Name: 隔離された両心室ワーキングウサギ心臓のNADH蛍光イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 学ぶNADH蛍光イメージングによる両心室ワーキングウサギ心臓のミトコンドリア酸化還元状態モニタリング法。生理学的灌流条件下で心代謝変化を可視化し、不整脈メカニズム解明に貢献します。

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1。研究のための設定<ol><li> 118のNaCl、3.30のKCl、2.00のCaCl 2、1.20 MgSO 4で 、24.0のNaHCO 3、1.20 KH 2 PO 4、25.4グルコース、2.00 NaPyruvate、アルブミン20.0 mg / Lで：修正クレブス-ヘンゼライト溶液16（mMでの4リットルを準備します。 。）解決策は、可能な限り実験の開始近くに準備する必要があります。 pHは滅菌フィルター（22ミクロン、コーニングの細孔径）の後に7.4に調整する必要があります。溶液の浸透圧は275および295浸透圧/ kgの間でなければなりません。 </li><li>精製水での作業心臓システムのすべてのチューブとチャンバーを洗浄します。すべての水がシステムから削除されるまでポンプを実行します。 </li><li>灌流ポンプ（ランゲンドルフ灌流ポンプ、左心灌流ポンプ、右心灌流ポンプ）の各々の行：セルロースメンブレンフィルター（5μmの、アドバンテックの細孔径）を追加します。 </li><li>各圧力センサの2点キャリブレーション（0〜60 mmHg）を実行します。 </li><li>水浴をオンにします。温水循環水浴（コールパーマー）は、水ジャケット管と熱交換器を温めるために使用されます。灌流液は、別の水浴（Oaktonインスツルメンツ）にあらかじめ温めています。両方のお風呂は37℃の液温を維持するために設定されています</li><li>閉ループでの灌流を循環させるポンプの電源をオンにします。灌流液は、80 kPaの少なくとも95％O 2および5％CO 2でガスのマイクロファイバー人工肺（hemofilters）を通過する。酸素灌流は、心臓のカニューレに入る前に37℃の温度で、それを維持するために熱交換器を通って流れる。 </li></ol> 2。心臓の切除<ol><li>一定の圧力ランゲンドルフモードで動作するように働く心臓システムを設定することによって開始します。 50から60 mmHgの範囲内で大動脈ブロックの圧力を設定します。 </li><li>ケタミン（44 mg / kg）及びキシラジン（10 mg / kg）の筋肉内注射でウサギを麻酔。ウサギ（50ミリグラム/ K、鎮静した後にペントバルビタールg）とヘパリン（2000 U）を静脈内後肢の内側の縁耳静脈または外側伏在静脈を介して注入されています。 </li><li>ウサギが完全に応答しない、痛み反射の欠如によって決定されるように、胸腔が迅速に開かれている場合、心がスライスされ、大動脈をクランプされ、心臓と肺を摘出されています。この時点で肺は肺静脈を隔離を支援するために心臓に接続されたままにしてください。 </li><li> 60mLの灌流液とヘパリンの200ユニットで満たされた注射器に接続されている直径5 mmカニューレと大動脈を分離し、カニューレを挿入。サイズがゼロ絹縫合糸でカニューレを大動脈を確保し、徐々に血の心臓をフラッシュするためのシリンジを押す。 </li></ol> 3。両心室カニューレ<ol><li>ワーキングハートシステムの大動脈ブロックに心を接続します。冠動脈塞栓を引き起こす可能性が大動脈を入力してから空気を防ぐことができます。大動脈BLにカニューレを添付することをお勧めです。斜めの角度で大動脈コネクタに近づいており、それが接続されている間灌流液を穏やかにカニューレにコネクターから滴下できるようにすることで、OCK。 </li><li>心臓が一定の圧力ランゲンドルフモードで灌流されていますが、脂肪と結合組織を除去し、次の船探します。劣ると上大静脈、奇静脈、肺動脈、肺静脈を。 </li><li>上大静脈を連結。ここで、右と左肺動脈に分岐のすぐ下に肺動脈を切った。 </li><li>グループ心臓と肺と1縫合糸を使用してそれらすべてを連結の間に残りのすべての血管（肺静脈）。肺を削除します。 </li><li>左心耳の隅にある小さな穴をカットします。 LAは、灌流液で満たされていることを確認してください。それが挿入されながら、カニューレが完全に灌流液で満たされていることを確認しながらLAをカニューレを挿入。 LAの付属物にカニューレを縫合。 </li><li> tにフローを提供するために、左側のポンプ（ポンプ＃2）をオンにする彼はアトリウムを残しました。 6 mmHgと調整±2 mmHgで、よ​​うに心房拡張によって決定される - 2の間に予圧圧力を設定します。 </li><li>ランゲンドルフポンプ（ポンプ＃1）をオフにすることで、仕事中心モードに心を切り替えます。 </li><li>一時的に10 mmHgに大動脈圧を低下させ、その後徐々に80から100 mmHgの範囲内にそれを増加させます。これは、大動脈弁が開き、それが正常な生理的条件下で同じように機能するようになります。最終的な後負荷圧がLVの収縮に依存します。それはピークLV圧よりも約20 mmHgの小さい値に設定する必要があります。 </li><li> LV心臓の出力は、大動脈ブロック（mL /分）を終了する灌流液の流量を測定することによって決定することができます。正常な心拍出量は、体重17と平均の100グラム2.2キロのウサギ340 mL /分当たり14.77の間と16.43 mL / minである。大動脈圧は、 図1に示す圧力信号のようになります。 </li><li>私を介してRAをカニューレを挿入nferior下大静脈。 RAとカニューレの両方が完全に灌流液で満たされていることを確認し、気泡の形成を防止しながら、カニューレを挿入します。静脈にカニューレを縫合。 </li><li>右心房への流れを提供するために右側のポンプ（ポンプ＃3）をオンにします。約3 mmHgの圧力を設定します。 </li><li> RVは、灌流液で満たされていることを確認し、肺動脈のカニューレを挿入。それは空気の泡を防ぐために挿入されながら、カニューレが完全に灌流液で満たされていることを確認してください。肺動脈にカニューレを縫合。 </li></ol> 4。信号集録：プレッシャー、単相性活動電位、およびfNADH <ol><li>心室カニュレーションが完了したら、慎重に大動脈カニューレを介して大動脈への圧トランスデューサーカテーテル（ミラー）を挿入します。静かに大動脈弁を通過し、LVにそれを移動します。カテーテル先端の適切なポジショニングを確保するため、LV圧力信号を監視します。 LV圧の例が示されている図1に示します。 </li><li>優しく心室心外膜に対する単相性活動電位電極を押してください。適切な行動の潜在的な測定を実現するための信号を監視します。信号のわずかなモーションアーチファクトは正常です。 </li><li>心臓のペースに右心房に双極刺激電極を配置します。私たちのプロトコルでは、心はそれぞれ200および400 BPMに対応し、300と150ミリ秒の間にサイクル長でペースだった。 </li><li> LV心外膜表面の温度を測定します。研究では、温度が37℃に維持する必要がある場合°C、次いで水ジャケット心腔または水没の心を通して一定温度を維持するために温めておいたsuperfusate浴で心の中心に配置します。 </li><li> CCDカメラ（アンドールIXON DV860、128x128ピクセル）を配置し、ビューの適切なフィールドが観察されるようにレンズの焦点を合わせる。カメラは、ワークステーションに接続され、画像がアンドールSOLIS softwaを使用して、2 fpsで取得される再。 </li><li>前の画像の開始に水銀ランプの光をオンにします。光は励起フィルター（350±25 nmであり、クロマテクノロジー）を介して、心臓の表面を照らすために光ファイバライトガイド（堀場ジョバンイボンモデル1950-1M）に指示されています。ライトガイドを介してUV光の減衰は小さい。 UV照明にもLEDスポットライト（MightexのPLS-0365-030-S）と制御ユニット（Mightex SLC-SA04-US）から構成されるハイパワーLEDシステムを使用して提供することができます。 </li><li>部屋のライトをオフにして、任意の周囲の照明を最小限に抑えることができます。均一な心外膜照明を達成するために、心臓部で光導波路（またはLEDスポットライト）のフェルールを目指しています。放出されるNADH蛍光（fNADH）は、発光フィルター（460±20 nmのクロマテクノロジー）を通過してCCDカメラで撮像される。 </li><li>イメージングソフトウェアを使用して、関心領域を選択することにより、時間の経過とともにfNADHの​​変更を監視します。地域O内の平均ピクセル強度を監視するために生きる - 更新モードを選択します。F関心。 </li><li>心臓は、適切な圧力を生成するために心室の動作モードで機能する必要があります。 fNADHレベルが十分な冠灌流を確認するために、心外膜面上の低く安定しなければなりません。研究ではこの時点で、特定の実験プロトコルは、仮説をテストするために実装する必要があります。 </li><li>調査が完了すると、システムから心臓を削除し、すべての灌流液を排出する。精製水を使用してシステムのチューブとチャンバーを洗浄します。日常のメンテナンスは、システムは定期的にMucasol溶液または必要に応じて希釈した過酸化水素溶液でリンスする必要があります。 </li></ol> 5。 fNADH画像のオフライン処理<ol><li> NADHのデータセットを比較する一つの方法（fNADHの（i、j、t））は実験の間には、参照画像を使用して、それぞれの蛍光画像を正規化することであるとして、以下の式に示すように、データセットの9時から（fNADH（I、J、T 0））、 。 NADH蛍光を正規化する別の方法では、PLすることですエース実験9、18、19前に視野内のウラニルガラスの小片。安定した基準として使用することができます信号を提供するために、UV光を照射 - ウラニルガラスは蛍光（550 nmの450）でしょう。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/4115/4115eq1.jpg" /> 6。代表的な結果両心室作業ウサギの心臓の準備の前方および基底ビューは図1に示されています。左心室圧が大動脈弁を通過し、左心室に圧力トランスデューサーカテーテル（ミラーSPR-407）をナビゲートして測定した。大動脈、肺動脈、左心室圧（LVP）は、 図1Cに示されています。拡張LVPは通常0〜10 mmHgである。最小拡張期大動脈圧は約60 mmHgである。ピーク収縮LVPは、充填圧力（予圧またはLA圧）と収縮性に依存していますと、最適に、80〜100 mmHgのでなければなりません。 図1Cに示すように最大の大動脈圧と最大LVPは密接に一致させる必要があります。 ウサギの心臓のための典型的な高速の脱分極相および再分極相と単相性活動電位（MAP）を図1Dに示されています。 図1Dに示すように、MAPは、請負中心部から比較的容易に記録することができますが、通常は拡張期の間に小さなモーションアーチファクトがあります。 MAPはペーシング中の心臓（キャプチャ）が正常に同調を確認するために有用であり、また、虚血または他の急性摂動のために地元の電気生理学的変化を測定するために使用することができます。 ECGは、暖かいsuperfusateのお風呂で心を沈めると、心臓の左と右の両側にお風呂に電極を配置して測定することができます。第三不関電極のいずれか心臓から、浴中に置かれているか、または大動脈に取り付けられています。ECGは、全体の電気的機能を評価するため、虚血の存在を明らかにするために有用であるグローバルな励起及び再分極過程に関する情報を提供していきます。 fNADHイメージングは​​、虚血や低酸素領域の時空間的進行を測定するために使用することができる心臓のミトコンドリア酸化還元状態の変化を明らかにする。この研究では、心外膜fNADHはサイクル300の長さ（CLS）、200、150ミリ秒の3つのペーシングレートの間に酸化還元状態の変化を監視するために測定した。関心領域（赤いボックスは、 図2）から平均fNADH値は、サイクルの長さが短くされているベースラインfNADHレベルが増加することを示している。速度をペーシングするときはベースラインfNADHレベルが比較的一定である洞調律（CL = 300ミリ秒）に近いです。サイクルの長さとして最短CL（150ミリ秒）で最大の増加に伴って300ミリ秒、ベースラインfNADHレベルが増加し、下に短縮されます。完全な前面の高分解能イメージングfNADH200と400でBPMを図3に示します。 200 BPMでfNADHレベルは一定で、空間的に均質であった。 400 BPM、fNADHレベルは心外膜を通じて大幅に増加した。重要な空間的な異質性がRVとLVの中隔の領域内で発生する最大の増加が観察された。 fNADH信号が収縮（モーションアーチファクト）で発振し、発振の周波数は、心拍数（ 図2）に対応しています。心室カニュレーションでは、心臓のベースは、収縮時の揺れから心臓を防ぐことができます4カニューレにより保持されます。したがって、発振振幅は任意の長い時間スケール（5-10秒）虚血あるいは低酸素状態によって引き起こされるfNADHの​​動向よりも常に少なくなります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig1.jpg" /> 図1。孤立した両心室からの典型的な圧力と単相性活動電位は、RAの作業心をBBIT。左心房3; 1、大動脈、2、肺動脈、4、右心房、左心室（LV）と右心室を示し、心臓のB.前方ビュー：A.基礎4カニューレを示す心のビュー。 （RV）。C.代表圧力。上：左心室圧（実線）と大動脈圧（点線）。底部：肺動脈圧D.描写単相性活動電位。信号は、パネルCに示される圧力に揃えて配置され<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4115/4115fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig2.jpg" /> 図2。