隔離された両心室ワーキングウサギ心臓のNADH蛍光イメージング

本手順の全般的な目的は、代謝を研究することです。作動心臓標本におけるNADHイメージングを用いて、まずウサギの心臓を摘出することでこれを達成します。手順の第2段階では、作動心臓モデルを実現するために、心臓の4つの心腔すべてに正常にカニューレを挿入します。

最終ステップは、イメージング装置を設置し、異なるペースメーカー作動率でNADHデータを収集することです。最終的に、蛍光NADHのイメージングを通じて、心臓の代謝変化を示すことができます。ランゲルハンス島後方灌流法のような既存の手法に対する本手法の主な利点は、正常な方向への血流があり、かつ心臓自らが冠灌流のための圧力を提供しているという、生理的な状態で心臓が作動している点にあります。

本手法は、電気生理学および致死性不整脈のメカニズムにおける重要な疑問を解明するのに役立ちます。これは、冠血流代謝と電気活動の間の関連性を研究するための生理学的モデルを提供することによって行われます。血管および心腔のカニュレーションの手順は習得が困難であるため、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。

不適切な手技は心臓を損傷させ、実験全体を台無しにする可能性があります。実験を開始する前に、作動心臓システムのチャンバー内にあるすべてのチューブを精製水で洗浄し、ポンプを作動させてシステム内から水を排出してください。LOR灌流ポンプ、左心灌流ポンプ、および右心灌流ポンプのラインにセルロース膜フィルターを取り付けます。

システムにperfuse eightを追加した後、各圧力センサーの2点校正を行います。ウォータージャケットチューブと熱交換器を加熱するための加熱循環水槽の電源を入れます。水槽の電源を入れてください。これはPERFUSE eightの加熱に使用されます。

PERFUSE eightを閉回路で循環させるポンプを起動し、循環タンクを起動してPerfuse Eightに酸素を供給します。マイクロファイバー・オキシゲネーターまたはヘモフィルターが、80 kilopascalsで95%の酸素をperfuse eightに供給していることを確認してください。最後に、熱交換器によって循環するperfuseの温度が維持されていることを確認します。

37 °Cで、まず作動心臓システムを定圧LRFモードに設定し、心臓摘出を開始します。ウサギを鎮静させた後、大動脈ブロックの圧力を50から60の間に設定してください。

ペントバルビタールとヘパリンを、耳縁静脈または後肢内側の外側伏在静脈に注射します。ウサギに痛覚反射がなくなったことを確認後、速やかに胸腔を開きます。心膜を切開し、大動脈をクランプして、心臓と肺を摘出します。

肺静脈の分離を容易にするため、肺は付着させたままにします。次に、シリンジにPBS 60 millilitersとヘパリン200 unitsを満たします。5 millimeterのカニューレを取り付け、大動脈に挿入します。

サイズ0のシルク縫合糸を用いて、大動脈をカニューレに固定します。次に、シリンジをゆっくりと押し、心臓を通して血液を洗い流します。まず心臓を大動脈ブロックに接続し、作動心臓システムを構築します。

コネクターに斜めの角度から近づけ、装着したままPerfuse eightをコネクターからカニューレへとゆっくり滴下させます。これにより、大動脈への空気の混入を防ぎ、心臓を定圧Lendroffモードで灌流させている間の冠動脈塞栓症を防止します。

脂肪と結合組織を取り除き、以下の血管を確認します。下大静脈、上大静脈、大動脈、肺動脈、および肺静脈です。次に、上大静脈を結紮します。

右および左の肺動脈に分岐する直下の肺動脈を切断します。残った血管は肺静脈です。これらを心臓と肺の間でまとめ、1本の縫合糸ですべて結紮します。

これには2つの重要な理由があります。第一に、肺に接続されている血管を結紮することで、カニュレーション完了後の漏出を防ぐことができます。そして第二に、後のカニュレーションに向けて、両側のVNA大静脈を隔離させることが重要であるためです。

次に、肺を取り除きます。左心耳の隅に適切な大きさの穴を開け、そこがPerfuse 8で十分に満たされていることを確認します。続いて、カニューレをPerfuse 8で完全に満たした状態で、心耳に挿入します。

次に、組織を保持しながら、カニューレを心耳に縫合します。左心耳の組織は非常に繊細で、容易に裂ける可能性があります。そのため、一度で左心房にカニューレを挿入することが重要であり、失敗すると挿入できなくなる場合があります。

