Name: 感染マウスノロウイルスのリバースジェネティクスを介したリカバリ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: 学ぶ マウスノロウイルスのリバースジェネティクスによる感染性ウイルス回収法。in vitro転写とキャッピング、またはT7ポリメラーゼ発現細胞を用いたcDNAトランスフェクションにより、10⁵ TCID₅₀/ml以上の高効率なウイルス回収が可能となる。

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本研究では、イアン·グッドフェローに授与ウェルカムトラストシニア·フェローシップによって資金を供給し、マリーキュリーイントラヨーロッパのフェローシップ（FP7欧州研究評議会）は、アルマンド·アリアスに授与されました。私達は私達に彼らのAgilentのbioanalyserを使用する許可を与え、RNAサンプルを実行すると助けるためにイオ香港チョン博士レベッカロービーとDrマイクスキナーに感謝します。

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Morb.+Mortal.+Wkly.+Rep%22%5BJournal%5D)">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li>
<li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis%2C+Avon%2C+England%2C+2002-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).</li>
<li>Duizer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+efforts+to+cultivate+noroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Laboratory efforts to cultivate noroviruses.</a> J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).</li>
<li>Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT1-dependent+innate+immunity+to+a+Norwalk-like+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus.</a> Science. 299, 1575-1575 (2003).</li>
<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432(2004).</li>
<li>Bok, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+norovirus+replication+by+morpholino+oligomers+targeting+the+5%27-end+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome.</a> Virology. 380, 328-337 (2008).</li>
<li>Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanogels+for+oral+delivery+of+interferon+for+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection.</a> Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).</li>
<li>McFadden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+Regulation+of+the+Innate+Immune+Response+and+Apoptosis+Occurs+via+the+Product+of+the+Alternative+Open+Reading+Frame+4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4.</a> PLoS Pathog. 7, e1002413(2011).</li>
<li>Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+heterogeneous+sequences+at+the+5%27+ends+of+tomato+spotted+wilt+virus+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs.</a> J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).</li>
<li>Shuman, S., Hurwitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+mRNA+capping+by+vaccinia+virus+guanylyltransferase%3A+characterization+of+an+enzyme--guanylate+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).</li>
<li>Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-independent+translation+of+picornavirus+RNAs%3A+structure+and+function+of+the+internal+ribosomal+entry+site%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme%22%5BJournal%5D)">Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site.</a> Enzyme. 44, 292-309 (1990).</li>
<li>Chaudhry, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caliciviruses+differ+in+their+functional+requirements+for+eIF4F+components%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components.</a> J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li>
<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4%5BTitle%5D)+AND+%22E.+EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li>
<li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li>
<li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li>
<li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li>
<li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li>
<li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735(2010).</li>
<li>Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li>
<li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li>
<li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3%27+extremity+of+the+murine+norovirus+genome%3A+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

