Name: 多重抗体スクリーニング法を用いたLuminex XMAPアッセイへの捕捉ELISAの変換 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: 学ぶ 捕捉ELISAをLuminex XMAPアッセイに変換する方法。TNFアルファサイトカイン検出のため、複数抗体ペアを同時スクリーニングし、感度とダイナミックレンジを向上させる技術を解説します。

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この作品は、ルミネックス·コーポレーションによって資金を供給された。

<ol><li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li>
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<li>Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+reverse+transcription+PCR+Luminex+assay+for+detection+and+quantitation+of+viral+agents+of+gastroenteritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis.</a> J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).</li>
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<li>Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+xMAP+and+ELISA+cytokine+profiles%3B+development+and+validation+for+immunotoxicological+studies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Roum.+Arch.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro.</a> Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).</li>
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<li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA%3A+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li>
<li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li>
<li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li>
</ol>

この作品は、ルミネックス·コーポレーションで製造装置をルミネックス·コーポレーションで行われた。 R＆Dシステム＆EMDミリポアルミネックス·コーポレーションの戦略的パートナーであり、多重XMAPベースのアッセイを開発し、実用化するためにライセンスされています。

ルミネックスXMAPプラットフォームへのELISAアッセイの変換はストレプトアビジンフィコエリスリン（SA-PE）の典型的なELISAキットにストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（SA-HRP）を代入すると、パフォーマンスを最適化するような単純なことができます。地面からXMAPイムノアッセイを作成したい人のために、これはまた、抗体ペアの高速、多重評価を可能にする簡単なプロトコルを使用して達成することができます。 XMAPアッセイ用試薬は、簡単にMagPlex低濃度微小球に結合するように指定された捕捉抗体のキットをカップリングXMAP抗体を用いて調製した。より高濃度のマイクロスフェアの同じアッセイの性能を提供しながら、低濃度微小球の使用は、アッセイ開発のコストを削減します。コー​​トにELISAプレートのウェルを必要とし、24時間、治療に続いて - 結合MagPlexミクロスフェアを調製するために必要な時間は、はるかに高速22よりも約3時間であり、コー​​ティングされた井戸の。 XMAPアッセイの性能は、検出限界の点でELISA（&lt;4 pg / mLの対&gt; 31 pg / mLの）とダイナミック·レンジ（8000 pg / mLの対16 &lt;〜4 pg / mLの&gt;に優れているpg / mLの1000〜pg / mLの）。プレートリーダーは、アッセイのダイナミックレンジの上限を制限し、3または4 ODである限られたODの範囲を持っています。 間違いなく、すべての抗体は、ELISAフォーマットで動作し、ELISA法ではうまく動作しないすべての抗体は、XMAPアッセイフォーマットに容易に譲渡することはできません。 XMAPアッセイ（すなわち、同時に実行される）多重化することができますしかし、それは、アッセイに使用するための最良のペアを識別するために、同時に複数の捕捉および検出抗体の組み合わせを評価することが可能である。このプロセスは、一度に1つのペアの評価に限定されているELISAの開発手順に比べてかなりの時間と試薬を節約できます。二つ以上の抗体ペアは等価的に実行する必要があります。アッセイのその他のパペア（たとえば、可用性、コスト等）の適合性を決定するために考慮される。 XMAPアッセイに改良されたアッセイのパフォーマンスと柔軟性に加えて、大幅なコスト削減もあります。 