Name: 単一の卵重亜硫酸塩の突然変異誘発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: 学ぶ 単一卵細胞におけるDNAメチル化解析プロトコル。ビスルファイト変異誘導とネステッドPCRを用いて、個別の卵細胞からエピジェネティック情報を取得する方法を解説。発生生物学研究に有用です。

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この作品は、ウェスタン·オンタリオ、産科と婦人科の大学によってサポートされていました。とMinistryof研究とイノベーション、初期のリサーチャー賞からの助成金ER06-02-188。 MMDは、再生、早期開発と健康（REDIH）大学院奨学金への影響のCIHRのトレーニングプログラムによってサポートされていました。

<ol><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).</li>
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<li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

この単一の卵母細胞アッセイは重要であり、特別なケアを必要とする数多くの手順が含まれています。最初は卵母細胞の洗浄です。それは、できるだけ多くの卵丘細胞のように削除するヒアルロニダーゼ処理後に廃棄し新鮮な培地に各卵母細胞を複数回洗浄することが特に重要である。また、透明帯を除去するため、酸性タイロード液に卵を転送するときは、周囲の媒体が卵丘細胞の明確であることを確認してください。卵母細胞は、透明帯除去後に非常に粘着性であり、任意の周囲の卵丘細胞は容易に卵母細胞に付着したになることができます。それは帯無卵母細胞に固定されている卵丘細胞を除去することは非常に困難である。このプロトコルは、後の時点で卵丘細胞の汚染を検出することができますが、それは可能性が破棄された卵母細胞の完全なプロトコルを受けるように、建設的、また経済的ではありません。 2番目に重要なステップでは、卵母細胞の埋め込みです。アガロース及びLysで卵母細胞を埋め込むときは、その低融点（LMP）アガロースなり硬化：70℃以下℃の温度でわずかに注意することが重要な解決策をですこのように、我々は最少培地でスライドガラス上の個々の卵...

特定の試薬 ​​や機器のテーブルです。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td colspan="4"> 卵母細胞コレクション </td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>シグマ</td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td>酸性タイロード</td><td>シグマ</td><td> T1788 </td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td>シグマ</td><td> P5568 </td><td></td></tr><tr><td> 10％IGEPAL </td><td> Bioshop </td><td> NON999.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 溶菌液 </td></tr><tr><td>トリス（pH7.5） </td><td> Bioshop </td><td> TRS001.5 </td><td></td></tr><tr><td> LiClを</td><td>シグマ</td><td> L9650 </td><td> ＆n個のBSPは、 </td></tr><tr><td> EDTA pH8.0で</td><td>シグマ</td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> LIDS </td><td> Bioshop </td><td> LDS701.10 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td>インビトロジェン</td><td> P2325 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> SDS溶解バッファー </td></tr><tr><td> TE pH7.5の</td><td> Bioshop（トリス） シグマ（EDTA） </td><td> TRS001.5 E5134 </td><td></td></tr><tr><td> 10％SDS </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Bisulfite変換 </td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S8045 </td><td></td></tr><tr><td>亜硫酸ナトリウム（亜硫酸水素ナトリウム） </td><td>シグマ</td><td> 243973 </td><td>; </td></tr><tr><td>ハイドロキノン</td><td>シグマ</td><td> H9003 </td><td></td></tr><tr><td>低融点（LMP）アガロース</td><td>シグマ</td><td> A9414 </td><td></td></tr><tr><td>鉱油</td><td>シグマ</td><td> M8410 </td><td></td></tr><tr><td> M2中</td><td>シグマ</td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> GIBCO蒸留水</td><td>インビトロジェン</td><td> 15230-196 </td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ滅菌蒸留（DD）水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> PCR </td></tr><tr><td> IllustraホットスタートミックスRTG </td><td> GEヘルスケア</td><td> 28-9006-54 </td><td></td></tr><tr><td> 240 ng / mlの酵母tRNA </td><td>インビトロジェン</td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 5倍グリーンGoTaq反応バッファー</td><td>プロメガ</td><td> M7911 </td><td></td></tr><tr><td>内側と外側のネストされたプライマー</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> ライゲーション </td></tr><tr><td>プロメガのpGEM-T Easyベクター</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A1360 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> TAクローニング </td></tr><tr><td>有能な大腸菌細胞</td><td> Zymoリサーチ（株） </td><td> T3009 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 機器 </td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 70°Cと90°Cヒートブロック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37°Cと50°C Waterbaths（42°Cの変換用） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロッカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCRマシン</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