ここでは、細胞培養における感染MNVの回復を可能にする2つの異なった逆遺伝学的アプローチを説明しました。両方を効果的に近づくし、細胞リボソームによって認識されるキャップMNVの転写産物の生成を介したウイルスRNAゲノムの5 &#39;末端にVPGの共有結合のための絶対的な要件をバイパスします。in vitro転写酵素キャッピング続いて、より効率的です。転写物はFPVキャッピング酵素によってキャップされるかもしれないT7 RNAポリメラーゼを発現する細胞に感染するプラスミドの転写より感染MNVの回復。これらの逆遺伝学システムで回収し、ウイルス力価は、感染した細胞培養液17（ 図5）から精製したウイルスVPG-結合型RNAのトランスフェクションによって得られたこれらに類似しています。寛容なRAW264.7細胞に覆われたMNV RNAのトランスフェクションは、transfectioを含む実験より1つだけログ低いウイルス力価をレンダリングn個のウイルスVPG-結合型RNA（ 図5）を含む感染細胞からのトータルRNA。この事実は、これらのシステムによって生成された転写産物の5 &#39;末端にVPG分子の添加はVPGに関連付けられている細胞にMNV感染性の根底にある機能的側面を明らかにすることが増加したウイルスの収率につながるかどうかを判断するためにさらなる調査を奨励しています。他のRNAウイルスに匹敵する高効率のいずれかの遺伝システムは現在、in vitro転写RNA のウイルス粒子19、20と実際の感染症に比べて唯一の10から100まで低価の回復を可能にするに使用される逆にそれにもかかわらず、我々は、このリバースジェネティクス系を考えています。 全体として、現在の方法論は、ノロウイルスの分子生物学の分野で大きな前進を構成し、ノロウイルスのゲノム中のタンパク質と保存されたRNAモチーフの機能的役割を調べるためのツールを提供してくれる。これらのアプローチは、既にCと組み合わされています10日未満4、21 -マウスurrentマウスモデル使用可能で、MNVが感染性cDNAから回収されたことが示されているが&gt; 80％STAT1-/の致死的感染を引き起こすことができます。我々はキャプシドタンパク質のおよび in vivo 21、22 でやや減衰の表現型を示すさまざまな宿主因子（PTBとPCBP）の結合に関与するポリピリミジン管の生存マウスノロウイルスの変異体を回復したこのシステムを活用した。さらに、我々は最近、ORF4からVF1タンパク質を発現する能力を欠いているウイルスが効率的に細胞培養で複製が再びWT MNV 8に対してマウスにおける病原性が低下していることを明らかにした。これらの研究は、私たちは潜在的なワクチン候補として検討することができMNVの研究に基づいて人間のノロウイルスの弱毒化のバージョンを設計することをお勧めします。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>塩化リチウム沈殿ソリューション</td><td> Ambionの</td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA·ストレージ·ソリューション</td><td> Ambionの</td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7スクリプト</td><td> Ambionの</td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7Gキャッピングシステム</td><td> EPICENTREバイオテクノロジー</td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム</td><td>インビトロジェン</td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td>ネオントランスフェクション·システム·キット</td><td>インビトロジェン</td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td>のOpti-MEM I </td><td>インビトロジェン</td><td> 31985070 </td></tr><tr><td>リポフェクトアミン2000トランスフェクション試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td>アジレント·RNA 600ナノキット</td><td>アジレント</td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100バイオアナライザの双方向oanalyzer </td><td>アジレント</td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR DNAとジェルバンド精製キット</td><td> GEヘルスケア</td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX大規模RNA生産システム-T7 </td><td>プロメガ</td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