XMAPアッセイの1つのウェルで使用されているビーズのために必要な量は約7.5 ngのであるのに対し、抗体の推奨量は、コート、単一のウェルELISAプレートは400ngであるために必要。 XMAPアッセイで使用されている場合このように、1つのウェルELISAに必要な抗体の量は、50以上のテスト結果を提供します。貴重なサンプルを含むアプリケーションでは、XMAPも大きな利点があります。 XMAPアッセイに必要な量はその半分、または少なくすることができます一方、ELISAのために推奨されるサンプルの量は100μLです。 優れたダイナミックレンジと感度を持つアッセイを製造しながら要約すると、ルミネックスXMAPプラットフォームへのELISAアッセイの変換は、単純な効率的でコスト節約になります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 説明 </td><td> ベンダー </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>人間TNF-α/TNFSF1ADuoSet ELISAキット</td><td> R＆Dシステムズ</td><td> DY210 </td><td>モノクローナル抗体およびビオチン結合ポリクローナル抗体、組換えTNF-αタンパク質の標準が含まれています</td></tr><tr><td> TNF-αに対するモノクローナル抗体</td><td>アブカム</td><td> Ab18696 </td><td>抗体、クローンCH8820をキャプチャする</td></tr><tr><td> TNF-αに対するモノクローナル抗体</td><td>アブカム</td><td> Ab16166 </td><td>ビオチン結合の検出抗体、クローンAS1 </td></tr><tr><td> TNFアルファタンパク質</td><td>アブカム</td><td> Ab9642 </td><td>組換えTNF-αタンパク質の標準</td></tr><tr><td> TNF-αに対するモノクローナル抗体</td><td> Novus </td><td> NBP1-50115 </td><td>抗体、クローン4H31をキャ​​プチャする</td></tr><tr><td> TNF-αに対するモノクローナル抗体</td><td>ノーバス</td><td> NB100-78162 </td><td>ビオチン結合の検出抗体、クローンMAb11 </td></tr><tr><td> TNFアルファタンパク質</td><td>ノーバス</td><td> NBC1-18460 </td><td>組換えTNF-αタンパク質の標準</td></tr><tr><td> TNF-αに対するモノクローナル抗体</td><td> EMDミリポア</td><td> MAB1141 </td><td>抗体、クローン3C7.2をキャプチャする</td></tr><tr><td> TNF-αに対するポリクローナル抗体</td><td> EMDミリポア</td><td> 654250 </td><td>ウサギポリクローナル検出抗体</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン - フィコエリスリン</td><td>モス</td><td> SAPE-001 </td><td>ルミネックスXMAPアッセイ用蛍光レポーター試薬</td></tr><tr><td> MAGPIX W / Xponentのソフトウェア</td><td>ルミネックス·コーポレーション</td><td> MAGPIX-Xponentの</td><td>ルミネックス·インストゥルメント</td></tr><tr><td> XMAP抗体カップリング（ABC）キット</td><td>ルミネックス·コーポレーション</td><td> 40-50016 </td><td> EDC試薬、スルホ-NHS試薬、活性化バッファー、洗浄バッファー、1.5 mLの反応管と、使い捨てのピペットが含まれています</td></tr><tr><td> MagPlexミクロスフェア、低濃度</td><td>ルミネックス·コーポレーション</td><td> MC10012-ID、MC10013-ID、MC10014-ID、MC10015-ID </td><td>低濃度のビーズ（@ 2.5×10 6ビーズ/ mL）を</td></tr><tr><td> EZ-リンクスルホ-NHS-LC-ビオチン</td><td>サーモフィッシャー</td><td> PI-21335 </td><td>変更されていない検出抗体のビオチン化キット</td></tr><tr><td>テカン無限F200リーダー</td><td>テカン</td><td></td><td> ELISAプレートリーダー</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P-3688 </td><td> 1パーセントPBS-BSA、アッセイ緩​​衝液</td></tr><tr><td>ワンパイントコンパクトな超音波洗浄、115 VAC </td><td>コー​​ル·パーマー</td><td> WU-08849から00 </td><td> 55 kHzの効果的な動作周波数を生成する</td></tr><tr><td>磁気チューブセパレータ</td><td>ルミネックス·コーポレーション</td><td> CN-0288から01 </td><td>カップリングの洗浄ステップ内の単一の1.5mlチューブ磁気分離</td></tr><tr><td>磁性板セパレータ</td><td>ルミネックス·コーポレーション</td><td> CN-0269から01 </td><td>アッセイの洗浄ステップで96ウェルプレート磁気分離</td></tr></tbody></table>

