Name: 細菌の凍結乾燥と細胞の生存への影響のための処方 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶ 細菌の凍結乾燥処方と細胞生存への影響。Pseudomonas putidaを用いて、処方物性と生存率の関連を評価する手法を解説。微生物保存技術の最適化に役立つ知見を提供します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

仕事はDOMプログラムと欧州連合コミュニティFP7 Frameworkのプログラムからグラント211684（BACSIN）を通じて戦略的環境研究のためのスウェーデンの財団（MISTRA）によってサポートされていました。私たちは、概念的な物語との助けるためにX線分析とL.唐の撮影の支援のためにJ. Engstrandに感謝します。

1。 P.の栽培と収穫プチダ <ol><li> Pのコロニーをトリプシン大豆ブロス100mlの（TSB）を接種することによりシュードモナスのスターター培養を準備プチダ細胞は、トリプシン大豆ブロス（TSA）を補充した培地で培養した。 130 rpmで設定揺れボードに30℃で文化を保つ。 </li><li> 7時間後は、新鮮なTSB-培地に本培養の最終容量のスターター培養と同等の1/10〜アリコートを転送します。 16時間130 rpmで振盪ボードに30℃で細胞を保管してください。 </li><li>成長の16時間後、細胞を室温で20分間、1,500 xgで細胞培養物を回転させて回収する。上清を除去し、細胞ペレットを増殖培地に等張であるのNaCl溶液中で再懸濁することによって細胞を洗浄。この場合、150mMのNaCl溶液を用いた。 、次いで、細胞を再び遠心分離し、上清を処方培地で細胞を再懸濁する前にデカントステップ3.2を参照してください。 </li></ol> 2。他の種の栽培<ol><li>他の細菌種にプロトコルを適合させるために栽培や収穫手順は、その種の要件に応じて変更されるべきである。収穫及び洗浄工程（複数可）中に細胞を取り扱う際浸透圧ショックを回避するために、溶液のオスモル濃度は、収穫時の増殖培地のことを一致させる必要がある。 </li></ol> 3。細胞の策定<ol><li>それぞれのマトリックス成分を計量することによって定式化ソリューションを準備し、水に溶解する。等張条件を達成するために、いずれかの賦形剤の量を調整したり、所望の重量オスモル濃度に到達するためのNaClまたはいくつかの他の細胞適合溶質を加える。このような二糖類などの低分子量物質の量は、容易に等張条件に達するように調整することができる。高分子であるポリマーのような物質については、張は、セルと互換性で調整する必要がありますリュート、 例えば塩化ナトリウムまたは二糖類。物質の任意の添加が交互に凍結乾燥挙動と細胞生存に影響を及ぼし得る製剤の物理的特性に影響を与えることに留意されたい。 </li><li>洗浄液（この場合、NaCl）を、それぞれの製剤のメディアで再懸濁細胞をデカント。 </li><li>細胞が均一に分散していることを確認します。高い粘度の配合物は、例えば 。、攪拌棒を添加し、均質な混合が達成されるまで、容器を振盪することにより混合して使用するのに対し、低粘度の配合物をボルテックスしている。 </li><li>凍結乾燥バイアルに処方を分ける。凍結乾燥中に除去される水の量を計算するために凍結乾燥前と後のバイアルを試料と、空の計量されるべきである。 </li><li>バイアルを凍結乾燥機内に封入される場合はバイアルにゴム栓を追加するには、ステップ4.3を参照してください。 </li><li>凍結乾燥前に、各製剤中の細​​胞を列挙、ステップ6を参照してください。 </li> &lt;/ OL&gt; 4。フリーズドライ<ol><li>凍結乾燥条件は、配合物の物理的特性に調整されなければならない。最も重要なパラメータは、この場合、ガラス転移温度、Tgは、配合物、水が依然として存在であることを示すために、凍結濃縮試料についてのTg &#39;を付している。凍結濃縮製剤のTg &#39;を容易に示差走査熱量測定（DSC）を用いて測定され、ステップ7を参照してください。 </li><li>試料の温度は試料のTgを下回ると、チャンバ圧力は、すなわち、セカンダリ製剤中の氷、すなわち一次乾燥し、残留水を迅速に昇華を可能にすることを常にあるように、凍結乾燥プロセスのパラメータを調整する乾燥。試料温度は、乾燥プロセスの間に &quot;Tgを超えている場合は有意に細胞の生存を減少させることができる試料の構造崩壊の大きな危険性がある。 </li><li> fの後に乾燥した製品を保護するためにreeze乾燥サンプル雰囲気が制御されなければならない。可能であれば、真空凍結乾燥サイクルの終了時に解放される前に、凍結乾燥機でサンプルを密封する。あるいはバイアルは好ましい雰囲気を充填することができる。それは、ストレージ大気中の湿気や酸素の存在のような周囲条件にサンプルをさらすことを避けるために重要なのは、細胞の生存に影響を与える。 </li><li>バイアル重量を量る。 </li></ol> 5。水分補給<ol><li>イオンと滅菌水でサンプルを再水和。添加する水の量は、凍結乾燥の間に除去し、空バイアル、凍結乾燥前と後の試料と同じバイアルの重量から計算される量とが同じでなければならない。サンプルは今、もう一度、次にソリューションが均質に表示されるまでボルテックス。 </li></ol> 6。列挙<ol><li>各サンプルから100μlのを描画し、10倍連続希釈を行います。統合の希釈から残りの100μlをTSAプレート上にメッキされています。プレートは、必要な温度および時間でインキュベートする。 </li></ol> 7。凍結挙動の定式化の特性<ol><li>少量、5取る - 10 mgの、サンプルのと蓋付きDSC-アルミパンで囲みます。リファレンスとして空の鍋を準備します。 </li><li> DSC温度スキャンプログラムを設定します。冷却プログラムは、凍結乾燥番組で凍結工程を模倣するように設定されている。これは、冷却速度論のように行われる水和製剤のTg &#39;に影響を与えることができる。加熱スキャンによく、通常調査製剤の予想Tgが &#39;、100℃以下の温度を下げる開始する前に</li><li> 40℃/分が使用されている - 適切な加熱速度、5の通常加熱速度を選択してください。記録された熱流量信号がワットで表され、加熱速度によって影響を受ける。高い加熱速度はTgが &#39;の大きな信号を与える。 </li><li>温度範囲を設定しているので、私tはTgが &#39;と製剤の融解の両方をカバーしています。 </li></ol> 8。和製剤の表面張力測定<ol><li>この実験で使用実験は、表面を測定するデュNoüy方法に従ってされる。 </li><li>慎重にプラチナリングと測定容器を清掃します。容器は、アセトンですすぎ、糸くずの出ないティッシュで拭いた後、無色の炎で内側に燃焼される。リングは無色の炎で赤点灯します。 </li><li>溶液を容器に記入し、表面が測定する前に解決することができます。平衡状態だけ久しぶりに達したソリューションについては、 例えばポリマーは、ここで使用される単純なセットアップでは定性的なデータを提供します。 </li><li>高い粘度、 例えば 2％の溶液（w / w）のHEC又はHPMCとの配合物については、表面張力が低い濃度の溶液で測定する必要があり、その後補外。これは、その事実を利用することによって行うことができる0.5％以下の濃度（w / w）の時の表面張力レベルオフの低下。 </li></ol> 9。乾燥製剤のX線解析<ol><li>マトリックス/細菌の少量を取り、サンプルホルダーにそれをロードします。 </li><li> X線回折装置に試料ホルダーをマウントします。 </li><li>サンプル内の任意の結晶相の存在を分析したBrukerからEVAプログラムパッケージを使用することができる。 </li></ol> 10。電子顕微鏡法<ol><li>バイアルのうちマトリックス/細菌の少量を取り、SEMスタブにそれを修正する。 </li><li>スパッタコーター（本研究で使用するサーモVGScientificポーラロンSC7640）やコートのAu / Pd又はPtを数nmと、試料中のSEMホルダーをロードします。これらの実験ではスパッタのパラメータは次のとおりだった：1,900 V、20ミリアンペア、そして20秒〜5のために - は10nmのAu / Pdをコーティング。コー​​ティングは、画像取得時の電気の帯電を軽減します。充電が解消されないと、画像の原因となるかどうかは、薄いコーティングで開始することが推奨され、アーティファクトは、試料を再びコーティングされるべきである。 </li><li> SEM室にSEMホルダーをロードします。適切な撮像パラメータを選択します。 図2（FEIストラータDB235）で使用される楽器のために私達は5 kVの加速電圧、スポットサイズ3、5ミリメートルと二次電子検出器の作動距離を使用していました。 </li><li>場合により、さらなる詳細を明らかにするためにポリマー中に埋め込まれた細菌の断面を切断するために集束イオンビームを使用することが可能である。 </li></ol>

