Name: CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:34:55.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学ぶマウスリンパ節からCD4+T細胞をMiltenyi MACSキットで負選択精製する方法。96%以上の高純度で細胞を分離し、免疫学研究や細胞培養前処理に応用できます。

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我々は、MACSバッファーの調製のためのレベッカPaquettに感謝します。

で国内でのみ有効キットまたはオンラインに含まれるプロトコル読み、その指示に従ってください<a href="http://www.miltenyibiotec.com/">http://www.miltenyibiotec.com/を</a> 。

<ol><li>Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+repertoire+scanning+is+promoted+by+dynamic+dendritic+cell+behavior+and+random+T+cell+motility+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).</li>
<li>Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+IA+phosphoinositide+3-kinase+modulates+basal+lymphocyte+motility+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node.</a> J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

一次ソースからの細胞の分離には多くの複雑なプロトコルにするために必要なステップです。ミルテニーは、ヒト、非ヒト霊長類、ラットと、我々がここで説明するように、マウスを含め、いくつかの生物から細胞を単離するキットを提供しています。磁気ビーズをベースの細胞分離には、ポジティブ選択（または細胞の枯渇）と同様に負の選択のどちらかが可能になります。ここで、我々はそのまままたはNA VEのCD4 +ヘルパーT細胞の負の選択を示しています。この標準プロトコルを使用して、我々は通常、≥96パーセント純粋なCD4 + / CD3 +である細胞を精製する。我々はこのプロトコルのビデオでFACS分析を示すしなかったが、それは非常にFACSを経由して適切な抗体を用いて単離された細胞の全体的な純度をチェックすることをお勧めします。さらに、我々はT細胞の分離の非滅菌方法を示しています。無菌細胞が特定のエンドユーザーのアプリケーションに必要な場合は、標準的な無菌条件下で組織培養フードに示した手順のすべてを行ってください。

<table><tbody><tr><td>MACSバッファー</td><td>試薬</td><td>なし</td><td>なし</td><td>Miltenyi社の指示通りに調製すること。</td></tr><tr><td>CD4+ T細胞分離キット：Untouched Isolation</td><td>試薬</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-860</td><td>Miltenyiシステムで使用。</td></tr><tr><td>滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>試薬</td><td></td><td></td><td>MACSバッファーの調製に使用。</td></tr><tr><td>Corning 35mm 非TC処理培養ディッシュ</td><td>その他</td><td>Corning</td><td>430588</td><td>単一細胞懸濁液の調製に使用。</td></tr><tr><td>70 µm セルストレーナー</td><td>器具</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td>単一細胞懸濁液の調製に使用。</td></tr><tr><td>6 mL シリンジ</td><td>器具</td><td>Tyco Healthcare, Covidien</td><td>8881516051</td><td>単一細胞懸濁液の調製に使用。</td></tr><tr><td>10x Dulbecco&amp;rsquo;s リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>14200-075</td><td>赤血球溶血に使用。</td></tr><tr><td>滅菌水</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td>赤血球溶血に使用。</td></tr></tbody></table>

cd4 +ミルテニーmacs精製を使用してマウスのリンパ節からt細胞の分離

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

一次ソースからの細胞の分離には多くの複雑なプロトコルにするために必要なステップです。ミルテニーは、ヒト、非ヒト霊長類、ラットと、我々がここで説明するように、マウスを含め、いくつかの生物から細胞を単離するキットを提供しています。磁気ビーズをベースの細胞分離には、ポジティブ選択（または細胞の枯渇）と同様に負の選択のどちらかが可能になります。ここで、我々はそのまままたはNA VEのCD4 +ヘルパーT細胞の負の選択を示しています。この標準プロトコルを使用して、我々は通常、≥96パーセント純粋なCD4 + / CD3 +である細胞を精製する。このプロトコルは、プロトコルの解剖と養子のイメージングを目的として転送するT細胞と他の細胞型の浄化のために、Joveの第7号に掲載されたマウスの末梢リンパ節の2光子イメージングと組み合わせて使用​​されます。我々はこのプロトコルのビデオでFACS分析を示すしなかったが、それは非常にFACSを経由して適切な抗体を用いて単離された細胞の全体的な純度をチェックすることをお勧めします。さらに、我々はT細胞の分離の非滅菌方法を示しています。無菌細胞が特定のエンドユーザーのアプリケーションに必要な場合は、標準的な無菌条件下で組織培養フードに示した手順のすべてを行ってください。独自の実験を見て、幸運をありがとう！

ミルテニーMACのキットを用いてリンパ球の分離は、全体のリンパ組織のホモジネートから細胞を浄化するために信頼性の高い方法です。国内でのみ有効のシステムを使用して精製した細胞は通常、≥96パーセント純粋です。ここで、我々は、CD4 + T細胞、ミルテニーが提供する多くのキットのいずれかを特定するために行った手順を示します。

CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

一次ソースからの細胞分離は、より複雑な多くのプロトコルにおいて不可欠なステップです。Miltenyi社は、以下のようなさまざまなソースから細胞を分離するためのキットを提供しています。