多重抗体スクリーニング法を用いたluminex xmapアッセイへの捕捉elisaの変換

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

酵素免疫測定法（ELISA）は、長い生命科学の研究と臨床診断の両方の生体試料中の関心のある検体を検出するための主要なツールであった。しかし、ELISA法では限界があります。これは通常、96ウェルマイクロプレートに実行され、井戸は、目的の抗原を捕捉するサンプルの比較的大きな金額を必要とし、捕捉抗体でコーティングされています。井戸の表面積が大きく捕捉抗体の疎水結合には、非特異的結合と増加の背景につながる可能性があります。また、ほとんどのELISA法は、合理的な感度を達成するために、信号の酵素媒介増幅に依存しています。このような増幅は常に線形ではないとすることができますので、スキュー結果。 過去15年間で、新技術は、ELISAの利点を提供している現れではなく、類似したWOより高いスループット、柔軟性、縮小サンプル量、低コストを可能にしましたrkflow 1、2。ルミネックスXMAPテクノロジーは、タンパク質および核酸アプリケーション3から5の両方に適用することができるモノプレックスとマルチプレックスアッセイの両方を可能にするマイクロスフェア（ビーズ）アレイのプラットフォームです。ビーズELISA法に比べて、少ない捕獲抗体と小さなサンプル量を必要とする共有結合より小さい表面積上に固定化された捕捉抗体を持っており、非特異的結合が大幅に削減されます。そのような脳脊髄液、滑液、等6などの制限のサンプルを扱う場合より小さいサンプルボリュームが重要である。検定の多重化は、さらに、単一のサンプルから複数の結果を有効にすると、サンプルボリュームの要件を軽減します。 ルミネックスの最近の改良点は次のとおりです。新しいMAGPIXシステムは、小型で安価な、より使いやすいアナライザ、低濃度の磁気MagPlexミクロス高価なフィルタープレートの必要性を排除し、優れたアッセイ開発に適した作業濃度に来て、低スループットのアプリケーション、およびXMAP抗体カップリング（ABC）キット、プロトコル、試薬、および利息の捕捉抗体ビーズを結合するために必要な消耗品が含まれています。 （キット内容の詳細なリストについては、マテリアルのセクションを参照してください。） この実験では、XMAPプラットフォームにTNF-αサイトカインの事前最適化されたELISAアッセイを変換し、二つの方法7-11の性能を比較します。 TNF-αは自己免疫疾患患者における炎症反応の測定に使用されるバイオマーカーである。 我々は、4つの異なるマイクロセットまたは領域に4つの候補捕捉抗体を結合することによって開始します。一緒に混合したときに、これら4つのセットには、試薬、サンプルと時間を節約し、最高の抗体のペアを決定するための4つの独立した検出抗体を持つすべての4つの候補の同時テストが可能になります。二XMAPアッセイは、2つの最適な抗体のペアとその性能がで構成されている信号の強さ、ダイナミックレンジ、感度に関しては、元のELISAアッセイのそれと比較されます。

ELISAは、簡単にルミネックスXMAPアッセイに変換することができると、多重化の利点を介して、いくつかの抗体は、アッセイのコストを削減しながら、増加した感度とダイナミックレンジの結果、最適な抗体のペアを識別するために同時にスクリーニングすることができる。

多重抗体スクリーニング法を用いたLuminex XMAPアッセイへの捕捉ELISAの変換

酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）は、生命科学の両面において、生物学的試料中の標的分析物を検出するための主要なツールとして長らく利用されてきました。

