可変角度全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）の際に、細胞接着のナノトポロジー

本手順の全体的な目的は、基板上の細胞接着のトポロジーをナノメートル精度で測定することです。まず、透明なガラススライド上で細胞を培養し、蛍光マーカーとともにインキュベートすることでこれを達成します。次に、顕微鏡の可動ミラーの角度位置を校正し、その位置をミラーポジショニングプログラムに保存します。

次のステップでは、約10種類の異なる角度で照射し、蛍光画像を記録します。最終ステップでは、数ナノメートルの精度で細胞と基板との距離を算出します。最終的に、基板上の細胞接着のトポロジーの結果を用いて、例えばがん細胞と低悪性度細胞との間などの、さまざまな細胞株における接着の違いを示します。

共焦点顕微鏡などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、実際の分解能がわずか数ナノメートルの範囲にあることです。この手法は細胞膜に関する知見を提供できるだけでなく、小型の小胞やナノ材料などの他の系にも適用可能です。

実験のデモンストレーションを行うのは、細胞サンプルの調製を担当するポストドクターのPetraと、実験の操作を担当するエンジニアのMichael Wagnerです。可変角全内部反射蛍光顕微鏡用の細胞を調製するには、10%胎児牛血清と抗生物質を添加した培地を用いて、ガラススライド上に1平方ミリメートルあたり100個の密度で個々の細胞を播種します。その後、37 °C、5% CO2のインキュベーター内で細胞を72時間培養します。

次に、培養液中で8 µMの濃度の蛍光膜マーカー6-DAPI（10,11-dimethyl amino naphthalene หรือ lorane）を細胞に適用し、蛍光顕微鏡観察の前に60分間インキュベートします。PBSで細胞を洗浄し、バッファー溶液を目的スライド上にピペットで滴下して培地を除去した後、目的スライドの背面からバッファー溶液を拭き取ります。可変角度での観察には、背面照明およびAxion EMCCDカメラを搭載したZeiss Axio planなどの正立顕微鏡を使用します。

T-I-R-F-Mでは、コンデンサーを、物体スライドに光学的に結合された半円筒形ガラスプリズムを備えたカスタムメイドの照明装置に置き換えます。レーザービームはコリメートされたシングルモードファイバーから入射し、ガラスプリズムおよびその他の光学コンポーネントによって結像した後、サンプル表面で再び平行光線となります。電界ベクトルが、入射面に対して垂直に偏光していることを確認してください。

この位置はファイバーの出力カプラーにマークされています。コンデンサー内部に配置され、サンプル平面に結像し、入射角または物体光の可変角度でサンプルを照射する可動ミラーを使用します。この可動ミラーは、ソフトウェアで制御されるステッピングモーターによって駆動させることができます。

各位置は、goniometric測定によって決定された明確な入射角に対応しています。可動ミラーの角度位置を校正するには、1 mMのフラビンヌクレオチドなどの蛍光染料を水に溶解して使用してください。入射角の変化に伴う臨界角を可視化するために、ガラス-水界面の臨界角である61.3度を固定値として使用し、入射角が臨界角に等しくなるミラーの角度位置をミラー位置決めプログラムに保存します。

カメラソフトウェアを使用して、温度ゲイン、記録時間、シフト速度を含むEMCCDカメラのパラメータを設定します。サンプルの光学的な接触を確保するために、浸漬油を使用してください。ガラスプリズムを用いて、細胞に適した倍率と適度な開口数（NA）を持つ対物レンズを選択します。

顕微鏡で物体を可視化するには、蛍光検出に適したロングパスフィルターまたはバンドパスフィルターを使用してください。照明角度を変化させながら、同一サンプルの蛍光画像を記録します。入射角は、臨界角と同等かそれ以上の角度にする必要があります。

セルとガラスの界面における臨界角が64.5度に相当するため、角度範囲は66度から74度とし、ステップ幅を0.5度または1度とすることが推奨されます。データ解析を開始するには、LabVIEWプログラムを使用して、さまざまな角度で記録された画像、カメラ設定、励起波長、および屈折率を読み込みます。ガラス（1.52）およびセル（1.37）の屈折率設定をインポートすることで、データを適切に評価できます。

各パラメータセットについて、手順を成功させるために、浸透深さと透過係数が自動的に算出されます。画像は慎重に記録し、解析用に選択することが重要です。式に従って、細胞と基材間の距離の評価に使用する画像を選択してください。

膜マーカーの場合、本例に示すように、均一な照明下にある個々の画像を除外することがあります。細胞基質のトポロジー画像を算出し、評価中の表示に適したカラーコードを選択してください。個々のピクセルのプロファイルは、この図に示すように表示できます。

これらのプロファイルは、フィッティングの精度の指標として利用できます。最後に、評価プロトコルを保存します。この図は、TP 53 腫瘍抑制遺伝子が活性化された U2 51 mg グリオブラストーマ細胞の全内部反射像を示しています。

さまざまな入射角で記録したところ、66度（エバネッセント電磁場の浸透深さが約140 nanometersに相当）、69度（浸透深さ75 nanometersに相当）、73度（浸透深さ60 nanometersに相当）となり、浸透深さが減少しました。浸透深さが浅くなるにつれて蛍光強度は低下し、細胞の縁にあるフォーカルコンタクトなどのより浅い部位に由来するようになります。細胞と基板間の距離は、パネルDに示されているように、ここに見られる0から600 nanometersまでのカラーコードで描かれています。

細胞と基板の距離は、白から黄色で示されるわずか数ナノメートルから、濃い赤色で示される250～300ナノメートルまで、細胞間で大きく異なります。これは、焦点接点とより大きな細胞・基板間距離が近接して存在していることを示しています。同様の細胞・基板間距離の変動が、腫瘍抑制遺伝子P 10が活性化されたU2 51 mg膠芽腫細胞においても算出されています。

対照的に、黄色のU2 51 mgコントロール細胞およびオレンジ色から赤色で示される野生型細胞では、発生後の細胞・基質間距離はかなり一定です。この手法は、細胞・基質トポロジー分野の研究者が腫瘍細胞やレーザー治療による形態変化を探索する道を開きました。このビデオを視聴することで、生体にとって十分許容可能な低光量照射において、ナノメートル範囲の実解像度で表面を可視化する方法を十分に理解できるはずです。