<ol><li>Wessman, P., Mahlin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+matrix+properties+on+the+survival+of+freeze-dried+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sci.+Food+Agric%22%5BJournal%5D)">Impact of matrix properties on the survival of freeze-dried bacteria.</a> J. Sci. Food Agric. 91 (14), 2518-2528 (2011).</li>
<li>Ablett, S., Izzard, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Scanning+Calorimetric+Study+of+Frozen+Sucrose+and+Glycerol+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Chemical+Society-Faraday+Transactions%22%5BJournal%5D)">Differential Scanning Calorimetric Study of Frozen Sucrose and Glycerol Solutions.</a> Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions. 88 (6), 789-794 (1992).</li>
<li>Knopp, S. A., Chongprasert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+type+TMDSC+curve+of+frozen+sucrose+solutions+and+collapse+during+freeze-drying%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Analysis+and+Calorimetry%22%5BJournal%5D)">The relationship between type TMDSC curve of frozen sucrose solutions and collapse during freeze-drying.</a> Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 54 (2), 659-672 (1998).</li>
<li>Crowe, J. H., Leslie, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+Vitrification+Sufficient+to+Preserve+Liposomes+during+Freeze-Drying%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Is Vitrification Sufficient to Preserve Liposomes during Freeze-Drying.</a> Cryobiology. 31 (4), 355-366 (1994).</li>
<li>Jain, P., Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glass-forming+biopreservatives+on+head+group+rotational+dynamics+in+freeze-dried+phospholipid+bilayers%3A+A+P-31+NMR+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Effect of glass-forming biopreservatives on head group rotational dynamics in freeze-dried phospholipid bilayers: A P-31 NMR study.</a> Journal of Chemical Physics. 131 (2), (2009).</li>
<li>Stock, J. B., Rauch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+Space+in+Salmonella-Typhimurium+and+Escherichia-Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Periplasmic Space in Salmonella-Typhimurium and Escherichia-Coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 252 (21), 7850-7861 (1977).</li>
<li>Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anhydrobiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Anhydrobiosis.</a> Annual Review of Physiology. 54, 579-599 (1992).</li>
<li>Leslie, S. B., Israeli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+and+Sucrose+Protect+Both+Membranes+and+Proteins+in+Intact+Bacteria+during+Drying%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Trehalose and Sucrose Protect Both Membranes and Proteins in Intact Bacteria during Drying.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61 (10), 3592-3597 (1995).</li>
<li>Nesarikar, V. V., Nassar, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cations+and+anions+on+glass+transition+temperatures+in+excipient+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Development+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effect of cations and anions on glass transition temperatures in excipient solutions.</a> Pharmaceutical Development and Technology. 12 (3), 259-264 (2007).</li>
<li>You, Y., Ludescher, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+sodium+chloride+on+molecular+mobility+in+amorphous+sucrose+detected+by+phosphorescence+from+the+triplet+probe+erythrosin+B%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of sodium chloride on molecular mobility in amorphous sucrose detected by phosphorescence from the triplet probe erythrosin B.</a> Carbohydr. Res. 343 (2), 350-363 (2008).</li>
<li>Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Nguyen, K. H. N., Crowe, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+vitrification+involved+in+depression+of+the+phase+transition+temperature+in+dry+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Is vitrification involved in depression of the phase transition temperature in dry phospholipids.</a> Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1280, 187-196 (1996).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されていない。