単一の卵重亜硫酸塩の突然変異誘発

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

エピジェネティクスは、すべてがこのように遺伝子のアクセシビリティを変更し、遺伝子の転写1を調整するための主要なメカニズムであることをクロマチンに遺伝性で可逆的改変を包含する。 DNAメチル化は、抑圧的なマークとして主に作用するエピジェネティックな修飾である。 CpGジヌクレオチドのシトシン上のメチル基の共有結合的付加により、それは、クロマチンを凝縮と遺伝子2をサイレンシングに関与するプロセスを開始するために追加の抑圧的なタンパク質やヒストン修飾を募集することができます。それは発達のプログラミング、細胞分化、レトロエレメントの弾圧、X染色体不活性化とゲノムインプリンティングに重要な役割を果たしているDNAのメチル化は正常な発達に不可欠である。 DNAメチル化解析のための最も強力な方法の一つは、亜硫酸水素塩の突然変異誘発である。亜硫酸水素ナトリウムは、ウラシルにシトシンをdeaminates DNAの変異原である。 PCR増幅とseque以下<html> ncingは、これらの変換イベントはチミンとして検出されます。メチル化シトシンは脱アミノ化から保護するため、個々のヌクレオチドレベル3でDNAメチル化の同定を可能にする、シトシンのままにされています。亜硫酸塩の突然変異誘発アッセイの開発は、当初より高感度と7再現性のあるものに向かって4-6を報告されたものから発展してきた。一つの重要な進歩は、それによって過酷な重亜硫酸塩処理8からDNAを保護し、アガロースビーズにDNAの少量を埋め込 ​​むされました。卵母細胞および胚盤胞段階の胚9のプール上で実行するために、この対応のメチル化解析。これまでで最も洗練された亜硫酸塩の突然変異誘発のプロトコルは、個々の胚盤胞段階の胚は10です。胚盤胞は、平均64個のセル（ゲノムDNAの120から720 pgを含む）を持っているのでしかし、この方法は、個々の卵母細胞または切断ステージ胚におけるメチル化研究のための効果的ではありません。 テント&quot;&gt;卵母細胞11を含む分DNA量の埋め込 ​​みをアガロースから手がかりをとると、ここでは卵母細胞を直接検索し、卵母細胞から透明帯を除去した後、直ちにアガロース溶解ソリューションビーズに埋め込 ​​まれているさせる方法を提示します。これは私たちに可能単一の卵重亜硫酸突然変異誘発の2つの主要な課題を回避する：多数のプロトコルステップの間に低下し、その後の損失からのDNAの微量を保護する重要なことは、データが単一の卵母細胞から得られたとして、プール内のPCRバイアスの問題が排除されるさらに。複数のメチル化パターンを持つ任意のサンプルはこのプロトコルは、単一細胞レベルでのDNAメチル化の成功と再現性の解析のための改良方法を提供する。分析12から除外されることがあり、理想的に適していますので、不注意な卵丘細胞の混入は、この方法で検出可能である個々の卵母細胞と同様に開裂段階の胚のために。

亜硫酸塩の突然変異誘発は、DNAメチル化を解析するためのゴールドスタンダードです。私たちの変更されたプロトコルは、単一細胞レベルでのDNAメチル化解析を可能にし、特に個々の卵のために設計されました。また、開裂段階の胚に使用することができます。

エピジェネティクスは、クロマチンへの遺伝性かつ可逆的なすべての修飾を包含しており、これらは遺伝子のアクセシビリティを変化させ、それによって……の主要なメカニズムとなります。

本手順の全体的な目的は、単一の卵母細胞におけるDNAメチル化を解析することです。まず、採取した卵母細胞からキュムルス細胞およびソープパリタを除去します。次に、微量のDNAが消失または分解されるのを防ぐため、卵母細胞を2:1のaros溶解液に封入します。次に重亜硫酸塩変異導入を行い、続いてネスティングPCRによる増幅を行います。最終ステップとして、PCR産物のライゲーションとクローニングを行います。その後、クローンを選別してPCR増幅し、シーケンシングに供します。最終的に、重亜硫酸塩変異導入およびシーケンシングを用いて、単一の卵母細胞における標的領域のシトシン-ホスホグアニジン、すなわちCpGジヌクレオチドのDNAメチル化を明らかにします。大量の細胞を用いた重亜硫酸塩変異導入などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、細胞をプールすることなく単一の卵母細胞からデータを取得できるため、PCRバイアスや化学細胞の混入を避けられる点にあります。卵母細胞の回収日には、書面によるプロトコルに記載されている溶液を新たに調製してください。溶液を調製する際は、頻繁に手袋を交換し、フィルターチップを使用することで、DNA汚染の可能性を低減してください。また、チューブを開けているときは傾けて保持し、使用していないときはすべてのチューブに蓋をしてください。解剖したマウスの輸卵管をM2培地に置き、Mピレットで吸い上げて卵丘細胞複合体を抽出することで、OSI回収を開始します。次に、30 µLのM2培地滴中の0.3 mg/mLヒアルロニダーゼ溶液を用いて、卵丘細胞複合体から卵子を分離します。長時間にわたる曝露は卵子に損傷を与える可能性があるため、卵丘細胞を除去するのに必要な最小限の時間のみ、卵子を溶液中に保持してください。卵母細胞を30 µLのM2培地の液滴に順次移し、洗浄します。クムルス細胞を定期的に除去しながら、計3回の洗浄を行います。酸性タイロ溶液を用いてLUCITAのZを除去します。まず、卵母細胞を30 µLの溶液ドロップ1滴に移し、次に別の30 µLのドロップへと移します。これは、一緒に持ち越された培地が酸を希釈し、その効率を低下させるためです。長時間にわたる曝露は細胞にダメージを与える可能性があるため、透明帯を除去するのに必要な時間だけ、細胞を溶液中に保持してください。透明帯を除去した後、細胞を30 µLのM2培地の滴で再度洗浄します。Agaroseへの包埋を行うため、まず溶解液を70 °Cのヒートブロックに置きます。あらかじめ加熱した低融点（LMP）Agaroseを溶解液に加え、Agaroseと溶解液の比率を2:1にします。次に、少量のM2培地を用いて、単一の卵母細胞を清潔なガラススライド上に配置します。次のステップは、単一細胞をAgrosおよび溶解溶液に埋め込むことです

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