シナプス蛍光の自動定量 C.エレガンス

この手順の目的は、神経細胞内の点状の蛍光シグナルの大きさおよび輝度を効率的に定量化することです。これにより、大量のオブジェクト群を解析することが可能になります。ここでは、統計的にシナプス蛋白をイメージングします。

このデモンストレーションでは、まず手順の最初のステップとして、対象となるELEGANSの高密度同期培養を生成します。次に、画像間の個体差を最小限に抑えながら、ラベル化されたシナプスの共焦点画像を取得します。シナプスの穿孔は、背景蛍光から自動的に識別および区別されます。

最終ステップは、効率的なダウンストリーム解析のためにデータを表にまとめ、整理することです。最終的に、この結果によって、実験条件がシナプスタンパク質や、高コントラストのパンクチャーに局在するその他のタンパク質の分布にどのように影響するかを正確に示すことができます。Zackプロジェクション解析などの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、シナプス体積を含むすべてのデータが保持されること、そして自動識別によって1条件あたり数百のサンプルを迅速に収集できることです。

このプロトコルでは、NA 22 E. coli菌を含む10 cmの高ペプチドNGMアガープレートで培養し、高密度まで増殖させた成体C. elegansが必要です。予定している免疫染色1回につき1枚のプレートを用意してください。まず、数ミリリットルの水を用いて線虫を回収します。回収した線虫を15 mLコニカルチューブに移し、ほとんどの線虫が回収されるまでこの操作を繰り返します。

線虫をペレット化し、上清が透明になるまで最大3回、水でペレットを洗浄します。これにより、残留した細菌を除去します。線虫や卵が含まれている可能性のある溶液を転送する際は、ガラスに付着する可能性があるため、必ずプラスチックピペットを使用してください。卵の生存率を維持するため、ここからの残りの手順は迅速に行うことが極めて重要です。

5 mLのアルカリ性次亜塩素酸溶液中で線虫の卵を再懸濁させ、卵から線虫を放出させます。チューブを緩やかに揺らしながら、約1分に1回の頻度で解剖顕微鏡下で観察します。5分後、またはチューブ内の線虫の約半分が曲がって破裂したように見えるまでこの操作を継続します。

チューブの上端までエッグバッファーを満たし、数回反転させて混ぜ合わせます。線虫をペレット化した後、上清を吸引して除きます。その後、ペレットをエッグバッファーで3回洗浄します。

洗浄後、Reeseはペレットを5 mLの水に懸濁させ、続いて5 mLの滅菌済み60% sucrose水溶液を加え、よく混ぜ合わせます。懸濁液を遠心分離してペレット化した後、卵は液面に位置し、白濁して見えます。

各卵採取分を、それぞれ播種していない10 centimeterのNGMアガープレートに移します。Xをプレートに洗い出すために水を使用できますが、転送する液量は最小限に抑えるようにしてください。最初の数時間は20 degrees Celsiusで一晩インキュベートします。蓋を少しずらしてプレートを換気させますが、一晩は必ず蓋を閉めてください。

孵化後、L1期幼虫をS basilを満たした15 mLコニカルチューブに回収します。L1期幼虫を遠心分離してペレット化し、最小限の量のS basilで再懸濁させます。その後、各L1期幼虫の回収物を、NA 22細菌を播種した2枚の10 cm NGMアガープレートに等分して分注します。

1日1回または2回、培養状態を確認します。栄養不足になる恐れがある場合は、飢餓状態になる前に新しいNA 22プレートに植え替えてください。飢餓状態になると、タイプN2の収集線が2本形成され、餌の枯渇した領域から波のように一斉に移動し始めます。これらのプレートでは、数時間以内に餌が完全に枯渇します。

線虫が目的の齢に達したら、免疫染色またはライブイメージングのためのマウント準備が整ったことになります。共焦点顕微鏡イメージングを行う場合は、Antifaマウント剤を用いて、密度を1µLあたり数百匹に調整してください。

経験を積めば、この密度は懸濁液の濁度で判断できるようになります。理想的には、顕微鏡スライド上で線虫が高密度に配置され、かつ過度に重なり合っていない状態です。スライド上に、薄いワセリンのリングで囲まれたESP basil中の2%アガロースのパッドを作成します。

イメージング中の蒸発を防ぐため、先端をカットした25ゲージの針を装着した3 mLシリンジを用いてワセリンを塗布します。次に、虫の剪断を防ぐために先端をカットしたピペットチップを使用し、虫の懸濁液を数 µL カバーガラス上にピペットで滴下します。その後、アガロースパッドをカバーガラスの上に載せ、顕微鏡下で虫がパッド上に均一に広がるようにします。目的のシナプスは、レンズに対して正方向または45度以内に向くように配置してください。

