細菌の凍結乾燥と細胞の生存への影響のための処方

本実験の目的は、異なる種類の凍結乾燥処方が細胞生存率に及ぼす影響を観察することである。まず、細胞培養物を凍結乾燥させるための異なる処方を調製する。次に、各処方を細胞培養物と混合して凍結乾燥させ、その後、再水和して生存率を測定する。

結果から、生存率の差が特性評価された性質に関連していることが示されました。この方法は、脱水中の細胞生存において、製剤のどのような物理的および構造的特性が重要であるかを理解するのに役立ちます。Pseudomonas putterのスターターカルチャーを準備するには、まずtriptych soy broth（TSB）100 millilitersに、triptych soy broth（TSB）を添加したアガー上で培養した細胞コロニーを接種します。その後、培養液を30 °Cで、130 RPMで振盪しながら7時間インキュベートします。

培養液の一部を新鮮なTSBに transferred し、16時間培養します。室温で 1,500 ×g、20分間の遠心分離により細胞を回収します。細胞ペレットを 150 mM 塩化ナトリウムに懸濁し、Resusで洗浄します。

細胞をペレット化し、再懸濁します。処方用培地に懸濁してください。細胞の凍結乾燥用処方溶液を調製します。

各マトリックス成分を秤量し、水に溶解させて等張条件にします。賦形剤、塩化ナトリウム、またはその他の細胞適合性溶質を用いて溶液を調整します。低粘度溶液中で細胞を均一に再懸濁させるには、高粘度溶液をボルテックスしてください。

スターバーを加え、混合物を攪拌します。次に、調製物をあらかじめ重量を量った凍結乾燥用バイアルに分注し、バイアルの重量を量ります。各サンプルから100 µLを分取して10倍段階希釈を行い、目的の希釈液をプレートに播種して室温でインキュベートします。バイアルを凍結乾燥機内で密封する場合は、播種した細胞のバイアルにゴム栓をします。

各処方の細胞数を計測します。dune法を用いて、乾燥後の細菌混合物の表面張力を測定します。白金リングを無色の炎にかざし、赤色になるまで加熱して洗浄します。

アセトンと低リントティッシュを用いて、測定容器を洗浄・拭き取りし、火炎で内部を焼成します。溶液を容器に満たし、平衡に達するまで時間がかかる溶液については、表面が静止してから測定を行ってください。ここでのセットアップにより、高粘度の処方における定性的なデータが得られます。

低濃度溶液を用いて表面張力を測定し、凍結乾燥条件を製剤の物理的特性に合わせて調整する必要があることを外挿します。最も重要なパラメータは、製剤のガラス転移温度（TG）であり、水が依然として存在することを示す凍結濃縮サンプルのTG（TG'）として表記されます。製剤の凍結挙動を決定するために、5〜10 mgのサンプルを蓋付きの示差走査熱量測定（DSC）用アルミニウムパンに封入します。

リファレンスとして空のパンを用意します。DSCの温度スキャンプログラムを、凍結乾燥プログラムの凍結ステップを模倣するように設定します。これは、加熱スキャンが始まる前の未乾燥製剤のTG'に冷却速度が影響を与える可能性があるためです。

温度を予想されるtgを十分に下回るまで下げます。調査対象の配合に合わせて、適切な加熱速度を選択してください。記録された熱流信号はワットで表され、加熱速度によって影響を受けます。

加熱速度を高くすると、TG Primeのシグナルが大きくなります。温度範囲は、TG Primeと製剤の融点（melting）の両方をカバーするように設定してください。凍結挙動が決定したら、サンプルの温度が常にサンプルのTG以下に保たれ、かつチャンバー圧が製剤中の氷および残留水の迅速な昇華を可能にするよう、凍結乾燥プロセスのパラメータを調整します。凍結乾燥後の乾燥製品を保護するために。

凍結乾燥サイクルの終了時に真空を解除する前に、サンプルを凍結乾燥機内で密封し、サンプル雰囲気の制御を行ってください。あるいは、バイアル内に任意の雰囲気を充填することも可能です。保存雰囲気中に水分や酸素が存在すると細胞の生存率に影響するため、サンプルを周囲の環境にさらさないようにすることが重要です。

最後に、X線分析を行うためにバイアルの重量を測定します。少量の細菌マトリックスをサンプルホルダーに載せ、サンプルホルダーをX線回折計に装着します。X線装置に対応したソフトウェアを使用して、サンプル中に存在する結晶相を分析します。

電子顕微鏡で細菌マトリックスを分析するために、少量を走査電子顕微鏡（SEM）用スタブに固定したカーボンテープ上に載せます。SEMホルダーをスパッタコーターに入れ、サンプルを金とパラジウム、または白金でコーティングして、サンプルの観察ができるようにします。SEMホルダーをチャンバーにセットし、適切なイメージングパラメータを選択してください。

例えば、本装置では加速電圧5 kV、スポットサイズ3、作動距離5 mm、および二次電子検出器を使用します。この表には、凍結製剤の加熱中にDSCで記録された熱イベント、乾燥サンプルの構造、および製剤溶液の表面張力を含む、異なる処方のデータが記載されています。スクロースのTg'は-40 °Cであり、スクロース濃度が20% w/w未満の場合、検出が困難なことがあります。

マイナス 35 °C での熱イベントは、ここで示されている氷の溶解の開始に関連していると考えられます。異なる糖類ベースの処方剤で調製された、グラム陰性菌 P putter およびグラム陽性菌 a CHLOROPHYL cus の生存データです。処方剤が細胞の生存をどの程度サポートするかという傾向は、両方の細菌種で同様であることに注目してください。

このプロットは、凍結乾燥後の生存率と製剤の表面張力の相関を示しており、表面張力が高いほど生存率が高くなることを示しています。ここに示すSEM画像は、4種類の異なるポリマーの乾燥製剤を表しており、そのマトリックスは、fi、ccal、およびスクロースにおいては、パリパリとした紙のような外見、あるいは埋め込まれた細菌が波状のパターンを形成している相互に連結した滑らかなシート状の外見をしています。シートの厚さは約1 µm、幅は10から20 µmであり、fiとccalはより滑らかな表面を持ち、HPMCとHECは非常に薄いシートとなっています。

また、セルロースベースの製剤ではポリマーと細菌の比率が低いためか、細菌をより容易に観察することができました。さらに、HECおよびHPMCでは塩結晶が観察され、後者ではポリマーシートの表面により多くの沈殿物が見られました。このビデオを視聴することで、ここで示した手法を用いて、細胞の生存率が製剤の特性にどのように依存するかを十分に理解できたはずです。