可変角度全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）の際に、細胞接着のナノトポロジー
October 2nd, 2012
基板上への細胞接着のトポロジーは、可変角度全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）によってナノメートルの精度で測定されます。
この手順の全体的な目標は、基板上の細胞接着のトポロジーをナノメートルの精度で測定することです。これは、まず透明なスライドガラス上で細胞を培養し、蛍光マーカーでインキュベートすることで達成されます。次に、顕微鏡の調整可能なミラーの角度位置が校正され、その位置がミラー位置決めプログラムに保存されます。
次のステップは、約10の異なる角度で照射した際の蛍光画像を記録することです。最後のステップは、数ナノメートルの精度で細胞基板の距離を計算することです。最終的に、基質上の細胞接着のトポロジーの結果を使用して、さまざまな細胞株、たとえば、がん細胞と悪性の低い細胞との間の接着の違いを示します。
この技術が共焦点顕微鏡などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、実際の分解能がわずか数ナノメートルの範囲にあることです。しかし、この方法では細胞膜についての洞察を得ることができます。また、小さな小胞やナノ材料などの他のシステムにも適用できます。
実験のデモンストレーションは、細胞サンプルを準備するポスドクのペトラと、可変角度、全反射の細胞を準備するための実験を実行するエンジニアのマイケル・ワグナーです。蛍光顕微鏡法は、10%のウシ胎児、血清、および抗生物質を添加した培養培地中のスライドガラス上で、1平方ミリメートルあたり100細胞の密度で個々の細胞を播種します。インキュベーター内で摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターで72時間細胞を増殖させます。
次に、細胞に蛍光膜を塗布し、マーカー6D、デカン2、ジメチルアミノナフタレン、またはロランを8マイクロモルの濃度で培養し、培地を蛍光顕微鏡検査の前に60分間インキュベートする。PBSピペットで細胞を洗浄し、緩衝液を対象物スライド上に取り除いて培地を除去した後、対象物スライドの裏側から緩衝液を拭き取ります。可変角度には、背面照射型カメラやエクソンE-M-C-C-Dカメラを搭載したZeiss Axioプランなどの正立顕微鏡が使用されます。
T-I-R-F-Mは、コンデンサーをカスタムメイドの照明装置に交換し、オブジェクトスライドに光学的に結合された半円筒形ガラスプリズムを備えています。レーザービームは、照合されたモノモードファイバーから入射され、ガラスプリズムとさらに光学部品によってイメージングされた後、サンプルの表面に再び平行ビームが生成されます。電界ベクトルが分極され、入射面に対して垂直になるように注意してください。
この位置は、ファイバーの出力カプラーにマークされています。コンデンサーの内側にある調整可能なミラーを使用して、サンプル平面で画像化され、入射光線または物体光線の可変角度でサンプルを照らします。調整可能なミラーは、ソフトウェアによって制御されるステップモーターによって駆動できます。
各位置は、go metric proceeded 測定によって決定された、明確に定義されたインシデントの角度に対応します。調整可能なミラーの角度位置を較正するには、水に溶解した1ミリモルフラビンヌクレオチドなどの蛍光色素を使用します。入射角が変動したときの臨界角を可視化するには、ガラス水遷移の臨界角61.3度を固定値とし、入射角が臨界角と等しくなるミラーの角度位置をミラー位置決めプログラムに格納します。
カメラソフトウェアを使用して、温度ゲイン、記録時間、シフト速度など、E-M-C-C-Dカメラのパラメーターを設定します。浸漬油を使用して、サンプルの光学的接触を確保します。ガラスプリズムを使用して、細胞に適切な倍率の対物レンズを選択し、絞りを適度にします。
顕微鏡で対象物を視覚化するには、蛍光検出に適したロングパスフィルターまたはバンドパスフィルターを使用します。照明角度の変化に応じて、同一のサンプルの蛍光画像を記録します。インシデントの角度は、臨界角度と同じかそれ以上である必要があります。
セルガラス界面の臨界角が64.5度に対応する場合、角度範囲は66度から74度で、0.5度または1度のステップが推奨されます。データ解析を開始するには、ラボビュープログラムを使用して、さまざまな角度で記録された画像、カメラの設定、励起波長、屈折率を読み取ります。ガラス (1.52) とセル (1.37) の場合、データを適切に評価するために設定がインポートされます。
パラメータの各セットについて、侵入深さと透過率は自動的に計算されます 手順の成功のために。画像は慎重に記録し、分析用に選択することが重要です。セル基板距離の評価に使用する画像を式に従って選択してください。
膜マーカーの場合、この例に示すように、均質な照明内の個々の画像を除外することができます。セル基板トポロジーの画像を計算し、評価中に表示するための適切なカラーコードを選択します。個々のピクセルのプロファイルは、この図に示すように表示できます。
これらのプロファイルは、フィット感の品質の指標として使用できます。最後に、評価プロトコルを保存します。この図は、活性化されたTP 53腫瘍抑制遺伝子を持つU2 51 mg膠芽腫細胞の全反射画像を示しています。
入射の様々な角度で記録されたルアンとのインキュベーションにより、約140ナノメートルのエバネッセント電磁場の浸透深さに対応する66度、75ナノメートルの浸透深さに対応する69度、浸透が減少する60ナノメートルの浸透深さに対応する73度が記録される。深部蛍光は強度が減少し、細胞のより表面的な部位(細胞の縁の焦点接触など)に由来します。パネルDでは、セル基板の距離が0〜600ナノメートルの範囲の色コードで示されています。
細胞基質の距離は、白から黄色で表されるわずか数ナノメートルから暗赤色で表される250〜300ナノメートルの間で、細胞全体で大きく異なります。これは、焦点接触とより大きな細胞基質距離が近接していることを示しています。細胞基質距離の同様の変動は、活性化腫瘍抑制遺伝子P 10を有するU2 51 mg膠芽腫細胞について計算されます。
対照的に、細胞基質の距離は、黄色で表されるU2 51mg対照細胞およびオレンジ色から赤色で表される野生型細胞については、その発生後、かなり一定である。この技術は、細胞基質トポロジーの分野の研究者が腫瘍細胞とレーザー治療による形態学的変化を調査する道を開きました。このビデオを見れば、生物にとって耐えられる低光量でナノメートル範囲の実際の解像度で表面を視覚化する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
この手順では、可変角度全内反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）を使用して、ナノメートル精度で基質上の細胞接着のトポロジーを測定します。これには、ガラススライド上で細胞を培養し、蛍光イメージングを使用して細胞株間の接着の違いを分析することが含まれます。
主要な研究構成要素
科学分野
- 細胞接着
- 蛍光顕微鏡
- 細胞生物学
背景
- 細胞接着の理解は様々な生物学的プロセスにとって重要です。
- 蛍光マーカーは細胞相互作用の視覚化を向上させます。
- VA-TIRFMはナノスケールでの精密な測定を可能にします。
- 異なる細胞株は様々な接着特性を示します。
研究目的
- 高精度で細胞接着トポロジーを測定すること。
- がん細胞と非がん細胞の接着を比較すること。
- 基質上の細胞相互作用の理解を深めること。
使用された方法
- 透明なガラススライド上での細胞の培養。
- 蛍光マーカーによるインキュベーション。
- 顕微鏡の調整可能なミラーのキャリブレーション。
- 複数の角度で蛍光画像の記録。
主要な結果
- 細胞-基質間の距離の精密な測定が達成されました。
- 様々な細胞株間で接着の違いが観察されました。
- 結果は異なる状況での細胞挙動の理解に貢献します。
結論
- VA-TIRFMは細胞接着トポロジーの研究に効果的です。