この研究のための動機は、凍結乾燥中の細胞生存に重要であり得るいくつかの製剤特性を検討した。 図1A、異なる製剤の支持細胞の生存が類似している傾向にどれだけに示すように、真性乾燥耐性は、異なる種の間で変化するものの。それはスクロースおよびフィコールの比較で開始することが有益である。これは、細胞生存を支持するための製剤の重要な要因は、このように乾燥状態でも、細胞のタンパク質および膜の構造を維持し、脱水時に水を交換するための製剤成分の能力であると考えられる。例えばスクロース糖類だけでなく、多糖類、デンプンなどのポリマーが5,11しないのに対し、このプロパティを示すトレハロース。ポリマーは、二​​糖類と同じ方法で膜脂質と相互作用するには大きすぎると考えられている。成功した凍結乾燥のための重要な別のプロパティ微生物のINGは凍結乾燥の間（ すなわち 。なるアモルファス固体）ガラス化するためのサポートマトリックスの能力である。アモルファス構造が分離された細胞をシールドし、維持するために有益である。興味深いことに、両方の二糖類及びポリマー凍結乾燥あれば容易にガラス化が適切に実行...

<table><tbody><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>GE-healthcare</td><td>17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>HEC (Natrosol-M 医薬品グレード)</td><td>Ashland</td><td></td><td>Ashland社より提供</td></tr><tr><td>HPMC (Methocel F4M)</td><td>Dow</td><td></td><td>ウプサラ大学薬学部より提供</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2395</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>トリプチカソイ・ブロス</td><td>Merck</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>トリプチカソイ・アガー</td><td>Merck</td><td>105458</td><td></td></tr><tr><td>Lyostar II</td><td>FTS Kinetics</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Pyris Diamond DSC</td><td>Perkin-Elmer</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Bruker AXS SMART CCD 1k 回折計</td><td>Bruker</td><td>N.A</td><td></td></tr><tr><td>Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM</td><td>FEI</td><td>N.A</td><td></td></tr><tr><td>Kr&amp;#252;ss 教育用テンシオメーター</td><td>Kr&amp;#252;ss</td><td>N.A.</td><td></td></tr></tbody></table>

細菌の凍結乾燥と細胞の生存への影響のための処方

Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

セルラ水を可逆的に保管を容易にするために、微生物を不活性化するために除去することができる。除去のそのような方法の一つは、穏やかな脱水方法考えられる凍結乾燥である。乾燥中の細胞生存を促進するために、細胞は、しばしば、予め処方される。製剤は、細胞を埋め込み、凍結乾燥中のセルに課される種々の有害なストレスからそれらを保護マトリックスを形成する。ここでは、凍結乾燥後の細胞の生存率を評価する一般的な方法を提示し、我々は、4つの異なる処方で得られた結果と比較することによってそれを示している：二糖スクロース、ポリマーフィコールPM400由来のスクロースを、各多糖類、ヒドロキシエチルセルロース（HEC細菌の2株、P.上）とヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、 プチダ KT2440とA. chlorophenolicus A6。本研究では、凍結乾燥用製剤を調製する方法と、機械式を調査する方法を示し示差走査熱量測定（DSC）、表面張力の測定は、X線分析、および電子顕微鏡を用いて、生存率にそれらのデータを関連付ける製剤を特徴付けることによって再水和後の細胞生存のイズム。ポリマーは、程度の差は、それぞれの多糖類に似た白糖の単量体構造を得るために選ばれました。この方法の設定を用いて、我々は、ポリマーは、製剤の特定の物理的特性が制御される場合、二糖類1と効果的に細胞生存をサポートできることを示した。