ポンプ2を起動し、左心房へ流量を供給します。実験全体を通して、前負荷を2〜6 torに設定してください。必要に応じて圧力を調整してください。

目標圧力から2 mm Hg以内に維持してください。次に、ポンプ1（ランゲルポンプ）を一時的にオフにして、心臓を作動心モードに切り替えます。大動脈圧を10 mmHgまで下げ、その後、80から100 mmHgの範囲までゆっくりと上昇させてください。

これにより、大動脈弁が通常の生理的条件下と同様に開き、機能するようになります。システムに直接接続したカニューレを用いて、最終的な後負荷圧を左室（LV）最大圧の約20%低い値に設定してください。

下大静脈を介して右心房にカニューレを挿入し、カニューレを静脈に縫合します。気泡が混入しないように注意してください。ポンプ3番（右側ポンプ）を起動し、右心房に血流を供給します。

圧力を約3 torに設定します。最後に、空気が混入しないように注意しながら右心室にカニューレを挿入し、カニューレを肺動脈に縫合します。これで、両心室カニューレ挿入が完了します。

次に信号の取得に進みます。圧力トランスデューサカテーテルを、大動脈カニューレ経由で大動脈に慎重に挿入します。大動脈弁を通過させ、ゆっくりとlv内まで進めてください。

カテーテルチップが適切に配置されると、LV圧信号が期待通りに現れます。次に、単相活動電位電極を心室心外膜にそっと押し当てます。電極信号にわずかなモーションアーチファクトが生じますが、これは正常です。

次に、実験デザインに基づいた位置に、心臓をペースメイクするためのバイポーラ刺激電極を右心房に配置します。そして、CCDカメラの焦点を心臓の関心領域に合わせます。カメラにはエミッションフィルターが装着されている必要があります。

NADH蛍光を検出するため、ワークステーションの照明を消し、カメラが装着されたワークステーションにてUV光源で心外膜を均一に照射します。ソフトウェアを設定し、1秒間に2フレームの速度で画像をキャプチャするようにします。次に、ライブアップデートモードを選択し、関心領域（ROI）内の平均ピクセル強度をモニタリングします。

灌流が十分であれば、蛍光で示されるNADHレベルは低く、心外膜表面で安定しているはずです。ここで、実験が完了したら停止させ、心臓を取り出します。

PERFUSE 8とシステムチューブおよびチャンバーを精製水で洗浄します。規定のプロトコルに従い、粘膜TM溶液または希釈過酸化水素溶液を用いて、定期的にシステムのリンスを行ってください。心臓は、1分間に200から400拍のサイクル長でペースメーカー刺激を行いました。

拡張期LVPは通常0から10 Torrの間であり、最小拡張期大動脈圧は約60 Torrであった。最大収縮期LVPは充満圧と収縮力に依存し、最適には60から80 Torrの間であるべきである。最大大動脈圧と最大LVPはほぼ一致するはずである。ウサギ心臓に典型的な単相性活動電位は、速い脱分極相と特徴的な再分極相を持つ。これらの標本から活動電位は容易に記録できたが、通常、拡張期に小さなモーションアーチファクトが含まれていた。

赤色のボックスで囲まれた関心領域（ROI）から平均蛍光NADH値を測定し、ペーシングレートが洞調律に近いときの、300、200、および150ミリ秒の周期における3回のペーシングサイクル中のミトコンドリア酸化還元状態の変化をモニターしました。ベースラインのNADHレベルは、周期が短縮しても比較的一定でした。300ミリ秒未満では、ベースラインのNADHレベルが上昇し、150ミリ秒で最大の上昇が見られました。また、信号は収縮に伴って振動し、その振動周波数は心拍数と一致しました。

これらの振動の振幅は、虚血や低酸素症によって引き起こされるより長い時間スケールの傾向よりも常に小さい値でした。心拍数200 bpmにおける前表面全体の高解像度蛍光NADHイメージングでは、心拍数400 bpmにおいて一定かつ空間的に均一でした。NADHレベルは心外膜全体にわたって大幅に増加しました。

著しい空間的不均一性が観察され、最大の増加はRVおよびLVの中隔領域で認められました。習熟すれば、この手法を正しく行うことで45分以内に完了させることができます。本手順を実施する際は、大動脈または左心房に気泡が混入しないように注意することが重要です。この手順に続いて、

心臓に電位感受性色素を導入するなどの追加の手法を用いることで、局所虚血などの病理学的シナリオにおける心臓表面の電気的活動と代謝活動の関連付けといった、さらなる疑問を明らかにすることができます。この技術により、心臓生理学の研究者は、より生理学的に適切なモデルを用いて、病理学的条件下での心臓の代謝および伝導障害を研究する道が開かれました。