シングルおよび多細胞コンテキストでInvadopodia媒介細胞外マトリックスタンパク分解の定量測定

この標準的な手法では、定量的なインバドポディアによるマトリックス分解アッセイに適した、蛍光標識ゼラチンでコーティングされたカバーガラスを作製します。カバーガラスを蛍光標識ゼラチンでコーティングした後、細胞を播種し、マトリックス分解のために培養します。次に、細胞を固定し、インバドポディアのマーカータンパク質を蛍光染色して画像を撮影し、マトリックスの分解量を定量します。

典型的な結果から、特定の遺伝子の操作や薬理学的薬剤による処理を施した細胞間において、inv podiaが介在するマトリックス分解の差異を定量化することができます。蛍光ゼラチンの不均一なコーティングや、ゼラチンコーティング済みカバースリップの不適切な取り扱いにより、均一な蛍光を持つゼラチンコーティングカバースリップを調製することは困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。本手順のデモンストレーションは、研究助教のKaren Martin、ポストドクトラルフェローのMandy Ammer、および大学院生のElise Walk、Karen Hayes、Steve Markwellが行います。

ラベルなしの5%ゼラチン・スクロースストック溶液を調製するには、PBSにゼラチンとスクロースを加え、37 °Cで完全に溶解させます。その後、4 °Cで保存します。続いて、ガラスカバースリップの洗浄を行います。

24ウェルプラスチック組織培養プレートの各ウェルにカバーガラスを1枚ずつ配置し、20%硝酸を500 µLずつ加えて30分間インキュベートします。硝酸溶液を除去した後、カバーガラスを脱イオン水で3回洗浄します。次にコーティングを行います。

各カバーガラスに50 µg/mLのポリリシンを500 µL加え、室温で20分間インキュベートします。ポリリシン溶液を除去し、PBSで3回洗浄します。ポリL-リシンコーティングにより、その上に塗布する標識ゼラチンの均一なコーティングと結合が促進されます。24ウェルプレートを氷上に置き、各ウェルに調製したばかりの0.5%グルタラルデヒドを500 µL加えます。

プレートを氷上で15分間インキュベートします。冷PBSで3回洗浄し、ゼラチンコーティングを行う前にPBSをすべて吸引します。その間、グルタラルデヒドのインキュベーション中にOregon Green 488結合ゼラチンを再構成しておきます。

製造元のプロトコルに従い、標識済みの溶液と標識なしの5%ゼラチン・スクロースストック溶液を37°Cに温めます。次に、標識済みゼラチン500 µLを、標識なしゼラチン4 mLに希釈します。希釈した4 88ゼラチン混合液を、各カバーガラスに100 µLずつ分注します。

手動で広げることなく、カバーガラスをコーティングするのに十分な量のゼラチンを使用します。早すぎる凝固を防ぐため、コーティング手順中は希釈した4 88ゼラチン混合液を37 °Cに保持することが重要です。また、このステップ以降は、光退色の可能性を避けるため、カバーガラスを可能な限り暗所に保管してください。

1枚のプレート内のすべてのカバーガラスにコーティングが完了したら、プレートを傾けて保持し、各ウェルから余分なゼラチンを吸引除去します。その後、コーティングしたカバーガラスを室温で10分間、暗所でインキュベートします。カバーガラスをPBSで3回洗浄した後、500 microlitersのホウ酸ナトリウム緩衝液を加えます。

水素化ホウ素ナトリウムは発泡性であり、各カバーガラスの上や周囲に小さな気泡が現れます。室温で15分間インキュベートし、残留したグルタルアルデヒドを還元して不活性化させます。各ウェルの外側を素早く掃くように吸引し、真空吸引で水素化ホウ素ナトリウム溶液を除去します。この際、水素化ホウ素ナトリウム処理中に組織培養プレートの底面から剥がれて浮遊しているカバーガラスを吸い込まないよう注意してください。PBSで3回洗浄した後、カバーガラスを70% ethanolで室温にて30分間インキュベートします。