製剤組成物、凍結製剤の加熱時にDSCによって記録された熱事象、乾燥試料の構造及び製剤溶液の表面張力の表1に表示されるデータである。スクロースの Tg &#39;は-40°C 2、図3に決定された、20％w / wの下方スクロース濃度を検出するために困難であり得る。 -35の熱イベント°Cは、おそらく氷の溶解2の発症に関連しています。結晶構造HECとHPMC試料でX線によって検出され、また、（図2bおよび2cを参照） を SEMで見られるには、NaClの通常の結晶形と重なる。 図1Aは、グラム陰性P.の生存データを示すプチダおよびグラム陽性A. chlorophenolicusは異なる糖ベースの製剤中に配合。製剤は、細胞の生存を支えるどれだけの傾向ではBOのために同じであることに注意してください番目の細菌種。 <...

凍結乾燥は、多くの場合、生菌細胞の乾燥製品を得るための簡単​​で便利な方法です。プロセスの問題は、細胞生存ある。ここで我々は細部、凍結乾燥時の細胞の生存が使用製剤の特性によって影響されるか調査する手順を。

微生物の保存を容易にするため、細胞内の水分を除去して可逆的に不活化させることができます。除去方法の一つにフリーズドライ（凍結乾燥）があり、これは...

本実験の目的は、異なる種類の凍結乾燥処方が細胞生存率に及ぼす影響を観察することである。まず、細胞培養物を凍結乾燥させるための異なる処方を調製する。次に、各処方を細胞培養物と混合して凍結乾燥させ、その後、再水和して生存率を測定する。結果から、生存率の差が特性評価された性質に関連していることが示されました。この方法は、脱水中の細胞生存において、製剤のどのような物理的および構造的特性が重要であるかを理解するのに役立ちます。Pseudomonas putterのスターターカルチャーを準備するには、まずtriptych soy broth（TSB）100 millilitersに、triptych soy broth（TSB）を添加したアガー上で培養した細胞コロニーを接種します。その後、培養液を30 °Cで、130 RPMで振盪しながら7時間インキュベートします。培養液の一部を新鮮なTSBに transferred し、16時間培養します。室温で 1,500 ×g、20分間の遠心分離により細胞を回収します。細胞ペレットを 150 mM 塩化ナトリウムに懸濁し、Resusで洗浄します。細胞をペレット化し、再懸濁します。処方用培地に懸濁してください。細胞の凍結乾燥用処方溶液を調製します。各マトリックス成分を秤量し、水に溶解させて等張条件にします。賦形剤、塩化ナトリウム、またはその他の細胞適合性溶質を用いて溶液を調整します。低粘度溶液中で細胞を均一に再懸濁させるには、高粘度溶液をボルテックスしてください。スターバーを加え、混合物を攪拌します。次に、調製物をあらかじめ重量を量った凍結乾燥用バイアルに分注し、バイアルの重量を量ります。各サンプルから100 µLを分取して10倍段階希釈を行い、目的の希釈液をプレートに播種して室温でインキュベートします。バイアルを凍結乾燥機内で密封する場合は、播種した細胞のバイアルにゴム栓をします。各処方の細胞数を計測します。dune法を用いて、乾燥後の細菌混合物の表面張力を測定します。白金リングを無色の炎にかざし、赤色になるまで加熱して洗浄します。アセトンと低リントティッシュを用いて、測定容器を洗浄・拭き取りし、火炎で内部を焼成します。溶液を容器に満たし、平衡に達するまで時間がかかる溶液については、表面が静止してから測定を行ってください。ここでのセットアップにより、高粘度の処方における定性的なデータが得られます。低濃度溶液を用いて表面張力を測定し、凍結乾燥条件を製剤の物理的特性に合わせて調整する必要があることを外挿します。最も重要なパラメータは、製剤のガラス転移温度（TG）であり、水が依然として存在することを示す凍結濃縮サンプルのTG（TG'）として表記されます。