感染マウスノロウイルスのリバースジェネティクスを介したリカバリ

この手順の全体的な目標は、2つの逆遺伝システムを使用して感染性ミューアイニューロウイルスを回復させることです。こんにちは、インペリアル・カレッジ・オブ・ロンドンのウイルス学部門のアルマンド・アリアスです。私たちのグループでは、ニューロウイルスの複製が根底にある分子メカニズムを解剖することに興味を持っています。

ノロウイルスは胃腸炎の主な原因です。その特性評価のための世界的なジェット分子技術はまだ比較的新しいものです。ネオ抗ウイルスアプローチの同定と神経ウイルスのライフサイクルに関する洞察は、細胞培養で生産的な感染を完了できないため、限られていました。

マウスに感染し、細胞培養を増殖させることができる抗ウイルス剤、すなわちミラーニューロウイルスが最近分離されたことで、これらの重要な病原体の研究に新たな道が開かれました。本報告では、細胞培養において遺伝的に定義された神経ニューロウイルス分離株の生成を可能にする2つの戦略を実証する。どちらの戦略も、5つのプライムエンドを上限とするウイルス転写産物の生成に基づいています。

1つ目は、細胞にトランスフェクションする前にin vitroでウイルスRNAをキャッピングする合成です。2 番目のアプローチは、T 7 RNA ポリメラーゼを発現する細胞内の MI ニューロバイアル、CDNA の転写を伴います 手順の概要。キャップ付きRNA転写産物からのニューロノロウイルスの回収のためのプロトコルは、線形上昇によって開始されます。

mmv one用のMV CD NAを含むプラスミド。これは、制限酵素NHE1で行われます。次に、DNAはT seven RNAポリメラーゼを使用してin vitroでRNAに転写されます。

続いて、M-M-V-R-N-Aをインビトロでキャップし、細胞にトランスフェクションして感染性MMVの回復を可能にするために、感染性MMVの回復を可能にするために、直接トランスフェクトされたcDNAクローンからのMMV回復のためのT 7 RNAポリメラーゼを発現するFAL PXウイルスを使用して、細胞は最初にT7 RNAポリメラーゼを発現する組換えFAL PXウイルスに感染します。合成されたRNAの一部をキャップする可能性のあるキャッピング酵素。次に、M-M-V-C-D-N-Aは、脂質媒介トランスフェクションによってFPV感染細胞にトランスフェクションされます。次に、T seven RNAポリメラーゼはM-M-V-R-N-Aを生成し、その一部はF-P-V-R-N-Aキャッピングマシンによってキャップすることができます。

リボザイム配列は、各RNA転写産物が定義された3つのプライムエンドを含むことを保証します。キャップされたMMV転写産物は、複製前にタンパク質に翻訳され、新しい感染性粒子が生成されます。感染性キャップ付きMMV転写産物の感染性MMV合成の回復のためのRNA転写およびキャッピングのためのプロトコル。

まず、以下の試薬、転写、バッファーヌクレオチド、水、およびM-M-V-C-D-N-Aを含む直鎖状プラスミドを混合します。次に、反応混合物にRNAインとT7 RNAポリメラーゼを添加します。この目的のために多くの市販キットが利用可能であり、RNA合成のための再現性のある方法を提供します。

転写反応は、混合物を摂氏37度で少なくとも2時間インキュベートすることによって行われる。この転写反応の小さなアルコットを非変性アグロスゲルで分析します。まず、ゲル装置を洗剤で洗浄し、使用前にRNAフリー水で洗浄します。

アグロスゲルがRNAフリー試薬を使用して調製されていることを確認してください。M-V-R-N-Aは、非変性アグロローズゲルで約3つのキラーベースで動作します。さらに、Agilentバイオアナライザーを使用して、RNAの完全性を迅速に分析する方法を提供できます。

次に、RNAを精製して、取り込まれていないヌクレオチドを除去する必要があります。多くの方法がありますが、このプロトコルでは、最高速度で15分間の遠心分離により、RNAをペレット化する費用対効果の高い代替ペレットとして、塩化リチウム沈殿法によりRNAを精製します。半透明のペレットを乱さないように注意しながら上清を取り除き、70%エタノールで洗浄します。

MMV転写産物をRNA保存溶液に再懸濁し、完全に溶解していることを確認します。RNAを65°Cに加熱すると、後でこのプロセスに役立つ可能性があります。分光法によるRNAの定量。

1%非変性アグロスゲルに少量のアリコートを泳動させることにより、RNAの完全性を解析します。ご覧のとおり、塩化リチウム沈殿後のRNAの完全性は、キャッピング効率を向上させるために同じままである必要があります。RNAのアリコートを65度で10分間加熱します。

チューブをすぐに氷の上に置きます。劣化やリフォールディングを避けるために、メーカーが提案するようにキャッピング反応混合物を調製してください。通常、100マイクロリットルの最終反応に約60マイクログラムのM-N-V-R-N-Aを追加します。

反応をスケールダウンして十分に混合し、37°Cで1時間インキュベートすることもできますが、従来通り塩化リチウム沈殿法でRNAを精製します。トランスフェクションを進める前に、RNAの完全性を再度確認することが不可欠です。生細胞へのRNAエレクトロポレーションによるMMV回収のためのステッププロトコール。レザス。

