多重抗体スクリーニング法を用いたLuminex XMAPアッセイへの捕捉ELISAの変換

次の実験の全体的な目標は、TNF Alphaサイトカインの最適化されたElizaアッセイをXapプラットフォームに変換し、代替抗体ペアを評価することです。これは、ELIZAキットの捕捉抗体を、他の3つの候補捕捉抗体とともに、4つの異なるマイクロスフェアまたはビーズセットに結合することで達成されます。これらの4つのセットにより、4つの候補すべてと4つの別々の検出抗体を同時に試験し、最適な抗体ペアを決定することができます。

次の2つのXapアッセイは、最も最適な2つの抗体ペアで構築されます。次に、アッセイの性能を、シグナル強度、ダイナミックレンジ、感度に関して元のEISAアッセイの性能と比較します。その結果、同じ条件下では類似の抗体でも非常に異なる性能を発揮すること、およびLuminex Xapアッセイを使用して複数の抗体を同時にスクリーニングできることが示され、EISAと比較してこのアッセイの感度とダイナミックレンジが向上することが明らかになりました。

この手法がEIS Aのような既存の方法よりも優れている点は、xapベースのイムノアッセイにより、研究者が複数のターゲットを試験したり、今回のように複数の抗体を同時に試験したりできることです。実証された最良の抗体を特定するため。手術は、Luminex CorporationのアソシエイトサイエンティストであるErica Lopez氏が務めます。

このプロトコルは、書面によるプロトコルに記載されているように、4つの捕捉抗体およびヒトTNFαに特異的な4つの検出抗体の選択および調製から開始します。また、捕捉抗体の宿主種に特異的な確認用抗体を1種類調製してください。抗体カップリングキットの試薬を室温に戻します。

4本の反応チューブに、カップリング反応用に選択したビーズ領域番号をラベル付けします。mag plexマイクロスフェアの4つのバイアルの内容物を4つの標識反応チューブに移します。各ビーズセットを500マイクロリットルの活性化バッファーで2回洗浄し、抗体カップリングキットに記載されているように、各ビーズセットをサルフONHSおよびEDC溶液で活性化します。

ユーザーマニュアル ローテーターで20分間インキュベートした後、活性化したビーズで前の洗浄ステップを500マイクロリットルの活性化バッファーで合計3回繰り返します。洗浄ごとに、4つの別々の500マイクロリットル溶液を準備します。それぞれに7.5マイクログラムの捕捉抗体不活化緩衝液が含まれています。

これら4つの捕捉抗体溶液をそれぞれの反応チューブに加えます。各チューブをすぐにボルテックスし、ローテーターで2時間インキュベートします。抗体カップリングキットに含まれている500マイクロリットルの洗浄バッファーを使用して、now couple ビーズで洗浄ステップを合計3回繰り返します。

最終洗浄ステップの後、各反応チューブに500マイクロリットルの洗浄緩衝液を添加して、1ミリリットルの渦あたり500万個の抗体結合ビーズの最終ストック濃度を提供し、次に反応チューブを超音波処理してビーズを分散させます。カップリング反応後に回収されたビーズの数を、セルカウンターまたはヘモサイトメーターでカウントします。カップリング反応からの回収率は通常90%以上ですアッセイバッファー中にマイクロリットルあたり100ビーズの最終濃度で各セットのカップリングビーズストックの試験溶液を準備し、FICOラベル付けされた抗剤種の希釈を準備することにより、カップリング反応が成功したことを確認します。

アッセイバッファー中のミリリットルあたり4マイクログラムのIgG確認抗体は、各試験溶液の50マイクロリットルを丸底96ウェルプレートの4つのウェルに分注し、合計16ウェルにします。次に、50マイクロリットルのアッセイバッファーを8つのウェルに加えてバックグラウンドを測定し、50マイクロリットルの希釈確認抗体を残りの8つのウェルに添加します。マルチチャンネルピペッターで数回ピペッティングして、反応を穏やかに混合します。

プレートを覆い、プレートシェーカーで室温で30分間インキュベートします。プレートを磁気プレートセパレーターに1〜2分間置き、ビーズを溶液から引き出します。次に、廃棄物レセプタクルの上のセパレーターでプレートを強制的に反転させて液体を取り除きます。

100 μリットルのアッセイバッファーを加え、同様の方法でプレートからSANEを除去して、各ウェルを2回洗浄します。磁気プレートセパレーターを使用して、マルチチャンネルピペッターで5回静かにピペッティングして、ビーズを100マイクロリットルのアッセイバッファーに再懸濁します。magix装置などのluminex xap装置で分析します。