製剤の凍結挙動を決定するために、5〜10 mgのサンプルを蓋付きの示差走査熱量測定（DSC）用アルミニウムパンに封入します。リファレンスとして空のパンを用意します。DSCの温度スキャンプログラムを、凍結乾燥プログラムの凍結ステップを模倣するように設定します。これは、加熱スキャンが始まる前の未乾燥製剤のTG'に冷却速度が影響を与える可能性があるためです。温度を予想されるtgを十分に下回るまで下げます。調査対象の配合に合わせて、適切な加熱速度を選択してください。記録された熱流信号はワットで表され、加熱速度によって影響を受けます。加熱速度を高くすると、TG Primeのシグナルが大きくなります。温度範囲は、TG Primeと製剤の融点（melting）の両方をカバーするように設定してください。凍結挙動が決定したら、サンプルの温度が常にサンプルのTG以下に保たれ、かつチャンバー圧が製剤中の氷および残留水の迅速な昇華を可能にするよう、凍結乾燥プロセスのパラメータを調整します。凍結乾燥後の乾燥製品を保護するために。凍結乾燥サイクルの終了時に真空を解除する前に、サンプルを凍結乾燥機内で密封し、サンプル雰囲気の制御を行ってください。あるいは、バイアル内に任意の雰囲気を充填することも可能です。保存雰囲気中に水分や酸素が存在すると細胞の生存率に影響するため、サンプルを周囲の環境にさらさないようにすることが重要です。最後に、X線分析を行うためにバイアルの重量を測定します。少量の細菌マトリックスをサンプルホルダーに載せ、サンプルホルダーをX線回折計に装着します。X線装置に対応したソフトウェアを使用して、サンプル中に存在する結晶相を分析します。電子顕微鏡で細菌マトリックスを分析するために、少量を走査電子顕微鏡（SEM）用スタブに固定したカーボンテープ上に載せます。SEMホルダーをスパッタコーターに入れ、サンプルを金とパラジウム、または白金でコーティングして、サンプルの観察ができるようにします。SEMホルダーをチャンバーにセットし、適切なイメージングパラメータを選択してください。例えば、本装置では加速電圧5 kV、スポットサイズ3、作動距離5 mm、および二次電子検出器を使用します。この表には、凍結製剤の加熱中にDSCで記録された熱イベント、乾燥サンプルの構造、および製剤溶液の表面張力を含む、異なる処方のデータが記載されています。スクロースのTg'は-40 °Cであり、スクロース濃度が20% w/w未満の場合、検出が困難なことがあります。マイナス 35 °C での熱イベントは、ここで示されている氷の溶解の開始に関連していると考えられます。異なる糖類ベースの処方剤で調製された、グラム陰性菌 P putter およびグラム陽性菌 a CHLOROPHYL cus の生存データです。処方剤が細胞の生存をどの程度サポートするかという傾向は、両方の細菌種で同様であることに注目してください。このプロットは、凍結乾燥後の生存率と製剤の表面張力の相関を示しており、表面張力が高いほど生存率が高くなることを示しています。ここに示すSEM画像は、4種類の異なるポリマーの乾燥製剤を表しており、そのマトリックスは、fi、ccal、およびスクロースにおいては、パリパリとした紙のような外見、あるいは埋め込まれた細菌が波状のパターンを形成している相互に連結した滑らかなシート状の外見をしています。シートの厚さは約1 µm、幅は10から20 µmであり、fiとccalはより滑らかな表面を持ち、HPMCとHECは非常に薄いシートとなっています。また、セルロースベースの製剤ではポリマーと細菌の比率が低いためか、細菌をより容易に観察することができました。さらに、HECおよびHPMCでは塩結晶が観察され、後者ではポリマーシートの表面により多くの沈殿物が見られました。このビデオを視聴することで、ここで示した手法を用いて、細胞の生存率が製剤の特性にどのように依存するかを十分に理解できたはずです。