感染マウスノロウイルスのリバースジェネティクスを介したリカバリ

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

人間のノロウイルスはヒトの胃腸炎（GE）は、世界中のほとんどの責任があると近い人から人への接触が1、2を回避することはできません環境での再発問題である。ここ数年の間に病院内で感染の発生率の増加は、その運用能力だけでなく、大規模な経済的損失に大きな混乱を引き起こして、報告されている。新たな抗ウイルスアプローチの識別は、細胞培養3で生産的な感染症を完了するには、人間のノロウイルスの無力のために限られていました。密接に人間のノロウイルス4に関連したマウスノロウイルス（MNV）、最近の分離がどのセル5に伝播することができますが、これらの病原体6,7の調査のための新しい道を開いた。 新しい正のセンスゲノムおよびサブゲノムRNA分子の合成MNVの複製の結果は、後者の最後のTHIに対応ウイルスゲノムのRD（ 図1）。 MNVは、ORF1は、ゲノムの大部分を占有し、ポリプロテイン前駆体から放出される7つの非構造タンパク質（NS1-7）をコードする4つの異なるオープンリーディングフレーム（ORF）が含まれています。 ORF2とORF3はサブゲノムRNA領域内に含まれており、キャプシドタンパク質（それぞれVP1およびVP2）（ 図1）エンコードされています。最近、我々はORF2が重複し、追加ORF4を同定したが、別のリーディングフレームで機能的であり、ミトコンドリアのローカライズされた病原性因子（VF1）8にエンコードしています。 ノロウイルスを含む正センスRNAウイルス、の複製は、新しい上限​​なしRNAゲノムの合成で得られる細胞質内で行われます。ウイルスの翻訳を促進するために、ウイルスが細胞のタンパク質合成機械9-11募集を目的としたさまざまな戦略を利用する。興味深いことに、ノロウイルスの変換は多機能ウイルスのタンパク質プライマーVPGによって駆動され共有ゲノムおよびサブゲノムRNAを12から14の両方の5 &#39;末端にリンクされています。翻訳のこの洗練されたメカニズムは、従来の逆遺伝学的アプローチによるウイルス回収の限られた効率の主要な要因となる可能性があります。 ここでは、5 &#39;末端にキャップされたマウスノロウイルス-1（同封MNVと呼ばれる）の転写産物の生成に基づいて2つの異なる戦略を報告します。 2番目のアプローチは、T7 RNAポリメラーゼを発現する細胞のcDNA MNVの転写を伴うのに対し、いずれかの方法では、in vitroでの合成およびウイルスRNAのキャップの両方が含まれます。 MNVと小動物モデルの研究のためのこれらの逆遺伝学·システムの可用性は、レプリケーションと病因15から17にウイルス配列の役割を分析するための前例のない能力を提供しています。

ノロウイルスは胃腸炎の主要原因である、まだそれらの特性評価のための分子技術はまだ比較的新しいです。ここでは、マウスノロウイルス（MNV）、細胞培養で増殖させることができるこの属の唯一のメンバーを効率的に回収するための2つの異なる逆遺伝学のアプローチを報告します。