この反応の蛍光シグナルの強度は、ビーズの表面上のタンパク質の量に正比例するため、ビーズに結合したタンパク質の相対量を迅速に評価できます。xapアッセイで最も効果的な抗体ペアを決定するには、0.96ミリリットルのアッセイバッファーにそれぞれ10マイクロリットルを添加して、4つのビーズセットすべての初期混合物を調製します。アッセイバッファー中で各抗体を1ミリリットルあたり1マイクログラムに希釈して、検出抗体溶液を調製します。

また、アッセイバッファー。rおよびdシステムTNFアルファタンパク質標準試料を2000ピコグラム/ミリリットルで調製し、ストレプトアビジンR FICOエリンを8マイクログラム/ミリリットルに希釈します。スクリーニングアッセイのために、CoStar丸底96ウェルプレートの16ウェルのそれぞれに50マイクロリットルの抗体結合ビーズ混合物を添加します。

次に、50マイクロリットルのアッセイバッファーを16ウェルのうち8ウェルに添加してバックグラウンドを測定します。次に、TNFアルファ標準の50マイクロリットルを他の8つのウェルにピペットで移動し、応答を測定します。アッセイプレートシェーカーで振とうしながら、光から保護された室温で1時間インキュベートします。

次に、4つの検出抗体のそれぞれ50マイクロリットルを4つのウェル(そのうちの2つはバックグラウンドウェル、そのうちの2つはレスポンスウェル)に加えます。50マイクロリットルのSAPE試薬をすべてのウェルに添加した後、同じ条件下で30分間インキュベートします。同じ条件で再度15分間インキュベートします。

プレートを磁気プレートセパレーターに1分間置きます。次に、廃棄物レセプタクルの上のセパレーターでプレートを強制的に反転させて液体を取り除きます。100マイクロリットルのアッセイバッファーを16個のウェルのそれぞれにピペットで移します。

次に、磁気分離を使用してビーズから液体を取り除きます。次に、100マイクロリットルのアッセイバッファーを16個のウェルのそれぞれに加えます。Luminexマグピック機器でプレートを読み取り、適切な操作のためにユーザーズマニュアルを参照してください。

目的のシグナル強度を満たす抗体ペアを選択します。抗体を捕捉するのに最適なものを選択した後、その抗体結合ビートストックの100マイクロリットルをアッセイバッファーで10ミリリットルに希釈します。希釈したビーズ50マイクロリットルを、2つのCoStar丸底96ウェルプレートの78ウェルに加えます。

各プレートは、異なる検出抗体の性能を評価するために使用されます。次に、ミリリットルあたり8, 000ピコグラムから始まり、ミリリットルあたり4ピコグラムで終わる12ポイントの標準曲線を準備します。rおよびdシステムを使用します。

TNF Alpha標準試料は、各希釈液の50マイクロリットルの複製を各プレートに加え、さらに50マイクロリットルのアッセイバッファーをバックグラウンドとして6つのウェルを添加し、プレートあたり合計78ウェルを添加します。アッセイプレートシェーカーで振とうしながら、光から保護された室温でプレートを1時間インキュベートします。次に、50マイクロリットルのファースト検出抗体をファーストプレートの78ウェルすべてに加えます。

2枚目のプレート上の2回目の検出抗体についても繰り返します。同じ条件下でプレートを30分間インキュベートします。次に、50マイクロリットルのSAPE試薬を各プレートのすべてのウェルに加えます。

2枚のプレートを光から保護して15分間振とうした後、プレートを磁気プレートセパレーターに1分間置きます。廃棄物レセプタクルの上のセパレーターでプレートを強制的に反転させて、液体を取り除きます。次に、100マイクロリットルのアッセイバッファーをプレート上の78ウェルのそれぞれにピペットで注入し、磁気ビーズから液体を除去する前である。

プレート上の78ウェルのそれぞれのビーズに100マイクロリットルのアッセイバッファーを追加した後、ユーザーズマニュアルを参照してマグピック装置でプレートを分析し、適切な操作を行います。Rおよびdシステムに含まれている指示に従って、人間TNF Alpha T NF SF one a DUOセットELI Aキット。rおよびdキットに付属の標準によって生成される応答を測定します。