無菌操作を用いて、プレートを含むカバーガラスをB細胞培養用タイプ2ラミナーフローフードに移し、滅菌したPBSでカバーガラスを3回洗浄します。この際、滅菌済みのニードルとピンセットを使用してください。カバーガラスを新しい24ウェルプレートの空きウェルに注意深く移し、使用する特定の細胞種用の培養液でカバーガラスを平衡化させます。

適切なインキュベーション時間の後、セルをカバーグラス上に直接播種します。免疫蛍光イメージングのためにサンプルを処理し、封入を行います。顕微鏡スライドガラス上にProlong Gold抗退色剤または同様の試薬を1滴滴下し、カバーグラスを注意深く倒立させて配置し、解析用の画像を取得します。

この解析では、細胞の面積または細胞数に対するマトリックス分解の正規化面積を算出します。これは、irna成長因子または治療剤で一括処理された複数の細胞が存在する顕微鏡視野全体を解析する場合に有用です。この解析には、細胞集団に関する情報を効率的に収集するのに十分な低倍率で取得した画像を使用します。

ImageJで画像を開きます。スケール情報を確認し、測定項目を選択してください。「Area（面積）」および「Limit to threshold（しきい値に制限）」オプションを選択します。蛍光ゼラチン画像を用いて分解面積を算出します。その際、背景しきい値を差し引くことでゼラチン全体の不均一な照明を補正し、画素強度の上下限値を設定してください。

後続の画像において。分解領域を選択する客観的な手段として、しきい値ウィンドウのセットボタンを使用して、すべての画像に同じしきい値を設定します。粒子解析（analyze particles）機能を使用して、マトリックス分解領域のしきい値を測定します。

選択範囲からノイズを除去するために、0より大きい粒子サイズを選択します。関心領域を特定するために、アウトラインを表示します。その後、描画によってすべての劣化領域が具体的に囲まれている場合は、「display results」と「summarize」にチェックを入れて測定値を表示します。

他の物体（デブリなど）が選択されていた場合は、全面積の測定値をスプレッドシートにコピーし、関心領域の該当する部分の面積のみを記録してください。次に、細胞面積を算出するため、foidおよび染色画像を開き、以降の画像で細胞の縁が選択されるように、画像の閾値で画素強度の上下限値を設定します。閾値ウィンドウのsetボタンを使用して、すべての画像に同じ閾値を設定してください。

細胞領域を選択するための客観的な手段として、「粒子分析（analyze particles）」機能を使用して細胞面積のしきい値を測定します。選択範囲からノイズを除去するため、0より大きい粒子サイズを指定してください。

解析領域を特定するためにアウトラインを表示し、表示結果を確認して、面積測定値を表示するためのサマリーを作成します。「check」は選択しないでください。細胞とクラスターの間に隙間がある場合は、「Include holes」にチェックを入れてください。

次に、関心領域の面積結果をスプレッドシートにコピーし、細胞の総面積あたりのゼラチン分解面積を算出します。別の手法としては、DAPI染色された核をカウントして算出した細胞数で分解面積を正規化する方法があります。

操作によって平均細胞面積が変化する場合、この点は重要になります。この手法では、nucleus counterプラグインを使用して核を自動的にカウントします。画像に合わせてオプションを調整し、最適化してください。核が大幅に重なり合っている場合、自動カウントでは正確な計数ができない可能性があります。

適切に実施すれば、セルカウンタープラグインを用いて手動計数を効率化できます。カバーガラスには、Oregon Green 488結合ゼラチンが均一にコーティングされています。ゼラチンコーティング済みカバーガラスのコーティングおよび処理の過程で、いくつかのアーティファクトが発生することがあります。

