隔離された両心室ワーキングウサギ心臓のNADH蛍光イメージング

この手順の全体的な目標は、代謝を研究することです。作業中の心臓の準備にNADHイメージングを使用すると、これは最初にウサギの心臓を分離することによって達成されます。手順の2番目のステップは、心臓の4つの心室すべてにうまくカニューレを挿入して、機能する心臓モデルを実現することです。

最後のステップは、イメージング機器をセットアップし、さまざまなペースでNADHデータを収集することです。最終的に、結果は蛍光NADHのイメージングを通じて心臓の代謝変化を示すことができます。この技術の主な利点は、従来の方法よりも、 lanor retro profusion、心臓が生理学的状態で動作しており、正常方向の流れと心臓が冠状動脈灌流のための独自の圧力を提供していることです。

この方法は、電気生理学と致死性不整脈のメカニズムにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。これは、冠状動脈血流代謝と電気的活動との関連を研究するための生理学的モデルを提供することによって行われます。この方法は、血管と心腔のカニューレ挿入ステップを学ぶのが難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

不適切な技術は心臓に損傷を与え、実験の残りの部分を危険にさらす可能性があります。実験を実行する前に、作動中の心臓系のチャンバー内のすべてのチューブを精製水で洗い流し、ポンプを作動させてシステムから水をパージします。LOR灌流ポンプ、左心灌流ポンプ、右心灌流ポンプに合わせてセルロースメンブレンフィルターを追加します。

perfuse 8をシステムに追加した後、各圧力センサーに対して2点キャリブレーションを実行します。ウォータージャケット付きチューブと熱交換器を温める加熱循環ウォーターバスをオンにしますウォーターバスをオンにします。PERFUSE 8を加熱するために使用されます。

PERFUSE 8を閉ループで循環させるポンプをオンにし、循環タンクをオンにしてPerfuseを酸素化します。8、マイクロファイバー酸素供給器またはヘモフィルターが80キロパスカルでパーフューズエイトに95%の酸素を供給していることを確認します。最後に、熱交換器が循環灌流の温度を保っていることを確認します。

摂氏37度で8回、最初に作動中の心臓系を一定の圧力で動作するように設定することにより、心臓の切除を開始します。LRF モード。ウサギを鎮静した後、大動脈ブロックの圧力を50〜60に設定します。.

ペントバルビタールとヘパリンを、後肢の内側の辺縁耳静脈または外側伏在静脈のいずれかに注入します。ウサギが疼痛反射を欠いたら、すぐに胸腔を開きます。心膜をスライスし、大動脈をクランプし、心臓と肺を切除します。

肺は、肺静脈の隔離を容易にするために付着したままになっています。次に、注射器にF 8あたり60ミリリットルと200単位のヘパリンを入れます。5mmカニューレを装着し、大動脈をカニューレ状にします。

大動脈をカニューレに固定し、サイズゼロのシルク縫合糸で固定します。次に、注射器をゆっくりと押し下げて、心臓から血液を洗い流します。最初に心臓を大動脈ブロックに接続して、機能する心臓系を設定します。

コネクタに斜めの角度で近づき、Perfuse eightがコネクタからカニューレにゆっくりと滴下するのを待ちます。これにより、空気が大動脈に入るのを防ぎ、心臓が一定の圧力で灌流されている間の冠状動脈塞栓を防ぎます。Lエンドルフモード。

脂肪と結合組織を取り除き、次の血管を見つけます。下大静脈および上大静脈、青血管、肺動脈および肺静脈。次に、上大静脈を結紮します。

肺動脈が左右の肺動脈に分岐する場所のすぐ下を切開します。残りの血管は肺静脈です。それらを心臓と肺の間にグループ化し、1つの縫合糸を使用してそれらすべてを結紮します。

これは、2つの理由で重要です。まず、肺に接続された血管を結ぶことで、カニューレ挿入が完了した後に漏れがなくなります。そして第二に、後のカニューレ挿入で両方のVNAキャバスを分離することが重要です。

次に、肺を取り出します。左心房付属器の角に適切なサイズの穴を開け、大量の8つで満たされていることを確認します。次に、カニューレが灌流8で完全に満たされている間に付属肢をカニューレします。

次に、組織を保持しながら、カニューレを付属肢に縫合します。左心耳の組織は非常に繊細で、簡単に裂ける可能性があります。したがって、最初の試行で左心房をカニューレに挿入することが重要であり、そうしないと不可能になる可能性があります。