本実験の全体的な目的は、TNF Alphaサイトカイン向けに最適化済みのELISAアッセイをXapプラットフォームに転換し、同時に代替抗体ペアを評価することである。これは、ELISAキットのキャプチャー抗体と、他に3種類の候補キャプチャー抗体を、混合した4種類の異なるマイクロスフィアまたはビーズセットに結合させることで達成される。これら4つのセットを用いることで、4種類の検出抗体を用いて4つすべての候補を同時にテストし、最適な抗体ペアを決定することが可能となる。次に、最も最適な2組の抗体ペアを用いて2つのXapアッセイを構築します。その後、信号強度、ダイナミックレンジ、および感度の観点から、これらのアッセイの性能を元のEISAアッセイと比較します。その結果、同様の抗体であっても同一条件下で大きく異なる性能を示すこと、またLuminex Xapアッセイを用いることで複数の抗体を同時にスクリーニングできることが示され、本アッセイがEISAと比較して感度とダイナミックレンジが向上していることが明らかになりました。EIS Aなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、xapベースのイムノアッセイにより、研究者が複数の標的を検査できること、または本例のように、複数の抗体を同時に検査できることです。最適な抗体を特定する方法について、Luminex CorporationのアソシエイトサイエンティストであるErica Lopezが手順を実演します。書面によるプロトコルに従い、ヒトTNF alphaに特異的な4種類のキャプチャー抗体と4種類の検出抗体を選択し、調製することから本プロトコルを開始してください。また、キャプチャー抗体のホスト種に特異的な確認抗体を1種類調製してください。抗体カップリングキットの試薬を室温に戻しておきます。カップリング反応に選択したビーズ領域番号を、4本の反応チューブにラベル付けします。4本のバイアルに入ったmag plexマイクロスフィアの内容物を、ラベル付けした4本の反応チューブに移します。各ビーズセットを500 µLの活性化バッファーで2回洗浄し、抗体カップリングキットの記載に従って、sulf ONHSおよびEDC溶液を用いて各ビーズセットを活性化します。ユーザーマニュアルに従い、ローテーターで20分間インキュベートした後、活性化されたビーズを用いて、500 µLの活性化バッファーで前述の洗浄ステップを計3回繰り返します。洗浄1回につき、500 µLの溶液を4本個別に準備してください。各溶液には7.5 µgのキャプチャー抗体不活化バッファーを含めます。これら4種類のキャプチャー抗体溶液を、それぞれの反応チューブに加えます。直ちに各チューブをボルテックスし、ローテーターで2時間インキュベートします。抗体カップリングキットに付属の洗浄バッファー500 µLを用いて、抗体が結合したビーズの洗浄ステップを計3回繰り返します。最終洗浄ステップの後、各反応チューブに洗浄バッファーを500 µL加え、抗体結合ビーズの最終ストック濃度が5 million beads/mLとなるようにボルテックスし、次に反応チューブをソニケーションしてビーズを分散させます。結合反応後に回収されたビーズの数を、細胞カウンターまたは血球計数器を用いて計測します。結合反応による回収率は通常90%を超えます。各セットの結合ビーズストックを用いて、アッセイバッファー中での最終濃度が100 beads/µLとなるテスト溶液を調製し、FICO erything labeled antis speciesの希釈液を調製して、結合反応が成功したことを確認してください。アッセイバッファーで 4 µg/mL に調製した IgG 確認抗体を用い、ラウンドボトム 96 ウェルプレートの 4 ウェルずつに、各試験溶液を 50 µL ずつ分注し、計 16 ウェルに充填します。次に、バックグラウンドを測定するため 8 つのウェルにアッセイバッファーを 50 µL 加え、残りの 8 ウェルに希釈した確認抗体を 50 µL 加えます。マルチチャンネルピペットを用いて、数回ピペッティングし、反応液を穏やかに混合します。プレートに蓋をし、プレートシェーカーを用いて室温で30分間インキュベートします。プレートを磁気プレートセパレーターに1〜2分間置き、溶液からビーズを回収します。その後、セパレーターに置いたままプレートを廃棄容器に向けて勢いよく反転させ、液体を除去します。各ウェルに100 µLのアッセイバッファーを加え、同様の方法でSANEをプレートから除去することで、2回洗浄します。マグネットプレートセパレーターを使用し、マルチチャンネルピペットで5回緩やかにピペッティングして、ビーズを100 µLのアッセイバッファーに再懸濁させます。MAGIXなどのLuminex xMAP装置を用いて分析します。この反応による蛍光信号の強度はビーズ表面のタンパク質量に正比例するため、ビーズに結合したタンパク質の相対量を迅速に評価できます。