例えば、コーティング剤の混合不十分、手作業による塗布、またはゼラチン混合液の部分的な凝固により、コーティングプロセス中にカバーガラスが適切に覆われなかった場合に不均一なコーティングが生じます。擦り傷は、取り扱い中に針やピンセットで傷をつけたことにより、コーティングされたマトリックスが除去されたことを示しています。長期間の保存中にカバーガラス表面が乾燥すると、石畳のような外観になることがあります。この領域は、長時間または高強度の光照射によるイメージング中の蛍光ゼラチン表面の光退色を反映しています。

適切に準備されたカバーガラスを顕微鏡で観察すると、均一な蛍光を示すことに注目してください。この手順で作製された薄いマトリックスは、細胞のECM分解能を評価するための高感度な手段となります。例を挙げます。

これらの画像は、OSC 19頭頸部癌細胞による浸潤したポディウムマトリックスの分解活性を捉えたものです。ここでは、Oregon Green 488結合ゼラチンカバースリップ上に細胞を播種し、蛍光顕微鏡を用いて2Dおよび3D画像の両方で撮影しました。Oregon Green 488結合ゼラチンカバースリップ上に播種されたこれらのOSC 19細胞は、Rhodamine結合Phalloidinおよびアンチコルトアクチン抗体で標識され、ANOR 647二次抗体で可視化し、浸潤部位を擬似カラーの緑色で表示しています。

マージ画像において、podiaはF actinとcortanの細胞質における局所的な濃縮として認められ、これらはゼラチンのクリアリング領域と重なっています。可視化により、侵入したpodiaがECMAサブボリュームにどのように浸透しているかが示されており、このサブボリュームは、侵入podiaが存在する細胞内部のエッジを示すために作成されました。背面エッジビューでは、下層のゼラチンに挿入された侵入podiaが示されています。

腹側端のビューでは、Veda podiaにおける突出と、緑色のマトリックスが存在する領域に赤色で示されるカバースリップ下のゼラチン分解領域が確認できます。これらの画像は、顕微鏡画像全体における正規化ゼラチンマトリックス分解細胞を定量化するための重要な手順の一部を示しています。すべての蛍光画像は、赤色のしきい値処理と関心領域（ROI）のマーキングをより分かりやすく表示するために、グレースケールに変換されています。

Oregon Green 488 抱合ゼラチンのこの画像は、分解が起こった暗い領域を示しています。しきい値処理を施したゼラチン画像では分解領域が強調されており、そこから選択した関心領域（ROI）を用いて分解面積を測定します。この画像には、予想通り、 rumine、foid、および f actin の染色が示されています。

アクチン画像の閾値処理により、測定対象の細胞領域を選択するための全細胞領域が強調されます。同様に、この手法はDAPI染色された細胞核の画像解析にも適用可能です。このパネルでは、混合細胞集団内における個々の細胞による蛍光ゼラチンの分解を定量化する際の一部の手順を示しています。

この簡便な定量は、FLAGエピトープタグを融合させた組換えコルトアクチンを過剰発現させた、単一のトランスフェクト済みOSC 19細胞を対象としたものです。トランスフェクトされた細胞によるマトリックス分解は、トランスフェクトされた細胞とされていない細胞が混在した集団内でも解析可能であることに注目してください。この手順を行う際は、いくつかの重要な点に留意する必要があります。

まず、蛍光細胞マーカーが蛍光ゼラチンの色と重複していないことを確認してください。画像を収集する際は、細胞の存在に基づいて視野を選択することが重要です。細胞株によるばらつきや、さまざまな治療薬への反応があるため、分解領域を優先的に探すとデータに偏りが生じる可能性があります。

シーティングの数、分解時間、免疫蛍光ラベル用のタンパク質選択などの要因は、個別の実験に合わせて最適化する必要があります。このビデオを視聴することで、β-ポディア介在性分解アッセイを用いて、蛍光ゼラチンが均一にコーティングされたカバーガラスを作成する方法と、マトリックス分解の定量方法について十分に理解できるはずです。