ウサギの心臓の作業分離された両心室のfNADHイメージング。トップ：視野の漫画（左）と3つのfNADH画像が表示されます。対応するペーシング周期長（CL）は、各画像に表示されています。下部のパネルにfNADH信号の関心領域は、赤いボックスで示されます。単相性活動電位電極の先端は、関心領域の右側に見られている。心外膜は、 図5に示すように、水銀ランプとライトガイドを使用して点灯されました。唯一の関心領域を取り巻く心外膜面が点灯されたボトム：関心領域の平均fNADHトップパネルの赤いボックスで示されます。縮小周期の長さの平均fNADH増加します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig3.jpg" /> 図3。ウサギの心臓の作業分離された心室の完全な前面のfNADH画像。心臓は200拍、400拍で、RAからのペースだった。 2つの高電力のLED（Mightex PLS-0365-030-S、365nmの4％を使用して、全体の前心外膜を照らしながらfNADH（2コマ、0.4ミリメートルの解像度で128×128ピクセル）画像化したIntensity、50 mW（最大））。

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利害の衝突が宣言されません。

孤立したランゲンドルフ灌流心臓は心臓の生理学2を研究するための著名なツールのままです。それは、特に不整脈、膜電位20の蛍光イメージングを使用するものの研究に特に有用である。利点は、単離された心臓の心外膜全体が21日、22日を観察することができることである。もう一つの利点は、血液とは対照的に、明確な晶質緩衝液による灌流が蛍光信号と干渉しないということです。制限は、ランゲンドルフ技術が頻繁に心臓が生理的負荷および後負荷圧力のコンテキスト内で作業を実行するために必要な心臓の代謝の研究、に適していないということです。 代謝研究のために孤立した心の準備、適切な左心室（LV）負荷および後負荷圧力3を確立するために、ランゲンドルフ技術にニーリィ導入された変更の妥当性を高めるために。モデルは、単離されたLVの作業心臓モデルとして知られており、LVのパフォーマンスと代謝4-6を研究するために広く使用されています。 LVの作業心臓モデルは、機能評価のためのランゲンドルフモデル​​よりも優れている、まだそれは正しくロー​​ドされ、右心室（RV）を提供していません。デミーら 。最初はLVの作業心臓モデル7、8の変形例として心室モデル（LV＆RV）を報告しました。彼らは、一回拍出量、心拍出量、圧力の開発が両心室の動作モード8にLVモードでの作業から変換された心の中で改善されました。正しくロー​​ドRVはまた、隔壁全体に異常な圧力勾配を減少させることにより中隔機能を向上させます。両心室の心の作 ​​業は、最大3時間〜8のために大動脈出力、肺血流量、平均大動脈圧、肺動脈圧、心拍数や心筋ATPを意味し、クレアチンリン酸レベルを維持することが示されている。両心室仕事心臓の研究は、一般的に心のFRを使用しこのようなラットやウサギなどの小動物OM、心拍出量と灌流液の必要量は大型動物の心のそれよりもはるかに少ないためです。しかし、両心室仕事心臓の研究は、ブタ、イヌ、さらには人間の23日、24日から心を用いて実施されています。 両心室の動作モードで分離された心臓の代謝需要がランゲンドルフ灌流のそれよりかなり高くなっています。それは灌流溶液は両心室の心機能をサポートするのに十分な酸素や代謝基質を提供することが重要です。このようなクレブス-ヘンゼライト16、17、25またはタイロード26、27などの標準的な晶質緩衝液は、5.6 mg / Lで同じ高さの酸素溶解性を有するこれらのソリューションはcarbogen（95％O 2および5％CO 2ガスのブレンド）をガス処刑し、適切な代謝基質（グルコース、デキストロース、および/ ​​またはピルビン酸ナトリウム）が含まれている場合、それらは標準で打つ心室仕事の心に適していますら洞レート（ウサギのために約180 BPM）。 速いリズムの代謝需要が増加し、標準灌流液中の溶存酸素量が十分に高い率で縮小している両心室仕事心臓をサポートするのに十分ではないかもしれません。赤血球または全血との混合を含む晶質緩衝液は、十分な酸素の可用性を確保するために働く心の準備に使用されている。これまでの研究では、クレブス-ヘンゼライト溶液に赤血球を追加すると厳格なペーシング·プロトコルの間に働く心機能を改善し、また心室細動16の発生率を減少させることが示されている。全血の赤血球またはその混合物を使用することの制限は、ヘモグロビンが蛍光イメージング13に使用されている光の波長と干渉です。アルブミンのような他の基質は、また、心臓の生存を延長し、浮腫28を削減するソリューションを潅流液に添加することができる。 