ヒトノロウイルスは、世界中におけるヒト胃腸炎（GE）の症例の大部分の原因となっており、密接な接触がある環境において繰り返し発生する問題となっている。

この手順の全体的な目的は、2つのリバースジェネティクスシステムを用いて感染性mu eye neurovirusを回収することです。こんにちは、インペリアル・カレッジ・ロンドンのウイルス学部門のArmando Ariasです。私たちの研究グループでは、neurovirusの複製における分子メカニズムの解明に取り組んでいます。ノロウイルスは胃腸炎の主要な原因となります。世界的に、その特性解析のための分子生物学的手法はまだ比較的新しいものです。細胞培養において効率的な感染を完結させることができないため、新しい抗ウイルスアプローチの特定やノロウイルスのライフサイクルに関する知見は限られていました。マウスへの感染および細胞培養での増殖が可能な抗ウイルス剤、すなわちミラーニューロウイルスの最近の単離により、これら重要な病原体の研究に新たな道が開かれました。本報告では、細胞培養において遺伝学的に定義されたニューロニューロウイルス分離株を生成するための2つの戦略を実証します。どちらの戦略も、5'末端がキャップされたウイルス転写物の生成に基づいています。一つ目は、細胞へのトランスフェクション前に、ウイルスRNAのキャップ付き合成をin vitroで行う方法です。二つ目のアプローチは、T7 RNAポリメラーゼを発現している細胞内で、ノロウイルスcDNAを転写させる方法です。手順の概要。キャップ付きRNA転写物からのノロウイルスの回収プロトコルは、リニアライズから開始されます。mmv 1のためのMV CD NAを含むプラスミドを用意します。これは制限酵素Nhe Iを用いて行います。次に、T7 RNAポリメラーゼを用いて、DNAをin vitroでRNAに転写します。続いて、M-M-V-R-N-Aをin vitroでキャップし、細胞にトランスフェクションして感染性MMVを回収します。直接トランスフェクションしたcDNAクローンから感染性MNVを直接回収する場合、T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えFAL PXウイルスを細胞にまず感染させます。FAL PXの感染により、T7 RNAポリメラーゼおよび合成されたRNAの一部をキャップする可能性のあるウイルスRNAキャップ酵素が発現します。その後、脂質媒介トランスフェクションにより、M-M-V-C-D-N-AをFPV感染細胞にトランスフェクションします。すると、T7 RNAポリメラーゼがM-M-V-R-N-Aを産生し、その一部がF-P-V-R-N-Aキャップ機構によってキャップされます。リボザイム配列により、各RNA転写産物が定義された3'末端を持つことが保証されます。キャップ処理されたMMV転写産物は、その後、複製前にタンパク質に翻訳され、新たな感染性粒子の産生につながります。感染性MMV回収のためのRNA転写およびキャップ処理のプロトコル、および感染性キャップ処理MMV転写産物の合成。まず、転写バッファー、ヌクレオチド、水、およびMMV-cDNAを含む直線状プラスミドの各試薬を混合します。次に、RNAとT7 RNAポリメラーゼを反応混合液に加えます。この目的のために多くの市販キットが利用可能であり、RNA合成の再現性のある手法が提供されています。転写反応は、混合液を37 °Cで少なくとも2時間インキュベートすることで行います。この転写反応液のごく少量を取り、非変性アガロースゲルで分析します。まず、使用前にゲル装置を洗剤で洗浄し、RNaseフリー水で洗ってください。アガロースゲルは、RNaseフリーの試薬を用いて調製してください。M-V-RNAは、非変性アガロースゲル上で約3 kbで泳動されます。さらに、RNAの完全性を迅速に分析する方法として、Agilent Bioanalyzerを使用することも可能です。次に、未反応のヌクレオチドを除去するためにRNAを精製します。多くの方法がありますが、本プロトコルでは、費用対効果の高い代替案として塩化リチウム沈殿法によりRNAを精製し、最大速度で15分間遠心分離してRNAをペレット化します。半透明のペレットを乱さないように注意して上清を除去し、70% ethanolで洗浄します。MMV転写物をRNA保存溶液で再懸濁し、完全に溶解していることを確認します。後でRNAを65 °Cに加熱すると、この工程を促進できる場合があります。分光光度計を用いてRNAを定量します。1%の非変性アガロースゲルに少量を電気泳動し、RNAの完全性を分析します。見ての通り、キャッピング効率を向上させるためには、塩化リチウム沈殿後のRNAの完全性が維持されている必要があります。RNAの少量を65°Cで10分間加熱します。チューブをすぐに氷上に置きます。分解やリフォールディングを避けるため、メーカーの推奨に従ってキャッピング反応混合液を調製します。通常、100 µLの最終反応量に約60 µgのM-N-V-R-N-Aを添加します。反応スケールを縮小させることは可能ですが、十分に混合し、37°Cで1時間インキュベートした後、前述と同様に塩化リチウム沈殿法でRNAを精製してください。トランスフェクションに進む前に、RNAの完全性を再度確認することが不可欠です。未分化細胞へのRNAエレクトロポレーションによるMMV回収のステッププロトコル。