにします。

チューブを氷上で10分間インキュベートして溶解を行います。300マイクロリットルの鉱油を取り出し、500マイクロリットルのSDS溶解バッファーを追加します。2日目に50°Cに設定した水浴でサンプルを一晩インキュベートします。

書面によるプロトコルに記載されているように、新しいバイサルフィド突然変異誘発溶液を準備します。500マイクロリットルのSDS溶解バッファーを完全に除去することにより、突然変異誘発を開始します。溶解バッファーが残っていると、加熱時にアグロスが希釈され、ビーズが後続のステップで溶解

溶解緩衝液を完全に除去した後、300マイクロリットルの鉱油を加えます。サンプルを摂氏90度のヒートブロックで2分半インキュベートします。カラットを取り、温度を混ぜたり、かき混ぜたり、伸ばしたり、変動させたりします。

2分半後。サンプルを氷上で10分間インキュベートします。変性を行うには、鉱油を除去し、チューブフリックに0.1モルの水酸化ナトリウムを1ミリリットル加え、チューブを5〜6回反転させます。

サンプルを15分間インキュベートします。摂氏37度に設定された水浴で3〜4分ごとに反転すると、ビーズは水酸化ナトリウムに浮かぶはずです。ビーズがチューブの底にないことに注意してください。

亜硫酸塩処理により行うには、まず水酸化ナトリウムを除去した後、チューブを穏やかに回転させます。300マイクロリットルの鉱油と500マイクロリットルのBIS亜硫酸塩溶液を追加します。光にさらされないように注意し、チューブを摂氏50度の水浴中で3時間半インキュベートします。

次に、desinationを実行します。まず、サンプルを氷上で3分間インキュベートしてから、鉱油と亜硫酸ビス溶液を除去します。穏やかに回転させた後、0.3モルの水酸化ナトリウムフリックを1ミリリットル加え、チューブを5〜6回反転させます。

サンプルを15分間インキュベートします。摂氏37度のウォーターバスで3〜4分ごとに反転すると、PCRを開始する前にビーズが水酸化ナトリウムに浮かぶ必要があります。最初に穏やかに回転させてサンプルを洗います。

次に、水酸化ナトリウムを取り除き、1 xte pH 7.5の1ミリリットルを追加します。室温で5〜10分間振とうします。2回目の穏やかなスピンの後、XTEを取り外します。

この洗浄プロセスを2回繰り返します。次に、1ミリリットルのオートクレーブ、二重蒸留水を追加します。室温で5〜10分間振とうし、3回目に静かに回転させて水を取り除きます。

二重蒸留水洗浄を2回繰り返します。最後に、すべての上清を取り除き、アロスビーズだけを残します。上清のpHが5.0であることを確認してください。

上清がまだ塩基性すぎる場合は、ビーズを二重蒸留水で再度洗います。その間、書かれたプロトコルに記載されているように、最初のラウンドPCRミックスをPCRチューブに加えます。ソリッドアグロスピードをアイノアチューブのリップにスライドさせます。

次に、アグロスピードを慎重にPCRチューブに移し、摂氏70度に1分間加熱して混合し、その後増幅することが書かれたプロトコルで提案されています。ファーストラウンド増幅に続いて、ファーストラウンド製品の5マイクロリットルをテンプレートとして使用して、セカンドラウンドPCR反応を調製します。鉱油の層の下に必ずビパを塗ってください。

診断テストとして、テキストの指示に従って2回目の増幅を実行します。セカンドラウンドサンプルは、メチル化または菌株特異的な電気泳動である制限酵素で切断し、8%アクリルアミドゲル上で消化産物を切断することができます。結果として生じる不均一なバンドは、TAクローニングプレートに続いて、このビデオに添付されている原稿で説明されているように、第2ラウンド生成物ライゲーションをベクターにクローニングし、TAクローニングプレートにすべての反応を混合し、アンピシリン、ex gal、およびIPTGを添加し、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートするための複数の配列を表します。

次に、コロニーPCRマスターミックスを、書かれたプロトコルに記載されているPCRチューブに加えます。ピペットチップでプレートから白色細菌コロニーを取り出し、PCRチューブ内で35マイクロリットルのコロニーPCRマスターミックスに渦巻かせます。1.5%AGROSゲル上でPCR産物の4マイクロリットルのPCR増幅電気泳動後のテキストに記載されているように、懸濁液の増幅に進みます。

最後に、細胞あたり5つのコロニーPCRのシーケンシングのために、約30マイクロリットルのPCR産物を送ってください。シーケンシング結果が得られたら、メチル化パターンを読み取ることができます。そのように残った元のシトシングアニンはメチル化されています。逆に、現在チアミングアニンである元のシトシングアニンは、重亜硫酸塩変換プライマーを使用したネストPCR増幅後にメチル化されませんでした。

アロスゲルの個々の中期で正しいフラグメントサイズを視覚化することにより、変換が成功したことを確認できます。2つの卵母細胞は1つの親対立遺伝子を表し、理論的には1つの刻印されたメチル化パターンを持っています。セカンドラウンドPCR産物は、意図しない汚染がないか検査することができます。

DNAメチル化に敏感な制限酵素を使用して、2回目のPCR産物を消化し、メチル化対立遺伝子または非メチル化対立遺伝子が含まれているかどうかを評価できます。ここでは、酵素認識配列内のメチル化シトシンが切断されます。チミンに変換された非メチル化シトシンは、酵素によって認識されなくなり、切断されていない間、メチル化対立遺伝子と非メチル化対立遺伝子の両方を含む2つの卵母細胞サンプルは、ライゲーションおよび形質転換後の卵丘細胞の汚染または極性体封入性を示すため、廃棄する必要があります。

コロニーPCR増幅の成功は、AROSゲル上で可視化し、正しい製品サイズのサンプルをシーケンシングに送ることができます。この例では、ライゲーション後の予想されるアンプリコン サイズは 100 56 塩基対です。ここでは、クローン5のアンプリコンサイズが正しくないため、シーケンシングに送るべきではありません。

中期2個の卵子由来の5つの個々のクローンの配列は、5つの同一のメチル化パターンと同一の非CPG変換率を生成するはずです。複数のパターンを含むサンプルは破棄する必要があります。排卵した中期の2つの細胞は、2つの染色体コピーまたは付着した極性体を持っているため、2つの類似した配列パターンが得られる可能性があります。

メチル化パターンが非常に異なる細胞からは、データを破棄する必要があります。卵丘細胞の汚染を排除できないため、この手順を試みるときは、まず卵母細胞を新鮮な培地で複数回洗浄し、HI IDE処理後にできるだけ多くの卵丘細胞を除去することを覚えておくことが重要です。第二に、低融点のアグロスは摂氏65度未満の温度で硬化するため、慎重かつ迅速に作業してください。

そして最後に、ビス硫酸ナトリウムとハイドロキノンは光に敏感であるため、反応チューブと溶液はホイルで包む必要があります。