formulations-for-freeze-drying-bacteria-their-influence-on-cell

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

培養哺乳動物細胞は、細胞生物学の研究で​​広く使用されています。このビデオでは、細胞とどのように凍結ストックを回復するために凍結保存するために必要な基本的なスキルを説明します。...

トランスポートのための凍結、融解、およびパッケージング細胞

ネイティブに近い状態の細菌細胞の超微細構造を研究するために電子cryotomography（ECT）を使用する方法を私たちは、"高分子"（〜4...

細菌細胞の電子Cryotomography

出典: Lea-Smith, D. J. ほかモデルシアノバクテリア種におけるマーキングおよびマーカーレス変異体の生成。 J. Vis. Exp.

グリセロールまたはジメチル硫酸を用いたシアノバクテリア株の長期凍結保存

この原稿は、透過型電子顕微鏡により懸濁細胞を可視化するために使いやすく、低コストの低温固定の方法を記載しています。...

プランジ凍結：透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール

極低温での水性混合物のミクロン〜ピコリットルの滴のガラス質相密度を測定するためのプロトコルが記載されている。...

低温での水性ガラスの密度の測定

このプロトコルは追跡による活力パラメーターと枯草菌胞子を低圧プラズマ治療後復活で DNA 修復プロセスの監視の関連性を評価するために必要な重要な連続した手順を示しています蛍光標識された DNA...

有害な効果の低圧プラズマ滅菌を使用して住んでいる携帯顕微鏡枯草菌胞子の生存に調査

タンパク質の分解や変性を最小限に抑える極低温冷凍工場を用いて、酵母や他の細胞から全細胞抽出物を調製するための信頼できる方法を説明します。細胞抽出物は、機能性タンパク質複合体の精製、プロテオミクス分析、共免疫沈降試験、不安定タンパク質修飾の検出に適しています。...

自動冷凍工場におけるクライオグラインによる細胞抽出物の調製

ここでは、細菌、酵母、培養細胞、単離細胞、動物およびヒト組織、ウイルスを含む生物学的標本の迅速凍結にサンドイッチ凍結装置を使用する方法を示す。また、急速凍結後の超薄切片用試料の調製方法もご紹介します。...

電子顕微鏡での生体試料の良好な超構造保存のためのサンドイッチ凍結装置を用いた急速凍結

我々は、歯垢を濾過し、宿主細菌と共培養することによって、新しい細菌フィラムサッカリバクの成長困難なメンバーを単離する方法を実証する。...

口腔から共生サッカリバクテリアの安定したバイナリ培養を確立する

ホルミジウムラクナは、 海洋の岩溜まりから単離された糸状シアノバクテリウムである。この記事では、天然源からのフィラメントの単離、DNA抽出、ゲノムシーケンシング、自然形質転換、sfGFPの発現、凍結保存、および運動性法について説明します。...

糸状シアノバクテリウム・ホルミジウム・ラクナの自然形質転換、タンパク質発現、凍結保存

このプロトコルは、噴霧乾燥プロバイオティクス製品の製造および物理化学的特性評価に関連するステップを詳述しています。...

プロバイオティクス菌の噴霧乾燥プロセス開発と製品品質評価

学ぶ 細菌の凍結乾燥処方と細胞生存への影響。Pseudomonas putidaを用いて、処方物性と生存率の関連を評価する手法を解説。微生物保存技術の最適化に役立つ知見を提供します。

細菌の凍結乾燥と細胞の生存への影響のための処方

さらに動画を探す