蛍光イメージングの間に励起光の強度が高くなければならず、光の分布は均一でなければなりません。均一な照明を実現するには、常に心外膜面の曲率に起因する簡単ではありません。水銀ランプからの光（350±25 nm）をフィルタリングすることにより、我々の研究で、我々のイメージfNADH。分岐光ファイバライトガイドは、心外膜の表面にUV光を導くために使用されます。均一な照明は、適切なポジショニングつの出力のフェルールによって達成することができる。 UVは、我々は、 図3に示されているように光源も、使用することができるLEDが点灯します。 LEDの源は、比較的安価であるため、複数の情報源は、イメージングシステムに組み込まれる可能性があります。 LEDは、画像取得と励起光を同期させるために高いレートでオンとオフを循環することができます。 NADHの光退色は組織照明の時間を短縮することで29最小限に抑える必要があります。これは上の照明を入れ直すことによって、電子を使用してオフに行うことができますICシャッターとランプやLED照明システムとコントローラである。照明が心周期と同期されている場合は、fNADH画像取得は、蛍光シグナルにおけるモーションアーチファクトを減らすことがその、拡張期に限定することができます。そのようなLV圧として圧力信号を使用してTrigging照明及び画像取得は、これを行うための一つの方法だろう。 我々の研究では、単位時間当たりfNADHの​​変化が200 BPMで400以上のBPMの5倍以上高くなることがありますことを観察した。これは、高速リズムは心臓のレドックス状態を高めることを示しています。これは、低酸素またはNADにNADHを酸化する筋の無力によって引き起こされているかどうか+ NADHの​​蓄積を避けるために十分な速さは、まだ未解決の問題です。 両心室仕事心の準備のパフォーマンスは、複数の要因によって決まります。最も重要なものの1つは生理を模倣するために適切な負荷および後負荷圧力を設定することです。調査中である条件。特に、左室後負荷（大動脈圧）は、全身の圧力を表すように調整する必要があります。それが高すぎる場合、LVは、逆流、その結果、圧力を克服することはできません。低すぎると圧力が悪影響を冠灌流に影響を与えます。 LVプリロード圧（左心房圧）も、実験プロトコルに適した拡張末期容積を提供するように調整する必要があります。 生体組織のfNADHイメージングは、蛍光イメージング13の確立されたモードです。彼らは冠血管14のライゲーション後、地域的に虚血組織内fNADHの顕著な上昇を報告した心臓組織への応用は、バーロウとチャンスによって示されました。そのfNADH画像はフェアチャイルド·オシロスコープのカメラとUVフラッシュ撮影を使用してフィルムに記録された。 Coremans ら 。 measurにNADH UV /蛍光反射率を使用して、この概念に基づいて拡大電子ランゲンドルフ血液灌流ラット心臓30の心外膜の代謝状態。 videofluorimeterは、イメージングに使用され、データはビデオレコーダーを用いて記録した。その後、ショルツら 。 LVの大面積からの平均fNADHを測定する分光器とフォトダイオードアレイを使用していました。 fNADH 31巨視的な仕事に関連する変動を明らかにしながら、このアプローチは、心外膜の蛍光不均一性と循環の局所変動の影響を減少させた。 図2に示すように、このアプローチは、fNADH画像データセットのすべてのフレームにわたって関心領域のためのコンピューティングの平均fNADHレベルに似ています。我々はこの記事で紹介してきたように、今日の技術は、高速CCDカメラとデジタル制御ハイパワーUVスポットライトを提供します。これらの技術は、fNADHと心臓代謝の時空間ダイナミクスは多くの新たな視点から検討することができます。光学系と光源の比較的低コストはfになりますNADHイメージング、従来の心臓の光マッピングシステムのための有用な付属品9、32

<table border="1"><tbody><tr><td> 化学物質 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> NaClを</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO </td><td> S-3014 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO </td><td> P3911-500G </td></tr><tr><td> CaCl 2を </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> C77-500 </td></tr><tr><td> MgSO 4で </td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO </td><td> M-7506 </td></tr><tr><td> NaHCO 3を </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> S-233 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック、フェアローン、ニュージャージー州</td><td> 423から316 </td></tr><tr><td>グルコース</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO </td><td> 158968-500G </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO </td><td> P2256-25G </td></tr><tr><td>アルブミン</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO </td><td> A9418-100G </td></tr></tbody></table>

隔離された両心室ワーキングウサギ心臓のnadh蛍光イメージング

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

ランゲンドルフを1つの創業以来、単離された灌流心臓は心臓の生理学2を研究するための著名なツールのままです。しかし、それは心が生理的負荷および後負荷圧力のコンテキスト内で作業を実行するために必要な心臓の代謝の研究、に適していません。ニーリィ適切な左心室（LV）負荷および後負荷圧力3を確立するためにランゲンドルフ法への変更を導入しました。モデルは、単離されたLVの作業心臓モデルとして知られており、LVのパフォーマンスと代謝4-6を研究するために広く使用されています。このモデルは、しかし、適切にロードされた右心室（RV）を提供していません。デミーら 。最初はLVの作業心臓モデル7、8の変形例として両心室モデルを報告した。彼らは、一回拍出量、心拍出量、圧力の開発が両心室の動作モード8に働くLVモードから変換された心の中で改善されました</sup&gt;。正しくロー​​ドRVはまた中隔機能を改善するために隔壁を越えて異常な圧力勾配を減少させる。両心室の心の作 ​​業は、最大3時間〜8のために大動脈出力、肺血流量、大動脈圧、心拍数を意味し、心筋のATPレベルを維持することが示されている。 このような虚血など心筋傷害の代謝効果を検討の際には、多くの場合、影響を受けた組織の位置を特定する必要があります。これはイメージングによりNADH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型）9-11の蛍光を行うことができる、補酵素はミトコンドリアで大量に発見した。 NADH蛍光（fNADH）は、ローカルの酸素濃度12に近い直線的に逆の関係が表示され、ミトコンドリアの酸化還元状態13の尺度を提供しています。低酸素および虚血状態でのfNADHイメージングは低酸素領域14、15を識別するためとの進行を監視するために色素フリーの方法として使用されている時間は10以上、低酸素状態。 メソッドの目的は、筋細胞代謝率を変更したり、低酸素症を誘発するか、または両者の組み合わせを作成するプロトコルの中に心室仕事心のミトコンドリア酸化還元状態を監視することです。ニュージーランド白ウサギの心臓は37℃で両心室仕事心臓システム（ヒューゴサックスElektronik社）に接続され、修正クレブス-ヘンゼライト溶液を16で灌流した大動脈、左心室、肺動脈、左＆右心房圧を記録した。電気的活動は、単相性活動電位電極を用いて測定した。画像fNADHに、水銀ランプからの光は、フィルタ（350±25 nm）と心外膜を照らすために使用されていました。放出される光はフィルタ（460±20 nm）とCCDカメラを用いて画像化した。別のペーシングレートの間に両心室仕事心の心外膜fNADHの​​変化が表示されます。心臓モデルとfNADHイメージングの組み合わせ現実的な生理的条件下の文脈の中で急性心臓の病理学を研究するための新たな価値のある実験的なツールを提供しています。

目的は、生理的負荷および後負荷圧力のコンテキスト内で孤立した心臓のミトコンドリア酸化還元状態を監視することです。両心室作業ウサギの心臓のモデルが提示されます。 NADHの​​高い時空間分解能蛍光イメージングは​​、心外膜の組織のミトコンドリア酸化還元状態を監視するために使用されます。

隔離された両心室ワーキングウサギ心臓のNADH蛍光イメージング

Langendorffによる考案以来1、単離心灌流法は心臓生理学の研究における主要なツールであり続けています2。しかしながら、本手法は...