2番のポンプをオンにして、左側のアトリウムに流れを供給します。実験全体を通して、予圧を2〜6トータに設定します。圧力を調整する必要がある場合があります。

目標圧力の2ミリメートル以内に保ちます。次に、ポンプ番号1、ランゴールポンプを一時的にオフにして、心臓を作動心臓モードに切り替えます。大動脈圧を下げて手入れをし、その後ゆっくりと80〜100トルの範囲に上げます。

これにより、大動脈弁は正常な生理学的状態にあるときと同じように開き、機能することができます。最終後負荷圧力を約 20 の値に設定します。システムに直接取り付けられたカニューレを使用して、ピークLV圧力未満を引き裂きました。

下大静脈CVAを介して右心房をカニューレに挿入し、カニューレを静脈に縫合します。気泡の持ち込みを避けてください。ポンプ番号3、右側のポンプをオンにして、右側のアトリウムに流れを供給します。

圧力を約3トーレに設定します。最後に、空気が入らないように右心室をカニューレに挿入し、カニューレを肺動脈に縫合します。これで両心室カニューレ挿入は完了です。

次に、信号取得に進みます。圧力トランスデューサーカテーテルを大動脈カニューレを介して大動脈に慎重に挿入します。大動脈弁を通り過ぎてLVにゆっくりとナビゲートします。

カテーテルの先端が適切に配置されると、LV圧力信号が期待どおりに表示されます。次に、単相活動電位電極を心室心外膜にそっと押し付けます。電極信号のわずかなモーションアーチファクトは正常です。

次に、バイポーラ刺激電極を右心房に配置して、実験計画位置に従って心臓のペースを調整します。そして、CCDカメラを心臓の関心領域に焦点を合わせます。カメラには発光フィルターが取り付けられている必要があります。

NADH蛍光を通過させるには、カメラが取り付けられたワークステーションで、アンビエントライトをオフにして、UV光源で心外膜を均一に照らします。ソフトウェアが毎秒2フレームで画像を取得するように設定するため。次に、ライブ更新モードを選択して、関心領域内の平均ピクセル強度を監視します。

増殖が適切であれば、蛍光で表されるNADHレベルは低く、心外膜表面上で安定しているはずです。次に、テストが完了したら実行します。ハートを取り除きます。

PERFUSE 8とシステムチューブとチャンバーを精製水で排出します。概説されたプロトコルを使用して、粘膜TM溶液または希釈過酸化水素溶液でシステムを定期的にすすいでください。ハートは、毎分200〜400拍のサイクルの長さで貼り付けられました。

拡張期LVPは通常0〜10 torで、最小拡張期大動脈圧は約60 Torで、収縮期LVPのピークは充填圧力と収縮性に依存し、最適には60〜80である必要があります。Tor 最大大動脈圧と最大LVPは、ウサギの心臓に典型的な単相作用と密接に一致する必要があります 電位は、速い脱分極期と特徴的な再分極期を持っています。活動電位は製剤から簡単に記録できましたが、通常、拡張期には小さな運動アーチファクトがありました。

赤枠の関心領域からの平均蛍光NADH値を測定して、ペーシングレートが洞調律に近いサイコ長300、200、および150ミリ秒の3つのペーシングサイクル中のミトコンドリア酸化還元状態の変化を監視しました。ベースラインのNADHレベルは、サイクルの長さが短縮されたため、比較的一定でした。ベースラインのNADHレベルが300ミリ秒未満で増加し、最大の増加は150ミリ秒で、信号は収縮とともに振動し、振動の周波数は心拍数に対応します。

これらの振動の振幅は、虚血や低酸素症によって引き起こされる長い時間スケールの傾向よりも常に小さかった。毎分 200 拍での全前面の高解像度蛍光 NADH イメージングは、毎分 400 拍で一定で空間的に均一でした。NADHレベルは心外膜全体で大幅に増加しました。.

有意な空間的不均一性が観察され、RVおよびLVの中隔領域内で最大の増加が見られました。この手法は、正しく実行すれば45分以内に実行できます。この手順を実行しようとするとき、この手順に従って気泡が大動脈または左心房に入るのを防ぐことを覚えておくことが重要です。

電圧感受性色素を心臓に負荷するなどの追加の方法を使用して、局所虚血などの病理学的シナリオ中に心臓の表面の電気的および代謝的活動をリンクするなどの追加の質問に答えることができます。この技術は、心臓生理学の研究者が、より生理学的に関連性の高いモデルを使用して、病的状態における心臓代謝と伝導障害を研究する道を開きました。