CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

これはMax MIDIマグネットです。「注意：極めて強力な磁場」と記載されています。こんにちは。カリフォルニア大学アーバイン校生理学・生物物理学部のMike Collins研究室のMelanie Matthewです。

本日は、Milteni Biotec社のキットを用いたCD4陽性T細胞の陰性選択調製法について解説します。ここでは、MiniMACSとMACSマグネットを用意しています。MiniMACSは大規模な分離に使用され、MiniMACSに適合するカラムを用いて最大10⁹個の細胞を処理できます。一方、MACSマグネットはより少量の細胞分離に使用されます。

したがって、ポジティブセレクションを行うかネガティブセレクションを行うかに応じて、適切な抗体で細胞を標識します。抗体には磁気ビーズが付着しており、これが磁石に捕捉されます。ネガティブセレクションの場合、目的の細胞はカラムを通過するため、目的の細胞を含む溶出液を回収することができます。

今夜ご紹介する手法は、無菌操作ではないことに注意してください。そのため、これらの細胞を細胞培養に使用したい場合は、すべて無菌器具を用いてティッシュカルチャーフード内で行う必要があります。ここではCD4陽性T細胞の調製について示していますが、これらの手法の多くは、Miltenyi Biotec社のキットを用いた他の細胞種の精製にも適用可能です。

マウスからリンパ節を摘出しました。この手順の詳細については、JoVEの第7回「2光子イメージングのためのリンパ節調製」で解説しています。次に、70 µmのセルストレーナーを用いて、リンパ節を単細胞懸濁液になるまで研磨します。それでは、6 mLシリンジの背面を使用して、リンパ節を単細胞懸濁液に研磨していきます。

リンパ節はフィルターの中でRPMIに浸されており、適切な単一細胞懸濁液を作成することが重要です。フィルターを使用する理由は、細胞の凝集がないことを確認するためです。すり潰しが終わったら、フィルターを培地から取り出し、ストレーナーを通過した単一細胞懸濁液を使用します。

研磨を行う際は、組織を可能な限り十分に破砕するようにしてください。この単一細胞懸濁液から、CD4陽性T細胞を精製します。さて、組織の研磨が完了し、リンパ節のほとんどがほぼ消失したことが確認できます。

ここには、6つのリンパ節すべてから凝集した少量の脂肪組織や、少量の結合組織を含むリンパ節の被膜のようなものがまだ残っています。ここでセルストレーナーを取り除きます。メディアが非常に濁っているのがわかります。

フィルターから最大限の細胞を回収し、一部がフィルターに付着するのを防ぐため、単一細胞懸濁液で満たします。数 mL の培地で洗浄した後、すべての培地を 15 mL Falcon チューブにピペットで移し、遠心分離して細胞をペレット化し、後続の精製工程に備えます。これで、300 G で 10 分間遠心分離してペレット化した単一細胞懸濁液が準備できました。

単一細胞懸濁液中に死細胞が多く含まれると考えられる場合は、Miltenyi Biotec社の死細胞除去キットを使用することをお勧めします。ペレット化したので、培地を捨てて赤血球溶血を行い、その後、細胞数をカウントしてから、これらの細胞に対してCD4陽性T細胞のネガティブセレクションキットを使用します。それでは、赤血球溶血を行います。

リンパ球とともにペレット化した赤血球を溶血させます。まず水を加えて溶液の浸透圧を下げ、その後10X-DBPSを加えて1X溶液に戻すことで溶血を行います。リンパ球は赤血球よりも浸透圧の変化に耐性がありますが、迅速に作業しなければリンパ球まで溶血させてしまうため、注意が必要です。迅速に作業するため、実際にシステムに水を加える前に、溶血に必要な液量をあらかじめ準備しておきます。

リンパ球の溶解を防ぎ、赤血球のみを溶解させるため、水を加えた数秒後に10 X-D-B-P-Sを添加するようにします。具体的には、900 µLの水（ほぼ1 mL）に、100 µLの10 X-D-B-P-Sを加えます。

両方のパイプの準備ができています。溶解の際、まず水を加え、数秒待ってからチューブを軽く振り、次に10 X-D-B-P-Sを加えて、さらにチューブを軽く振ります。溶解させる赤血球が大量にある場合、破壊された細胞膜によって、大きな無定形の塊のようなものが形成されるのがわかります。

ここに少量ありますが、細胞膜が少し壊れているのがわかります。溶解処理を行った後、ピペッティングにミスがあった場合に備え、浸透圧を適切に調整し、さらなる溶解が進まないようにするために、培地を数mL添加します。これで、リンパ球の単一細胞懸濁液が準備できました。

再度、赤血球溶血を行い、遠心分離してペレット化します。その前に、ヘモサイトメーターで細胞数をカウントし、CD4陽性T細胞ネガティブセレクションキットに使用する抗体量を決定します。それでは、MAXバッファーで細胞を遠心分離します。赤血球溶血後、ペレットがより白くなっていることがわかります。

次に、CD4陽性T細胞のネガティブセレクションを行います。まず、細胞を遠心沈殿させた際の培地およびMAXバッファーをすべて捨てます。そして、CD4陽性T細胞のネガティブセレクションのステップ1である、ビオチン抗体カクテルによるラベル付けを行います。

その後、冷蔵庫で10分間インキュベートします。これで細胞の初期インキュベートが完了しました。次に、抗生物質を付着させたマイクロビーズを加え、再び冷蔵庫で15分間インキュベートします。

今回の細胞分離では、Miltenyi Biotec社のLSカラムを使用します。まず、磁気ホルダーにカラムをセットし、3 mLのMACSバッファーを流してカラムの準備を行います。カラムを開き、突起部分が磁石の内側を向くように配置します。次に、LSカラムにMACSバッファーを添加します。バッファーがカラムを通り、下端から滴下し始めるのが確認できます。カラム内が空になっても問題ありません。

液体の表面張力により、細胞を添加するまで液体が干上がりすることはありません。細胞を添加する前に、MAXバッファーがカラム全体に完全に浸透するようにすることが重要です。さて、biotin磁気ビーズ、細胞、およびMAXバッファーを用いて15分間インキュベートした後、バッファーを捨て、細胞数に適した量のバッファーで再懸濁します。

そのため、Mini Tinyプロトコルを確認してください。次に、Maxバッファーで洗浄したばかりのカラムに、細胞懸濁液を適用します。それでは、細胞懸濁液をカラムに添加しましょう。

これはネガティブセレクションカラムであるため、通り抜けた細胞を回収します。今回のケースでは、これらがすべてCD4陽性T細胞となるはずです。ここで、12 mLのMACSバッファーでカラムを洗浄し、CD4陽性T細胞のみが含まれているはずの溶出液を回収します。次に、CD4陽性T細胞を遠心分離して回収し、再懸濁させた後、tauイメージングに使用する適切な染料でラベル化します。

また、精製した細胞から少量のサンプルを採取し、anti CD3およびanti CD4で染色した後、FACSにかけ、CD4陽性T細胞の純粋な集団が得られているかを確認します。こちらが、今遠心分離した細胞の様子です。これは、純粋なCD3およびCD4陽性T細胞の集団であるはずです。

以上が、CD4陽性T細胞のネガティブセレクションの手順でした。Milit tiny biotechキットを用いてこれらの細胞をマウスに養子移入し、自験のT-cell photon machine実験に使用します。皆様の実験の成功をお祈りいたします。