この手順の全体的な目的は、代謝を研究することです。動作心臓標本におけるNADHイメージングを用いることで、まずウサギの心臓を摘出し、次に心臓の4つの腔すべてに正常にカニューレを挿入して動作心臓モデルを構築することで、これを達成します。最終ステップは、イメージング装置をセットアップし、異なるペースメーカー速度でNADHデータを収集することです。最終的に、蛍光NADHのイメージングを通じて、心臓の代謝変化を示すことができます。ラノア逆灌流などの既存の方法と比較したこの手法の主な利点は、心臓が正常な方向の流れを持ち、心臓自身が冠灌流のための圧力を提供するという、生理的状態で動作している点にあります。本手法は、電気生理学および致死性不整脈のメカニズムにおける重要な疑問を解決するのに役立ちます。これは、冠血流代謝と電気活動の関連性を研究するための生理学的モデルを提供することで実現されます。血管および心腔のカニュレーションの手順は習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。不適切な手技は心臓を損傷させ、実験全体を台無しにする可能性があります。実験を開始する前に、作動心臓システムのチャンバー内にあるすべてのチューブを精製水で洗浄し、ポンプを回してシステム内から水を排出してください。LOR灌流ポンプ、左心灌流ポンプ、および右心灌流ポンプのラインにセルロース膜フィルターを装着します。PERFUSE eightをシステムに追加した後、各圧力センサーの2点校正を行います。ウォータージャケットチューブと熱交換器を加熱する恒温水槽の電源を入れます。PERFUSE eightの加熱に使用する水槽の電源を入れます。PERFUSE eightを閉回路で循環させるポンプを起動し、循環タンクを起動してPerfuse Eightに酸素を供給します。マイクロファイバーオキシゲネーターまたはヘモフィルターが、80 kilopascalsで95%の酸素をperfuse eightに供給していることを確認してください。最後に、熱交換器によって循環するperfuseの温度が維持されていることを確認します。37°Cにて、まず心臓作動システムを定圧・LRFモードに設定し、心臓摘出を開始します。ウサギを鎮静させた後、大動脈ブロックの圧力を50から60の間に設定します。ペントバルビタールとヘパリンを、耳縁静脈または後肢内側の外側伏在静脈に注射します。ウサギの疼痛反射が消失したことを確認後、速やかに胸腔を開きます。心膜を切開し、大動脈をクランプして、心臓と肺を摘出します。肺静脈の単離を容易にするため、肺は付着したままにします。次に、シリンジにPBS 60 mLとヘパリン200 unitsを充填します。5 mmのカニュラを取り付け、大動脈にカニュレーションを行います。サイズ0のシルク縫合糸を用いて、大動脈をカニューレに固定します。次に、シリンジをゆっくりと押し、心臓から血液を洗い流します。まず心臓を大動脈ブロックに接続し、拍動心灌流系をセットアップします。コネクターに斜めの角度から近づけ、コネクターが接続された状態でPerfuse eightをカニューレにゆっくりと滴下させます。これにより、大動脈への空気の混入を防ぎ、恒圧ランデルフ（Lendorf）モードで心臓を灌流させる際の冠動脈塞栓症を防止します。脂肪と結合組織を除去し、以下の血管を確認します。下大静脈、上大静脈、大動脈、肺動脈、および肺静脈です。次に、上大静脈を結紮します。肺動脈が左右の肺動脈に分岐する直下で切断します。残っている血管は肺静脈です。これらを心臓と肺の間でまとめ、1本の縫合糸ですべて結紮します。これには2つの重要な理由があります。第一に、肺に接続されている血管を縛ることで、カニュレーション完了後に漏出が発生しないようにするためです。そして第二に、後のカニュレーションに向けて、両側のVNA大静脈を単離しておくことが重要であるためです。次に、肺を取り除きます。左心耳の隅に適当な大きさの穴を開け、そこにperfuse eightを十分に満たします。続いて、カニューレにperfuse eightを完全に満たした状態で、心耳に挿入します。次に、組織を保持しながら、カニューレを心耳に縫合します。左心耳の組織は非常に繊細で、容易に裂ける可能性があります。そのため、一度で左心房にカニューレを挿入することが重要であり、失敗すると挿入が不可能になる場合があります。ポンプ2を起動し、左心房への血流を確保します。実験期間中、前負荷を2から6 torの間に設定してください。圧力の調整が必要になる場合があります。目標圧力から2 mm Hg以内に維持してください。