xapアッセイにおいて最も効果的な抗体ペアを決定するために、各ビーズセット10 µLを0.96 mLのアッセイバッファーに加えて、4種類すべてのビーズセットの初期混合液を調製します。各抗体をアッセイバッファーで1 µg/mLに希釈し、検出抗体溶液を調製します。同様にアッセイバッファーとしても使用します。R&amp;D Systems社のTNF alphaタンパク質標準品を2000 pg/mLで調製し、Streptavidin R-Phycoerythrinを8 µg/mLに希釈します。スクリーニングアッセイ用に、CoStarラウンドボトム96ウェルプレートの16ウェル eachに、抗体結合ビーズ混合液を50 µLずつ加えます。次に、バックグラウンドを測定するため、16ウェルのうち8ウェルにアッセイバッファーを50 µL加えます。続いて、反応を測定するために、残りの8ウェルにTNF alpha標準溶液を50 µLピペッティングします。アッセイプレートシェーカーで振盪しながら、室温・遮光条件下で1時間インキュベートします。次に、4つのウェルのうち、2つをバックグラウンドウェル、残り2つをレスポンスウェルとし、それぞれのウェルに4種類の検出抗体を50 µLずつ添加します。同様の条件下で30分間インキュベートした後、すべてのウェルにSAPE試薬を50 µL添加します。さらに、同様の条件下で15分間インキュベートします。プレートをマグネットプレートセパレーターに1分間置きます。次に、セパレーターに置いたままプレートを廃液容器の上で勢いよく反転させ、液体を除去します。16個の各ウェルにアッセイバッファーを100 µLずつピペッティングします。次に、磁気分離を用いてビーズから液体を除去します。続いて、16個のウェルそれぞれにアッセイバッファーを100 µLずつ加えます。操作手順の詳細についてはユーザーマニュアルを参照し、Luminex mag picks装置でプレートを読み取ります。所望のシグナル強度を満たす抗体ペアを選択します。最適な捕捉抗体を選択した後、その抗体が結合したビーズストック溶液 100 µL をアッセイバッファーで 10 mL に希釈します。希釈したビーズ 50 µL を、2枚の CoStar ラウンドボトム 96ウェルプレートの 78ウェルに加えます。各プレートを使用して、異なる検出抗体の性能を評価します。次に、8,000 pg/mLから4 pg/mLまで、12点からなる標準曲線を作成します。R&amp;D Systems社製を使用します。TNF Alpha標準品について、各希釈液を50 µLずつ6連で各プレートに添加し、さらにバックグラウンドとしてアッセイバッファーを50 µLずつ6ウェルに添加し、1プレートあたり計78ウェルとします。プレートをアッセイプレートシェーカーで振盪させながら、室温・遮光条件下で1時間インキュベートします。その後、最初のプレートの全78ウェルに、第一検出抗体を50 µLずつ添加します。2枚目のプレート上の2番目の検出抗体についても同様の操作を繰り返します。同じ条件下でプレートを30分間インキュベートします。その後、各プレートのすべてのウェルに50 µLのSAPE試薬を加えます。2枚のプレートを遮光して15分間振盪させた後、磁気プレートセパレーターに1分間静置します。セパレーターに載せたままプレートを廃棄容器の上で勢いよく反転させ、液体を除去します。次に、磁気ビーズから液体を除去する前と同様に、プレート上の78個のウェルそれぞれにアッセイバッファーを100 µLずつピペットで分注します。プレート上の78個のウェル each のビーズに 100 µL のアッセイバッファーを添加した後、マグピックス（MagPlex）装置のユーザーマニュアルに従って適切に操作し、プレートを解析します。R&amp;D Systems 社の human TNF Alpha TNF SF1a DUOset ELISA キットに付属の指示に従ってください。R&amp;D キットに付属の標準品によって生成されるレスポンスを測定します。R&amp;D Systems社のキャプチャー抗体および検出抗体を他社製の抗体に置き換え、ELISAアッセイをさらに3回繰り返します。簡略化のため、抗体はベンダーごとにペアリングし、EISAフォーマットの規定に従って、3種類のTNF Alphaタンパク質標準品を用いて各ペアを独立して評価します。Luminex Xapアッセイは、Mag PLXマイクロビーズに結合したTNF alpha抗体の4セットを組み合わせ、4種類のキャプチャー抗体すべてを混合物として評価するためにマルチプレックスで実施しました。キャプチャー抗体は、4種類のビオチン化検出抗体と個別に評価し、1つの検出抗体と4つのキャプチャー抗体それぞれの相互作用を同時に決定できるようにしました。