再懸濁。生の細胞が入ったフラスコをDMEMに懸濁させます。単一細胞懸濁液になっていることを確認してください。トリパンブルー排除法を用い、ヘモサイトメーターで生存細胞数を測定します。細胞をペレット化し、注意深く再懸濁します。抗生物質を含まない新鮮な培地で、1回のトランスフェクションあたり8 million cellsとなるように懸濁し、マイクロ遠心機でペレット化します。培地を除去し、500 µLのPBSで細胞を洗浄し、再度遠心分離してPBSを除去します。その後、室温の130 µLに細胞を再懸濁します。Neonリサス懸濁液。キャップ付きRNAを適切な量（通常、細胞130 µLあたり1.3 µgであり、これは細胞600万個あたりRNA 1 µgに相当する）添加します。転写産物と混合した細胞を、100 µLのNeonトランスフェクションチップに回収します。この段階で気泡が混入しないよう十分に注意してください。次に、1700 V、25 msのシングルパルスで電気穿孔（エレクトロポレーション）を行います。その後、1 mLの抗生物質を含まない培地が入ったエッペンドルフチューブに細胞を回収します。チューブ内の細胞を、10% FCS含有抗生物質フリーDMEMが入った各ウェルに分注し、37 °Cで24～72時間培養します。前述の通り、RNA Lipofectamineを用いてBSR T7細胞にMMVを回収させます。CAP MMV転写産物は、MMV cDNAプラスミドの直線化、T7ポリメラーゼによるin vitro転写、およびin vitroキャッピングによって作製されます。その後、転写産物をBSR T7細胞にリポフェクションします。BSR T7細胞の単層をトリプシンで剥離し、生存細胞 7.5 × 10⁵ 個を6ウェルプレートに播種します。細胞を37°Cで一晩インキュベートします。細胞から培地を除去し、抗生物質を含まない新鮮な培地3 mLに交換します。トランスフェクションの効率を最大限に高めるため、1〜2 µgのキャップ付きM-M-V-R-N-Aを100 µLのOpti-MEMと混合します。また、4 µLのlipectomy 2000を100 µLのoptimumと混合します。RNAとlipectomyを含むサンプルを合わせ、ピペッティングで15回繰り返し混ぜて十分に混合させます。この混合液を室温で20分間静置します。次に、キャップ構造を持つMMV転写産物を含むトランスフェクション複合体を、ドロップ形式で細胞単層に添加します。プレートを垂直方向に振ります。細胞を24時間から72時間培養します。既報の通り、T7 RNAポリメラーゼを発現する細胞から感染性MMVを直接回収するためのプロトコルです。本プロトコルは、ヘルパーoxxウイルスに感染させた細胞におけるT7 RNAポリメラーゼおよびoxxウイルスキャッピング酵素の発現に基づいています。その後、T7プロモーターの制御下にあるM-N-V-C-D-N-Aを細胞にトランスフェクションします。まず、細胞培養培地を除去し、各ウェルに抗生物質を含まない培地で希釈したF pox virusを700 µL添加します。一般的に、細胞あたり約0.5 PFUの感染多重度（MOI）を用います。プレートを垂直に立て、37 °Cで1時間インキュベートします。その後、抗生物質を含まない培地を2 mL添加し、T7 RNAポリメラーゼの発現を促すため、さらに37 °Cで1時間インキュベートします。MNV CG NNAトランスフェクション後、感染細胞から培地を除去し、抗生物質を含まない新鮮な培地を3 mL添加します。前節で説明した通り、1 µgのM-M-V-C-D-N-Aとlipectomyの混合液を調製します。ピペッティングにより十分に混合してください。チューブを室温で20分間静置した後、再度混合し、細胞単層に滴下して添加します。プレートを垂直方向にゆっくりと揺らします。このビデオで示した異なるリバースジェネティクス手法による感染性MMVの回復を確認するため、細胞を37°Cで24から72時間インキュベートします。凍結融解を繰り返すことで、細胞から感染性ウイルス粒子を放出させます。TCID₅₀やプラークアッセイなどの標準的な手順を用いて、各サンプルのウイルス量を測定し、代表的な結果を得ます。これらのリバースジェネティクス系を用いてmi Neurovirusを研究することが可能になったことで、自然宿主におけるNeurovirusの複製と病原性におけるウイルス配列の役割を詳細に解析するという、かつてない能力がもたらされました。このビデオで解説する2つのリバースジェネティクス手法は、感染性のあるNeurovirusおよびNeurovirusの回収において、細胞培養で非常に高い効率を示します。この図に示す通りです。キャップ付きMMV転写物をRAW細胞またはBSRT7細胞にトランスフェクションすると、10⁵ TCID₅₀/mLを超える感染性MMVが回収されます。Fowlpox virusで事前に感染させたBSRT7細胞にMMV-cDNAをトランスフェクションすると、10⁴ TCID₅₀/mLを超えるウイルス力価が得られます。リバースジェネティクス的手法によって得られたウイルス力価は、感染ウイルスから単離したRNAをトランスフェクションして回収された力価と同等であり、本手法で述べたリバースジェネティクスシステムの効率の高さが浮き彫りになっています。

