Name: 疾患の病因を研究するツールとしてのニューロンへの抗体のトランスフェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学ぶニューロンへの抗体トランスフェクション法。蛍光標識抗体を用いて神経細胞に導入し、免疫蛍光顕微鏡で可視化することで、自己抗体が神経機能に与える影響を迅速に解析できます。神経免疫学の研究に有用です。

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この作品は、研究開発、医学研究サービス、退役軍人省のOfficeでサポートされています。この研究は、VAメリットレビュー賞（MCL）とテネシー大学ヘルスサイエンスセンター多発性硬化症研究基金によって賄われていた。

1。抗体標識（図1） <ol><li> 、0.1M NaHCO 3緩衝液を加えます。 <ul type="circle"><li> 8.4グラムのNaHCO 3 </li><li> 29.2グラムのNaCl </li><li> 1リットル、H 2 O </li></ul></li><li>この溶液を用いて8.4のpH（10.6グラムのNa 2 CO 3、29.2グラムのNaCl、1リットル、H 2 0）にバッファを立ち上げます。 </li><li> 70μlの抗hnRNPA1と500μlのNaHCO 3緩衝液に35μlのAtto550 NHSを加え、室温で1時間回転させます。時間の回転した後、透析に混合物を注入し、一晩のPBSで2リットルで透析する。 </li><li>翌日、スピンカラム（アミコンウルトラ0.5）を用いた抗hnRNPA1透析しAtto550 NHSを集中する。 </li><li> Atto550 NHSは抗hnRNPA1抗体が濃縮された標識の後、ナノドロップサンプル濃度を決定する。 </li></ol> 2。抗体のトランスフェクション（図2） <ol><li>シード10 5細胞/ウェルDulbecc500μlの中へトランスフェクションの8ウェルスライド24時間におけるoダルベッコ改変イーグル培地（DMEM/F12 +10％FBS +1％抗生物質）。コンフルエントの細胞の少なくとも70％であるべきである。 </li><li>二十四時間播種後、エッペンドルフチュー​​ブにAB-DeliverIN試薬の2μlを添加する。 </li><li>次に、同じエッペンドルフチュー​​ブに抗hnRNPA1抗体（0.5μg/μLの）標識Atto550 NHSの2μgを追加し、室温で10〜15分間インキュベートする。 </li><li>インキュベーションの間、培地を吸引し、細胞に新鮮なDMEM培地の394μlを添加する。 </li></ol> 注：コントロールとして動作するように手つかずの細胞の1室に500μlのDMEMを追加します。 <ol start="5"><li>インキュベーション後、上下にピペッティングして混合、抗体液に100μlのDMEMを追加し、500μlの合計ボリュームに対して、DMEM中のセルに追加します。 </li><li>抗体配信の48時間後にメディアを変更してください。 </li></ol> 注：プロトコルは、FITCはポジティブコントロールとしてRIGGラベル付きで繰り返した。 3。効率を決定するライブと固定撮像<ol><li>画像の細胞は、トランスフェクト画像Atto550 NHSの標識抗体をに蛍光顕微鏡でCy3のフィルタを使用して48時間で生活しています。 </li><li>ライブイメージングが完了した後、メディアやフィックス細胞を吸引除去する。 </li><li>メディアを吸引した後、室温で15分間、0.4％パラホルムアルデヒドで細胞を治療。細胞をPBSで4×5分間ずつを洗ってください。その後、DAPI試薬およびフィックスカバースリップを含むマウントメディアを持つ細胞をマウントします。 AxioVisionのソフトウェアを使用して固定された細胞のトランスフェクション効率を測定します。 AxioVisionのソフトが手元にない場合は、単に3.7の計算に手やプラグ結果によってあなたのイメージからのイベントをカウントします。あるいは、ImageJのソフトウェアは、これらの計算に使用することができます。 </li><li>まず、20倍の倍率でお好みの画像内のセルの総数をカウントする &quot;イベント&quot;の測定を使用しています。 </li><li>次に、なかった細胞をカウントする &quot;イベント&quot;の測定値を使用正常に同じ20倍倍率画像で抗体でトランスフェクションした。 </li><li> Excelのスタイル形式で測定された &quot;イベント&quot;にアクセスするには、 &quot;プロパティ&quot;をクリックして、 &quot;計測&quot;タブをクリックし、表示をクリックし、 &quot;テーブルとして。&quot; </li><li>最後に、2つの以前に測定されたイベントを比較することによって、あなたのトランスフェクション効率を決定するには、次の計算式を使用します（（総細胞 - 非トランスフェクト細胞）/総細胞数）×100 =トランスフェクション効率。 </li></ol> 4。代表的な結果トランスフェクトされた（ 図3B）ニューロンに比べてトランスフェクトしていないのライブ映像（ 図3A）は 、抗体の標識は（各図中の赤または緑）が明確に（ 図3B、C、D）を細胞内に観察されることが明らかになった。吸引後、細胞の表面に付着した間、または抗体を除去するために、メディアで洗浄し、標識された抗体は、まだ神経細胞（ 図3C、D）内に存在する。<html>トランスフェクション効率を計算するには、正常に導入しなかった細胞と比較して、合計のセルを計算するAxioVisionのソフトウェアを使用しています。これらの値は、全細胞の割合（ 図4）のようにトランスフェクション効率を獲得するため、トランスフェクション効率の計算式に入力した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig1.jpg" /> 図標識抗体を濃縮するために必要な手順が続くアト550 NHSエステルを有する抗体を標識するために使用される手順の1。フロー図は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4154/4154fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig2.jpg" /> 図2培養中の生細胞に標識された抗体をトランスフェクトするために使用される手続きのフロー図。arge.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig3.jpg" /> 図3：トランスフェクトされたニューロンは48時間トランスフェクション後の画像をライブ。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig4.jpg" /> 図4は、トランスフェクション効率を決定するためにカウントされたイベントを使用して画像を修正してすすいだ。