結果から、R&amp;D Systems社のDUOセットの抗体ペアが最も優れた性能を示し、得られた応答は6,183の平均蛍光強度（MFI）ユニットであったことが示された。また、Millipore社およびABAM社の検出抗体は、RD Systems社の捕捉抗体と組み合わせた場合にXAPアッセイで妥当な応答を示したが、Millipore社、ACAM社、およびNovus社の捕捉抗体は、XAPアッセイにおいてあまり望ましくない応答を示した。4つの抗体ペアをEISAフォーマットで比較するために、R&amp;D Systems社のDUOセットのプロトコルを用いた。今日広く用いられている典型的なEIAプロトコルを反映しており、またXAPテクノロジーで使用されるプロトコルに類似しているため、すべての抗体ペアにR&amp;D Systems社のプロトコルを使用しました。EISA試験の結果、R&amp;D Systems社の抗体ペアが再び最良の結果を示しました。抗体反応性の変動を評価したところ、Acam社の抗体ペアでは反応が見られず、Millipore社およびNovas社の抗体ペアでは緩やかな反応が認められました。標準物質を用いて、4組すべての抗体ペアを、3社の異なるベンダーから提供された3種類のリコンビナントTNF alphaタンパク質標準物質でテストしました。データは、3社のベンダーのリコンビナントTNF alphaタンパク質標準物質が同等の結果を示したことを表しています。ELSAおよびXAPアッセイで標準曲線を作成するには、R&amp;D Systems社のTNF alphaタンパク質を使用しました。ELI AアッセイにはR&amp;D Systems社の抗体ペアを使用しましたが、XapアッセイではR&amp;D Systems社の捕捉抗体と、R&amp;D Systems社またはMillipore社のいずれかの検出抗体を使用しました。R&amp;D Systems社のTNF alphaタンパク質を希釈し、8,000から4 pg/mLまでの濃度範囲を作成しました。R&amp;D Systems社の抗体ペアを用いたXapアッセイでは、図に示すように20,000 MFIを超える応答が得られ、期待通りの結果となりました。R&amp;D Systems社の検出抗体の代わりにMillipore社の検出抗体をXapアッセイに使用したところ、応答はR&amp;D Systems社の検出抗体で得られた応答の約30%でした。このチャートの緑色の線はELAの標準曲線を表しており、メーカー推奨のTNF alpha範囲は16から1000 picograms per milliliterでした。分光光度計の制限により、ELISAアッセイの範囲を広げることは不可能でした。さらに、両手法のダイナミックレンジと感度は、対数スケールでプロットするとより明確に示されます。EISAの応答の傾きとxapアッセイの応答の間には明確な差が見られ、高濃度および低濃度の両方において、ELizaによるTNF alphaの検出能がより限定的であることがさらに示唆されます。2つの機能的TNF alpha xapアッセイにおける検出限界（LOD）は、バックグラウンドに6回の反復測定による標準偏差（SD）の3倍を加えた値よりも高い応答レベルが観察された、最低のTNF alpha濃度を特定することで近似されました。ここで、R&amp;D Systems社のペアを用いた場合、TNF alphaの最低濃度である3.91 pg/mLにおいて66 MFIの応答が得られ、これが背景値に3 SDを加えた値よりも大きく、この基準を満たしていることが観察できます。Millipore社の検出抗体をR&amp;D Systems社の捕捉抗体と組み合わせて使用した場合、検出限界は7.81 pg/mL未満でした。この例では、許容可能な応答として得られた2番目に低いTNF alpha濃度が、最も低いTNF alpha濃度の応答にその標準偏差の3倍を加えた値よりも17 MFI高い値を示しました。同様に、r and d systems duo set Elizaの検出限界は63～31 picograms per milliliterの間であると推定されました。この手順に従い、xapアッセイをさらに最適化するために、さまざまなサンプルマトリックスやレポーター中の抗体濃度の試験などの他のステップを実施することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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このビデオでは、交差反応性のないマルチプレックスサンドイッチ免疫測定法のためのスナップチップ技術の実装を紹介しています。それぞれ異なる試薬を含む2つのマイクロアレイスライドをスナップする簡単な操作で、クロスコンタミネーションなしで試薬の移動が保証され、サンドイッチイムノアッセイを使用して複数のタンパク質を検出するのに役立ちます。...