reverse-genetics-mediated-recovery-of-infectious-murine-norovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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リフトバレー熱ウイルスMP - 12ワクチン株の逆遺伝学的システムは、追加のMP -...

リフトバレー熱ウイルスワクチンの安全性および有効性を改善するためのMP - 12株のNSS遺伝子を操作する逆遺伝学を使用して

ここでは、効率的に細胞培養で複製のみノロウイルスですマウスノロウイルス（MNV）の感染性粒子を定量化する方法を説明します。プラークアッセイは、マウスのマクロファージのためにMNVの向性を活用し、MNVを含む生物学的または環境試料での使用に適合させることができる。...

マウスノロウイルスのプラークアッセイ

出典: Leuthold、MM、 et al. X線結晶学のための大 腸菌 におけるヒトノロウイルス突出ドメインの産生 J. Vis. 経験。...

ヒトノロウイルスの細菌由来組換えPドメインタンパク質の精製

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

クローニングされたcDNAからの組換えアレナウイルスのレスキュー、逆遺伝学と呼ばれるアプローチは、研究者はアレナウイルスの生物学のさまざまな側面に、特定のウイルス遺伝子産物の役割、ならびにそれらの異なる特定ドメイン及び残基の寄与を調べることができ。同様に、人間の病原アレナウイルスに対抗するための効果的かつ安全なワクチンの生成のための新規な可能性を提供するワクチン開発のためのFDA承認された細胞株（ベロ）における遺伝学技術を逆転。...

FDAの承認を受けたVero細胞におけるワクチン開発のための組換えアレナウイルスの生成

ニューカッスル病ウイルス（NDV）は広く、とりわけ、ワクチン接種および治療のための新たなベクターを開発するために、ここ数年で研究されてきた。これらの研究は、そのような私たちがここで説明しているようなcDNAから組換えウイルスを救出するための技術、することが可能となっている。...

cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー

ここでは、逆転写定量PCRを使用して、環境水と飲料水中のエンテロウイルスとノロウイルスを定量化する手順を紹介します。EPA メソッド 1615 のこの標準化された手順による地下水からの平均ウイルス回収率は、ポリオウイルスで 20%、マウスノロウイルスで 30%...

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

ウイルス遺伝子増幅を利用したルーチンの検出方法は、非感染性粒子から感染を区別する無力によって制限されます。この資料の目的は、アプタマー...

代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法

プラスミドDNAからの組換えロタウイルスの生成は、ロタウイルス複製および病因の研究、およびロタウイルス発現ベクターおよびワクチンの開発に不可欠なツールを提供する。本明細書において、蛍光レポータータンパク質を発現する株を含む組換えロタウイルスを生成するための簡略な逆遺伝学アプローチについて述べる。...

レポータータンパク質を発現する組換えロタウイルスを回収する簡略逆遺伝学法

このプロトコルの目的は、ヒトノロウイルスの真核生物病原体の細菌への結合を定量化することです。初期のウイルス-細菌付着アッセイを行った後、フローサイトメトリーは、集団内のウイルス結合細菌を検出するために使用される。...

フローサイトメトリーを用いた経月細菌に結合するヒトノロウイルスウイルス様粒子の定量化

学ぶ マウスノロウイルスのリバースジェネティクスによる感染性ウイルス回収法。in vitro転写とキャッピング、またはT7ポリメラーゼ発現細胞を用いたcDNAトランスフェクションにより、10⁵ TCID₅₀/ml以上の高効率なウイルス回収が可能となる。

感染マウスノロウイルスのリバースジェネティクスを介したリカバリ

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