これはMax MIDIマグネットです。「注意：極めて強力な磁場」と記載されています。こんにちは、カリフォルニア大学アーバイン校生理学・生物物理学部のMike Collins研究室のMelanie Matthewです。本日は、Miltenyi Biotec社のキットを用いたCD4陽性T細胞のネガティブセレクション調製法について解説します。ここではMiniMACSとMACS Magnetを用意しています。MiniMACSは大規模な分離に使用され、MiniMACSに適合するカラムを用いて最大10⁹個までの細胞を処理することが可能です。一方、MACS Magnetはより少量の細胞サンプルに使用されます。したがって、陽性分離を行うか陰性分離を行うかに応じて、適切な抗体で細胞を標識します。これらの抗体には磁性ビーズが付着しており、磁石に吸着します。陰性選択の場合、目的の細胞はカラムを通過するため、目的の細胞を含む溶出液を回収することができます。今夜ご紹介する手法は無菌的な操作ではないことを付け加えておきます。したがって、これらの細胞を細胞培養に使用する場合は、無菌的な器具を用いて、すべて組織培養用フード内で行ってください。今回はCD4陽性T細胞の調製手順をお見せしますが、これらの手法の多くは、Miltenyi Biotec社のキットを用いた他の細胞種の精製にも適用可能です。マウスからリンパ節を摘出しました。この詳細な手順については、JoVEの第7回「2光子イメージングのためのリンパ節調製」で解説しています。次に、70 µmのセルストレーナーを用いて、リンパ節を単一細胞懸濁液にまですり潰します。それでは、6 mLシリンジの背面を使用して、リンパ節を単一細胞懸濁液にすり潰していきます。リンパ節はフィルター内のRPMIに入っており、適切な単一細胞懸濁液を作成することが重要です。フィルターを使用する理由は、細胞の凝集がないことを確認するためです。すり潰しが終わったら、フィルターを培地から取り出し、ストレーナーを通過した単一細胞懸濁液を使用します。すり潰しを行う際は、組織を可能な限り十分に分散させるようにしてください。この単一細胞懸濁液から、CD4陽性T細胞を精製します。さて、組織のすり潰しが完了し、リンパ節の大部分が消失したことが確認できます。ここには、6つのリンパ節すべてから集まった、少量の脂肪組織と、結合組織を伴うリンパ節の被膜のような断片が凝集して残っています。ここでセルストレーナーを取り除きます。すると、培地が非常に濁っているのがわかります。フィルターから最大限の細胞を回収し、一部がフィルターに付着することを考慮して、単一細胞懸濁液を十分に満たします。これを数mLの培地で洗浄し、すべての培地を15 mL Falconチューブにピペッティングして、その後の精製のために細胞

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

マウス肺樹状細胞の高度に精製された調製物が記載されている。特定の重点は、従来の樹状細胞サブセットの分離に与えられます。...

マウス肺樹状細胞の分離

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ヒト末梢血単核細胞からのCD4+ Vδ1+ γδ T細胞の選択的単離

他のT細胞サブセットとは異なるエフェクター機能を持つ、Th17細胞は、中央炎症性自己免疫に関与している。このインビトロのTh17分化プロトコルは、ナイーブCD4 + Tリンパ球は、Th17細胞に分化することができ、さらに自己免疫および宿主応答におけるそれらの役割を検討するかどうかを決定するための手段を提供する。...

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

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ナイーブCD4+ T細胞は、活性化時の環境に応じて、さまざまなサブセットに分極します。 ナイーブCD4+ T細胞の種々のエフェクターサブセットへの分化は、T細胞受容体刺激および特異的サイトカインシグナルの添加により、in vitroで達成することができる。...

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

明確な樹状細胞サブセットは、リンパ器官に稀な集団として存在するため、免疫学的実験に十分な数と純度で単離することが困難です。ここでは、マウス脾臓樹状細胞の現在知られている主要なサブセットをすべて単離するための高効率、高収率の方法について説明します。...

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

腸管関連リンパ組織パイエル排水腸間膜リンパ節など誘導サイトと粘膜を含むエフェクター...

マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

ここでは、磁気細胞選別と素朴なマウスにそれに続く養子転送によるマウス脾臓から樹状細胞を分離するためのプロトコルを提案する.高食塩活性化樹状細胞のモデルは、養子の転送とフローサイトメトリーのステップバイ...

分離と養子伝高塩処理樹状細胞の抗原提示

二光子イメージングには、基礎条件の下でリンパ節内および免疫応答1の間にリンパ球運動と細胞間相互作用を明らかにした。ここで、我々はT細胞、リンパ節の分離、およびCD4 +植リンパ節におけるT細胞のイメージング運動の養子移入を示しています。...

解剖とマウスの末梢リンパ節の2 - フォトンイメージング

学ぶマウスリンパ節からCD4+T細胞をMiltenyi MACSキットで負選択精製する方法。96%以上の高純度で細胞を分離し、免疫学研究や細胞培養前処理に応用できます。

CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

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