- 結果はがん研究に影響を与える可能性があります。
- さらなる研究で、追加の細胞種と条件を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
VA-TIRFM enables nanometer-scale measurement of cell-substrate adhesion, providing quantitative data to de-risk target validation in oncology and mechanobiology. By resolving adhesion differences between malignant and non-malignant cell lines, the method supports predictive confidence in early discovery. Its low phototoxicity and compatibility with live-cell imaging allow longitudinal assessment of adhesion dynamics under compound or genetic perturbation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures nanoscale variations in cell adhesion to interrogate therapeutic hypotheses involving integrin signaling or cytoskeletal regulators.
- Operational Value: Enables functional target validation by correlating adhesion phenotypes with genetic or pharmacological perturbations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that normalize aberrant adhesion in cancer models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative adhesion readouts across multiple illumination angles for reproducible screening campaigns.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and automated angle control for medium-throughput adhesion profiling.
- Data Quality: Penetration depth modulation allows discrimination of superficial versus deep adhesion sites, reducing false positives in hit selection.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly compares adhesion topology in cancer versus control cells, aligning with mechanistic de-risking in tumor microenvironment studies.
- Translational Continuity: Links molecular perturbations to functional adhesion outcomes, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables go/no-go criteria based on adhesion normalization thresholds in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
VA-TIRFM fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, particularly when adhesion is a functional readout of pathway activity.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses by quantifying how genetic knockdowns or inhibitors alter nanoscale adhesion patterns.
- Screening: Delivers reproducible, angle-resolved fluorescence data to standardize adhesion assays across compound libraries.
- Analytics: Provides nanometer-precision distance measurements and penetration depth calculations to enable condition comparisons.
- Translational Research: Connects adhesion changes to disease models only when supported by comparative cell line data, as shown in cancer versus control comparisons.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for adhesion profiling across cell types, substrates, and perturbation conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in adhesion-related targets through direct, nanoscale phenotypic measurement.
- Operational Value: Ensures standardization via calibrated angular steps and automated penetration depth modeling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking adhesion phenotypes to target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on adhesion normalization in disease-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, optical alignment, and evanescent wave theory.
- Needs a custom illumination device with adjustable mirror, glass prism, and polarized laser source.
- Demands standardization of cell seeding density, marker incubation, and angle-specific image acquisition.
- Involves adaptation considerations for different cell morphologies and substrate refractive indices.
- Limited to systems compatible with total internal reflection geometry and fluorescent membrane labeling.