フォトブリーチングを避けるため、ここで数秒間時間を置きます。培養および条件を適切に設定すれば、腹側神経索が対物レンズに対して真正面を向いているという、ここに示す理想的な配向という厳格な基準を満たす個体を十分に確保できるはずです。次の個体は、腹側神経索が対物レンズとは反対方向を向いているため、不採用となります。

この標本では、背側索がレンズに向いているため、より鮮明な画像が得られていることに注目してください。こちらは、背側索と腹側索が虫体の端に位置しているため、不採用となる別の例です。この場合、励起光および蛍光がより多くの虫体組織を通過することになり、歪みが生じます。

最大の課題は、処理群内のばらつきを最小限に抑えることであり、個体の齢同期を行い、目的の構造が対物レンズに直接向いている虫を選択することが非常に有効です。大きな培養集団から開始することで、最大限の整合性を得られる個体を選択しやすくなります。最高のイメージング結果を得るには、14枚以下のZスタックで収まる、比較的平坦なサンプルを選択してください。

厚さ0.4 µmの切片を用います。迅速かつ正確なデータ収集には、高速・低解像度の画像で十分です。過剰な信号強度で検出器を飽和させないようにしてください。飽和が起こると、蛍光信号が過小評価される原因となります。

このデモンストレーションでは、市販のソフトウェアパッケージであるvelocity（バージョン4.0以降が必要）を使用します。多くの代替ソフトウェアでは、3次元情報が失われてしまいます。共焦点顕微鏡から出力されたマルチTIFFファイルを開いた後、[image]を選択し、次に[extended focus]、そして[freehand]を選択してください。

ROI（関心領域）を用いて、目的の構造が含まれない画像領域を切り出します。有効化したツールを使用して拡張フォーカス（extended focus）を適用すると、Z平面投影が表示され、ROIの選択が容易になります。これは元のデータには影響しません。

同様に、明るさとコントラストの調整は元のデータに影響しません。「アクション」から「選択範囲をクロップ」を選択して、クロップを完了させます。次に、解析領域の長さを測定します。

ラインツールを使用すると、ラインの長さが計算され、データテーブルに追加されます。次に、測定モードの「強度によるオブジェクト（objects by intensity）」フィルターを使用して、オブジェクトを特定します。固有の色でラベル付けされた独立したシナプスマーカーを含めることで、シナプスを一意に特定しやすくなります。シナプスクラスターが強調され、シナプス以外の背景が強調されないようにしきい値を設定してください。

コントロールサンプルを用いてこの操作を1回のみ行い、その後すべてのサンプルに適用してください。サンプルごとに個別にしきい値を設定することは、実験者のバイアスが導入される可能性があるため、許容されません。オブジェクトは自動的に選択され、表にまとめられます。一般的なシナプスは数ボクセルから数百ボクセルの範囲です。データをエクスポートする前に、オブジェクトのサイズでデータをソートしてください。

これにより、通常は単なる背景のノイズである2ボクセル以下のオブジェクトの後続の除去が容易になります。次に、任意の表計算プログラムで開くことができるCSV形式でデータをエクスポートします。各画像につき1つの出力ファイルが生成されます。記述したプロトコルを用いて、49個のGABA受容体を示すCL gans腹側神経索の顕微鏡写真を整理し、エクスポートしました。

すべての個体は、サイズおよび成熟度において非常に類似していました。5匹の虫の総シナプス蛍光値を、解析した神経索の長さで正規化しました。このデータでは、標準誤差は平均値の約10%でした。

左側の画像は、閾値処理および背景スペック除去を行っていない生データです。シナプスには、長時間曝露により受容体のダウンレギュレーション（発現低下）を引き起こすGABA受容体アゴニストであるmus carmalを処理しました。全蛍光強度を定量し、神経索の長さに合わせて正規化した累積確率として算出しました。

個々のシナプスの蛍光強度のヒストグラムを算出しました。同様に、シナプス体積についても算出しました。これらの測定結果から、アゴニストへの曝露により、シナプス内容物および体積が有意に減少することが示されました。

全体として、定量的な結果は常に視覚的な観察結果を反映している必要があります。もし不一致がある場合は、画像を確認し、速度によって特定された物体を点検することで、どこでエラーが発生したかを明らかにし、閾値の設定やアーティファクトの除去などの修正措置を検討してください。この手順を行う際は、画像の品質という主観的な評価ではなく、幾何学的な向きに基づいてイメージング用のウォームを選択することが極めて重要です。可能な限り、ブラインドスコアリングを行うことが強く推奨されます。