<ol><li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li>
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<li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li>
<li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

特定の分子とその発現についての仮説をテストするためには、遺伝子および他のベクターは、一般的に細胞にトランスフェクトされる。このプロシージャのユニークな点は、容易に標的細胞に抗体をトランスフェクトする能力である。我々は、重複での5つの別々の実験ごとにこの方法を行った。トランスフェクション効率の結果は、すべての実験間で同様であった。重要なのは、方法は、抗体の構造や機能を変化させることなく、細胞内に抗体のエントリを可能にします。さらに、ライブニューロンの蛍光顕微鏡を用いて、我々は一般的に55％を超えたトランスフェクション効率を決定することができます。これは、1つは、関心対象の抗体およびその細胞内標的との相互作用に直接関係の仮説をテストすることができます。ここで勉強していませんが、Fabフラグメントを利用することもできる。あるいは、そのような実験は、炎症性サイトカインの追加などの培養条件を変えることexpressiに影響を与えるかどうか検討することを設計することができます上または細胞内ターゲットの局在。 抗体は細胞内の抗原を標的とする方法は、調査の継続的なエリアです。実勢理論は、細胞傷害後...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡AxioObserver A1 </td><td>ツァイス</td><td></td></tr><tr><td> AxioVisionのバージョン4.2 </td><td>ツァイス</td><td></td></tr><tr><td>アンチrhnRNPA1 </td><td>アブカム</td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> FITCは抗RIGGラベル付き</td><td> OZ Biosciences社</td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 NHSエステル</td><td>シグマ</td><td> 92835 </td></tr><tr><td> AB-DeliverIN </td><td> OZ Biosciences社</td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 +10％FBS +1％抗生物質</td><td>ギブコ</td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン8ウェル培養スライド</td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td>多目的ローテータ</td><td>科学的なインダスES株式会社</td><td>モデル151 </td></tr><tr><td> DAPIマウントメディア</td><td>ミリポア</td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td>アンビオン</td><td> 9626 </td></tr><tr><td>ダイアライザー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 66380 </td></tr><tr><td>アミコンウルトラ0.5 </td><td>ミリポア</td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド（4％溶液） </td><td>電子顕微鏡学</td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td></tr></tbody></table>

