CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

これはMax MIDIマグネットです。「注意：極めて強力な磁場」と記載されています。こんにちは、カリフォルニア大学アーバイン校生理学・生物物理学部のMike Collins研究室のMelanie Matthewです。

本日は、Miltenyi Biotec社のキットを用いたCD4陽性T細胞の陰性選択調製法について解説します。ここにあるのがMiniMACSとMACS Magnetで、MiniMACSはより大規模な分離に使用されます。MiniMACSに適合するカラムでは、最大10⁹個の細胞を処理することが可能です。一方、MACS Magnetは、より少量の細胞サンプルに使用されます。

したがって、陽性分離を行うか陰性分離を行うかに応じて、適切な抗体で細胞をラベルします。これらの抗体には磁気ビーズが付着しており、磁石に結合します。陰性選択の場合、目的の細胞はカラムを通過するため、目的の細胞を含む溶出液を回収することができます。

今夜ご紹介する手法は、無菌操作ではないことにご注意ください。したがって、これらの細胞を細胞培養に使用する場合は、組織培養用フード内で滅菌済みの器具を用いてすべて行ってください。今回はCD4陽性T細胞の調製についてお見せしますが、これらの手法の多くは、Miltenyi Biotec社のキットを用いた他の細胞型の精製にも適用可能です。

マウスからリンパ節を摘出しました。この手順の詳細については、JoVEの第7号「2光子イメージングのためのリンパ節調製」で解説しています。これから、70 µmのセルストレーナーを用いて、リンパ節を単一細胞懸濁液にまで摩砕します。それでは、6 mLシリンジの背面を使用して、リンパ節を単一細胞懸濁液に摩砕していきます。

リンパ節をフィルターに入れたRPMIに浸しています。適切な単一細胞懸濁液を作成することが重要です。フィルターを使用する理由は、細胞の凝集がないことを確実にするためです。すり潰しが終わったら、フィルターを培地から取り出し、ストレーナーを通過したすべての細胞、すなわち単一細胞懸濁液を使用します。

組織をすりつぶす際は、可能な限りすべての組織を十分に分散させるようにしてください。この単一細胞懸濁液から、CD4陽性T細胞を精製します。組織のすりつぶしが完了し、リンパ節の大部分が消失したことが確認できます。

ここには、6つのリンパ節すべてから集まった、少量の脂肪組織とリンパ節の被膜のようなもの、および少量の結合組織が凝集して残っています。ここでセルストレーナーを取り除きます。すると、培地が非常に濁っていることがわかります。

フィルターから最大限の数の細胞を回収し、一部がフィルターに付着することを考慮して、単一細胞懸濁液を十分に満たします。数mLの培地で洗浄した後、すべての培地を15 mLのFalconチューブにピペットで移し、後の精製に向けて細胞をペレット化するために遠心分離します。これが、300 Gで10分間遠心分離してペレット化した単一細胞懸濁液です。

単一細胞懸濁液中の死細胞数が多いと予想される場合は、Miltenyi Biotec社の死細胞除去キットを使用することをお勧めします。ペレット化したので、培地を捨てて赤血球溶血を行い、その後、細胞数をカウントしてから、これらの特定の細胞に対してCD4陽性T細胞のネガティブセレクションキットを使用します。それでは、赤血球溶血を行います。

リンパ球とともにペレット化した赤血球を溶解させます。まず水を加えて溶液の浸透圧を下げ、その後10 X-D-B-P-Sを加えて1 x溶液に戻すことで溶解を行います。リンパ球は赤血球よりも浸透圧の変化に耐性がありますが、迅速に作業しないとリンパ球まで溶解させてしまうため、注意が必要です。迅速に作業を行うため、システムに水を加える前に、溶解に必要な液量をあらかじめ分注しておきます。

リンパ球を溶解させず、赤血球のみを確実に溶解させるため、水を加えた数秒後に10 X-D-B-P-Sを添加できるようにします。具体的には、水900 µL（ほぼ1 mL）に、10 X-D-B-P-Sを100 µL加えます。

両方のパイペットを準備しておきます。溶菌の際、水を加え、数秒待ってからチューブを軽く振り、次に10 X-D-B-P-Sを加えて、さらにチューブを軽く振ります。溶菌させる赤血球が大量にある場合、破壊された細胞膜が集まり、大きな無定形のような塊が形成されるのが観察されます。

ここに少量のサンプルがありますが、細胞膜がわずかに破砕されているのがわかります。したがって、ライシス（細胞溶解）を行った後、ピペッティングにミスがあった場合に備えて、浸透圧を適切に調整し、それ以上の溶解が進まないようにするために、培地を数mL添加するようにしています。これで、リンパ球の単一細胞懸濁液が準備できました。

再度、赤血球溶解を行い、遠心分離してペレット化します。その前に、ヘモサイトメーターで細胞数をカウントし、CD4陽性T細胞ネガティブセレクションキットに使用する抗体量を決定します。さて、MAXバッファーで細胞を遠心分離しました。赤血球溶解後、ペレットがより白くなっていることがわかります。

続いて、CD4陽性T細胞のネガティブセレクションを行います。まず、細胞を遠心分離した際に使用した培地およびMACSバッファーをすべて捨てます。次に、CD4陽性T細胞のネガティブセレクションのステップ1である、ビオチン抗体カクテルによるラベル化を行います。

その後、冷蔵庫で10分間インキュベートします。これで細胞の初期インキュベートが完了しました。次に、抗生物質を結合させたマイクロビーズを添加し、再び冷蔵庫で15分間インキュベートします。

今回の細胞分離には、Miltenyi Biotec社のLSカラムを使用します。まず、カラムをマグネットホルダーにセットし、3 mLのMACSバッファーを流してカラムの調製を行います。カラムを開き、突起部分がマグネットの内側を向くように配置します。次に、カラムにMACSバッファーを添加します。バッファーがLSカラムを通り、底から滴下し始めるのが確認できます。カラム内が完全に空になっても問題ありません。

液体の表面張力により、細胞を添加するまで乾燥することはありません。細胞を添加する前に、Maxバッファーをカラムに完全に浸透させることが重要です。さて、biotin磁気ビーズ、細胞、およびMaxバッファーを用いて15分間のインキュベーションを行った後、バッファーを捨て、細胞数に適した量のバッファーで再懸濁します。

そのためには、ご使用のmilli tinyプロトコルを確認してください。次に、Maxバッファーで洗浄したばかりのカラムに細胞懸濁液を適用します。それでは、カラムに細胞懸濁液を加えます。

これはネガティブセレクションカラムであるため、通り抜けてきた細胞を回収します。この場合、回収された細胞はすべてCD4陽性T細胞であるはずです。ここで、カラムを12 mLのMAC bufferで洗浄し、同様に、CD4陽性T細胞のみを含むはずの溶出液を回収します。次に、CD4陽性T細胞を遠心分離で回収し、再懸濁させた後、tauイメージングに使用する適切な染料でラベル付けします。

また、精製した細胞の少量のサンプルを採取し、anti CD3およびanti CD4でラベル付けして FACS にかけ、CD4 陽性 T 細胞の純粋な集団が得られているかを確認します。こちらが、いま遠心分離した細胞です。これは純粋な CD3、CD4 陽性 T 細胞の集団であるはずです。

以上で、CD4陽性T細胞のネガティブセレクションについて説明しました。Miltenyi Biotec社のキットを用いてこれらの細胞をマウスに養子移殖し、独自のT-cell receptor（TCR）およびMHC実験に使用します。皆様のご研究の成功をお祈りしております。