次に、ポンプ1（ラングロールポンプ）を一時的にオフにして、心臓を作動心モードに切り替えます。大動脈圧を10 mmHgまで下げてから、ゆっくりと80〜100 mmHgの範囲まで上昇させます。これにより、大動脈弁が開き、通常の生理的条件下と同様に機能することが可能になります。システムに直接接続したカニューレを用いて、最終的な後負荷圧を、左室（LV）最高圧の約20%低い値に設定してください。下大静脈を介して右心房にカニューレを挿入し、カニューレを静脈に縫い付けます。気泡が混入しないように注意してください。ポンプ3番（右側ポンプ）を起動し、右心房に血流を供給します。圧力を約3 torに設定します。最後に、空気が混入しないように注意しながら右心室にカニューレを挿入し、カニューレを肺動脈に縫い付けます。これで両心室へのカニュレーションが完了します。次に、信号の取得を行います。圧力トランスデューサーカテーテルを大動脈カニューレ経由で大動脈内に慎重に挿入します。大動脈弁を通り、緩やかに lv まで進めてください。カテーテルチップが適切に配置されると、LV圧信号が期待通りに現れます。次に、単相活動電位電極を心室心外膜にそっと押し当てます。電極信号にわずかなモーションアーチファクトが生じることは正常です。次に、実験デザインで指定された位置に従って心臓をペースメイクするため、右心房にバイポーラ刺激電極を配置します。そして、心臓の関心領域にCCDカメラの焦点を合わせます。カメラにはエミッションフィルターが装着されている必要があります。NADH蛍光を検出するため、ワークステーションの照明を消し、カメラが装着されているUV光源を用いて心外膜を均一に照射します。ソフトウェアの設定を行い、1秒あたり2フレームで画像をキャプチャするようにします。次に、ライブアップデートモードを選択し、関心領域内の平均ピクセル強度をモニタリングします。灌流が十分であれば、蛍光で示されるNADHレベルは心外膜表面で低く安定しているはずです。実験が完了したら、プログラムを停止します。心臓を取り出してください。PERFUSE 8およびシステムのチューブとチャンバーを精製水で洗浄します。概説したプロトコルに従い、粘膜TM溶液または希釈した過酸化水素溶液を用いて、定期的にシステムをすすいでください。心臓は、1分間に200から400拍のサイクル長でペースメーカー刺激を行いました。拡張期のLVPは通常0から10 Torrの間であり、最小拡張期大動脈圧は約60 Torrであった。最高収縮期LVPは充填圧と収縮性に依存し、最適には60から80 Torrの間であるべきである。最大大動脈圧と最大LVPは密接に一致すべきである。ウサギの心臓に典型的な単相性活動電位は、速い脱分極相と特徴的な再分極相を持つ。作製した標本から活動電位を容易に記録できたが、通常、拡張期に小さなモーションアーチファクトが生じた。赤色の枠で囲まれた関心領域における平均NADH蛍光値を測定し、ペーシングレートが洞調律に近いときの、サイクル長300、200、150ミリ秒の3つのペーシングサイクルにおけるミトコンドリアの還元状態の変化をモニタリングした。サイクル長が短縮しても、ベースラインのNADHレベルは比較的一定であった。300ミリ秒以下ではベースラインのNADHレベルが上昇し、150ミリ秒で最大の上昇が見られた。また、信号は収縮に伴って振動し、その振動周波数は心拍数と一致した。これらの振動の振幅は、虚血または低酸素によって引き起こされるより長い時間スケールの傾向よりも常に小さいものでした。200 beats per minuteでの前表面全体の高解像度蛍光NADHイメージングでは、400 beats per minuteにおいて一定で空間的に均一でした。NADHレベルは心外膜全体で大幅に増加しました。顕著な空間的不均一性が観察され、最大の増加はRVおよびLVの中隔領域で認められました。習得すれば、正しく実施することでこの手法を45分以内に完了させることができます。この手順を行う際は、大動脈または左心房に気泡が混入しないように注意することが重要です。本手順に続いて、心臓に電位感受性色素を負荷させるなどの追加の手法を用いることで、局所虚血などの病理学的シナリオにおいて、心臓表面の電気的活動と代謝活動の関連性を明らかにするなど、さらなる疑問への回答を得ることが可能です。この技術の開発により、心臓生理学の研究者は、より生理学的に適切なモデルを用いて、病理的条件下における心臓の代謝および伝導障害を研究することが可能となりました。

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