ELI aアッセイをさらに3回繰り返し、rおよびdシステムのキャプチャー抗体と検出抗体を他のベンダーの抗体に置き換えます。簡単にするために、抗体をベンダーごとにペアリングし、EISAフォーマットの要求に応じて、3つのTNF Alphaタンパク質スタンダードのそれぞれと各ペアを個別に評価します。Luminex Xapアッセイは、Mag PLXマイクロスフェアに結合した4セットのTNFアルファ抗体を組み合わせることにより、4つの捕捉抗体すべてを混合物として評価するためのマルチプレックスとして実施され、捕捉抗体は、4つのビオチン化検出抗体のそれぞれと個別に評価され、1つの検出抗体と4つの捕捉抗体のそれぞれとの相互作用を同時に決定することができた。

その結果、r および d 系 DUO セットの抗体ペアは、蛍光強度の中央値 6, 183 または MFI 単位で応答が得られ、最高のパフォーマンスを発揮したことが示されました。また、MilliporeおよびABAMからの検出抗体は、RDシステム捕捉抗体と組み合わせた場合、XAPアッセイにおいて妥当な応答を提供し、Millipore、ACAMおよびNovusからの捕捉抗体は、XAPアッセイにおいて望ましくない応答を生じさせることが観察された。r and d systems DUO set プロトコルを使用して、EISA 形式で 4 つの抗体ペアを比較しました。

r and d システムプロトコルは、今日広く使用されている典型的な EIA プロトコルを反映しており、xap テクノロジーで使用されるプロトコルに類似しているため、すべての抗体ペアで使用されました。EISA試験では、r系とd系の抗体ペアが再び最良の結果をもたらしたことが示されました。Acamの抗体ペアは応答を示さず、MilliporeとNovasの抗体ペアは、抗体反応性の変動を評価するために控えめな応答を示しました。

この標準試料では、4つの抗体ペアすべてを、3つの異なるベンダーの3つの異なる組換えTNFアルファタンパク質標準試料で試験しました。このデータは、3 つのベンダーの組換え TNF アルファタンパク質標準試料が同等の結果をもたらしたことを示しています。r および d システムからの TNF α タンパク質を使用して、ELSA および XAP アッセイで標準曲線を生成しました。

ELI Aアッセイはr系とd系の抗体ペアで行われましたが、xapアッセイでは、r系とd系の捕捉抗体と、r系とd系またはMilliporeからの検出抗体を利用しました。rおよびdシステムからのTNFアルファタンパク質を希釈して、ミリリットルあたり8,000〜4ピコグラムの範囲の濃度を生成しました。r および d システムからの抗体ペアは、Xap アッセイで期待される結果をもたらし、図に示すように 20, 000 MFI を超える応答を示しました。

ミリポア由来の検出抗体を R/D 系検出抗体の代わりに Xap アッセイと併用した場合、反応は RD 系の検出抗体で得られた反応の約 30% でした。このグラフの緑色の線は、メーカーが推奨するTNFアルファ範囲が16〜1000ピコグラム/ミリリットルであったELAの標準曲線を表しています。分光光度計の限界により、Elizaアッセイの範囲を広げることはできませんでした。

さらに、両方の方法のダイナミックレンジと感度は、対数スケールでプロットするとよりよくわかります。EISAレスポンスの傾きとxapアッセイからのレスポンスとの間には明確な違いが見られ、さらに、EL izaによるTNFアルファの検出能力が高濃度と低濃度の両方でより限定的であることを示しています。2 つの機能的 TNF alpha xap アッセイの検出限界または LOD は、観察されたレスポンスレベルがバックグラウンドよりも高く、さらに 6 回の繰り返しからその標準偏差または SD の 3 倍が加算された最低の TNF アルファ濃度を特定することによって近似されました。

ここでは、r システムと d システムのペアを使用した場合、3.91 ピコグラム/ミリリットルの最低 TNF アルファ濃度で 66 MFI の応答が得られ、これはバックグラウンドと 3 つの SD ミーティングの応答よりも大きいことがわかります。この基準。ミリポア検出抗体をrおよびdシステムキャプチャ抗体と併用した場合、検出限界は1ミリリットルあたり7.81ピコグラム未満でした。

この場合、2 番目に低い TNF アルファ濃度は、最も低い TNF アルファ濃度の応答に標準偏差の 3 倍を加えた値よりも大きい 17 MFI の許容応答で生成されます。同様に、r系とd系のデュオセットElizaの検出限界は、ミリリットルあたり63〜31ピコグラムと推定されました。この手順に続いて、xapアッセイをさらに最適化するために、テスト、さまざまなサンプルマトリックス、レポーター内の抗体濃度などの他のステップを実行できます。