生細胞のフラスコをDMEMに懸濁します。シングルセル懸濁液を形成していることを確認します。ヘモサイトメーター中の生存細胞の濃度を、トライアンブルーの排除を用いて測定します。

細胞をペレット化し、慎重に蘇生します。トランスフェクションあたり800万個の細胞を新鮮な抗生物質を含まない培地に懸濁し、マイクロフュージでペレット化します。培地を取り出し、500マイクロリットルのPBS遠心分離機で細胞を洗浄し、PBSを取り外し、細胞を室温の130マイクロリットルに再懸濁します。

ネオンレスサスサスペンションソリューション。適切な量のキャップ付きRNAを添加し、通常は細胞130マイクロリットルあたり1.3マイクログラム、これは細胞600万個あたり1マイクログラムのRNAに相当します。転写産物と混合された細胞は、100 μリットルのネオントランスフェクションチップに収集されます。

この段階では気泡が発生しないように細心の注意を払う必要があります。次に、1700ボルトの単一パルスを使用して25ミリ秒の電気操作を行います。細胞を1ミルの抗生物質を含まない培地を含むeend orphチューブに放出します。

チューブからの細胞を、抗生物質を含まないDMEMを10%FCSで含む独立したウェルに分配し、細胞を37度で24〜72時間インキュベートします。RNAリップの完全性によるMMVのBSR T細胞へのMMV回収は、以前と同様に、CAPはMMV CDNNAプラスミドLINEARIZATION T 7ポリメラーゼのin vitro転写によって生成され、in vitroのキャッピング転写産物はその後、BS RT7細胞にリップ影響を受けます。トリプシンはbsrt 7細胞の単層であり、5つの生存細胞に7.5倍10を6つのウェルプレート皿に播種します。

細胞を37度で一晩インキュベートします。培地を細胞から取り出し、抗生物質を含まない3ミルの新鮮な培地と交換します。トランスフェクションの効率を最大限に高めるには、1〜2マイクログラムのキャップ付きM-M-V-R-N-Aと100マイクロリットルの最適

また、4マイクロリットルの脂肪切除術2000と100マイクロリットルの最適を混合します。RNAと脂肪切除術を含むサンプルを組み合わせ、ピペッティングで15回上下して完全に混合します。混合物を室温で20分間放置します。

次に、キャップ付きMMV転写産物を含むトランスフェクション複合体をドロッププライス方式で細胞単層に加えます。プレートを垂直方向に振ってください。細胞を24〜7時間2時間インキュベートします。

先述のT7 RNAポリメラーゼを発現する細胞におけるCDNAからの感染性MMVの直接回収のためのプロトコル。このプロトコルは、oxxウイルスの助けを借りて感染した細胞におけるT seven RNAポリメラーゼおよびoxxウイルスキャッピング酵素の発現に基づいています。次に、T sevenプロモーターの制御下にあるM-N-V-C-D-N-Aを細胞内にトランスフェクションします。

まず、細胞培養培地を取り出し、抗生物質を含まない培地で希釈した700マイクロリットルのFポックスウイルスを各ウェルに加えます。一般的には、細胞あたり約0.5PFUの多様な感染が使用され、プレートを垂直に成形し、37度で1時間インキュベートします。その後。抗生物質を含まない培地を2食加え、細胞を37度でさらに1時間インキュベートして、T seven RNAポリメラーゼ発現MNV CG NNAトランスフェクションを可能にし、感染細胞から培地を取り除き、抗生物質を含まない新鮮な培地を3ミル加えます。

前のセクションで説明したように、1マイクログラムのM-M-V-C-D-N-Aと脂肪切除術の混合物を準備します。上下に準備してよく混ぜます。チューブを室温で20分間保持してから、再度混合し、ドロップパイをセル単層に加えます。

プレートを垂直方向に静かに振ってください。細胞を37度で24〜72時間インキュベートし、このビデオのコースで示されているさまざまな逆遺伝学的アプローチによる感染性MMVの回復を確認します。TCID 50やプラークアッセイの代表的な結果などの標準的な手順により、各サンプルの 1 を決定します。

これらの逆遺伝学的システムを利用して mi ニューロウイルスを研究することで、ニューロウイルスの複製と自然宿主の病因におけるウイルス配列の役割を解剖する前例のない能力がもたらされました。このビデオで説明しているリバースジェネティクスのアプローチは、どちらも感染性神経、神経ウイルス、細胞培養の回収に非常に効率的です。この図に示すように。

感染性MMVは、タイトルが10を超え、TCID 50/milが、キャップ付きMMV転写産物を生細胞またはBS RT7細胞のいずれかにトランスフェクションした後に回収される。ファウルポップスウイルスの助けを借りて以前に感染したBSRT7細胞にMMV-C-D-N-Aをトランスフェクションすると、ウイルス力価は10から4TCID 50/milを超えます。リバースジェネティクスアプローチによって得られたウイルス力価は、感染性ウイルスから単離されたRNAによるトランスフェクションでレスキューされたタイタスと類似しており、ここで説明したリバースジェネティックシステムの高効率が強調されています。