交差反応性のない多重化サンドイッチ免疫測定法のためのスナップチップ技術

このビデオは、異なるセットに染色されたカルボキシル化磁性ポリスチレン微小球を使用した多重化された定量的細菌検出を示しています。この手順には、ビーズ-バクテリア複合体の形成、磁気分離、およびフローベースの分析が含まれ、同じ反応ウェル内の複数のバクテリアの正確かつ同時定量が可能になります。...

色素標識磁性ミクロスフェアを用いたマルチプレックス定量的細菌検出

複雑な生体試料中のバイオマーカーの測定はますます意思決定臨床指導されています。私たちは、同時に心臓ミオシン結合タンパク質C、クレアチンキナーゼMB、および心筋梗塞と健常者の被験者からの血清サンプル中の心筋トロポニンIを測定する高感度な方法を説明します。...

電気化学発光免疫測定法により血清心臓ミオシン結合タンパク質-Cの定量のための高感度で特異的な定量法

現在の資源不足の状況では、研究者がより安価に、より速く、より正確に研究を行うことを可能にする新しい技術が出現しています。ここでは、複数の環境病原体へのヒトの曝露を同時に測定するためのビーズベースの唾液抗体マルチプレックス免疫測定法の開発について説明します。...

環境病原体に対するヒトの暴露を測定するために唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイの開発

単に 2 つのスライドをスナップすることによって十字反応性無料多重サンドイッチ免疫測定を実行するためのスナップ チップ技術を紹介します。スナップの装置は、マイクロ アレイ-マイクロ アレイから試薬を確実に転送するために使用されます。スナップ...

架橋反応性無料、スポッター無料多重サンドイッチ免疫測定用チップをスナップします。

7つの自己抗体アッセイを組み合わせた単純なマルチプレックスECLアッセイをモデル化します。このアッセイは、T1Dと、セリアック病、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性多腺症候群など、他の複数の自己免疫疾患を同時にスクリーニングすることができます1。...

1型糖尿病と複数の自己免疫疾患を同時にスクリーニングするハイスループット電気化学発光7-Plexアッセイ

SARS-CoV-2の中和IgGおよびIgM抗体を同時に測定できる多重血清および抗体中和アッセイの開発には、2レポーターの読み出しを提供するビーズベースの多重化アッセイのフロー分析システムが使用されました。...

多重化ビードベースの流れ分析システムのための高速多重デュアルレポーターIgGおよびIgM SARS-CoV-2中和アッセイ

1型糖尿病、セリアック病、コロナウイルス病2019のスクリーニングの緊急の必要性に沿って、4つの膵島自己抗体、組織トランスグルタミナーゼ自己抗体、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2の受容体結合ドメインに対する抗体をすべて同時に検出するハイスループット6-Plex電気化学発光アッセイを開発しました。...

1型糖尿病、セリアック病、およびCOVID-19のハイスループット多重化スクリーニング

3チャンネルデュアルレポーター蛍光フロー分析システムを使用して、ヨーロッパおよび北米でライムボレリア症を引き起こす異なる ボレリア...

マルチプレックス血清学的検査における異なる抗体クラスの同時検出(英語)

学ぶ 捕捉ELISAをLuminex XMAPアッセイに変換する方法。TNFアルファサイトカイン検出のため、複数抗体ペアを同時スクリーニングし、感度とダイナミックレンジを向上させる技術を解説します。

多重抗体スクリーニング法を用いたLuminex XMAPアッセイへの捕捉ELISAの変換

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