疾患の病因を研究するツールとしてのニューロンへの抗体のトランスフェクション

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

抗体は、生体のシステムで行われている様々なイベントに新たな洞察を得るための機能を提供します。標的タンパク質に特異性の高い抗体を産生する能力が対処しなければ、非常に正確な生物学的な質問のために許可されています。重要なのは、抗体は全身性エリテマトーデス（SLE）、関節リウマチ（RA）、腫瘍随伴症候群、多発性硬化症（MS）とヒトTリンパ球向性ウイルス1型（HTLV-1）を含むヒトの多くの疾患の病因に関与している脊髄症/熱帯性痙性対麻痺（HAM / TSP）1-9関連付けられています。抗体は、病気が進行中の調査の領域であり、データは抗体および炎症の様々な細胞内分子の結果の間の相互作用は、携帯メッセージング、およびアポトーシス10を変更していることを示唆している原因になる方法。これは、MSとHAM / TSP患者は細胞内のRNA結合タンパク質異種リボ核タンパク質に対する自己抗体を産生することが示されている5月7日 1（のhnRNP A1）は3、9、11。最近のデータは、イントラ神経および表面抗原の両方に対する抗体が病原3、5月9日、11であることを示している。したがって、細胞内抗体の研究を可能にする手順：タンパク質相互作用は、疾患の病因に偉大な洞察力を貸すだろう。 遺伝子は一般的に初代培養細胞や培養細胞株にトランスフェクトされ、細胞内への抗体のトランスフェクションは、しかし抗体構造または貧弱トランスフェクション効率を12の改変によって妨げられている。トランスフェクションの他の方法としては、カチオン性リポソーム（DOTAP / DOPEから成る）とポリエチレンイミン（PEI）に基づく抗体のトランスフェクションを含む;コントロール12と比較して、抗体のトランスフェクションの10倍に減少したどちらも。私たちの研究で行った方法では、陽イオン脂質媒介方法に類似しており、静とhydrを通じて抗体と非共有結合複合体を形成するために、脂質ベースのメ​​カニズムを使用しophobic相互作用13。我々は、非共有結合、静電性および疎水性相互作用を介して抗体を捕捉し、細胞内でそれらを提供することができる脂質製剤であるAB-DeliverIN試薬を利用した。したがって、化学的および遺伝的カップリングは生細胞に機能的な抗体の送達のためには必要ありません。この方法では、さまざまなトレース抗体やタンパク質の局在化実験と同様に、細胞内抗体の分子の結果の分析を行うことができるようになりました：タンパク質相互作用9。 このプロトコルでは、再現性とトランスフェクション効率の高い、急速に神経細胞に抗体をトランスフェクトする方法を示します。一例として、我々はアンチのhnRNP A1および抗IgG抗体を使用します。トランスフェクション効率を簡単に定量化のために、我々はアト-550-NHSとFITC標識IgGで標識した抗のhnRNP A1抗体を使用していました。 Atto550 NHSは高分子吸収と量子yiを持つ新しいラベルですELD。励起源とAtto550用蛍光フィルターはCy3（例：556エム。578）に似ています。また、Atto550は高い光安定性を持っています。 FITC標識IgGは、このメソッドは汎用性であることを示していると依存染めないようにコントロールとして用いた。生成されたこのアプローチは、データは細胞内標的抗原に対する抗体は、ヒト疾患の病因に果たしていることが役割の理解に役立ちます。

相互作用や細胞内環境における抗体の存在に関連する分子メカニズムに及ぼす影響を調査するための迅速なアプローチが説明されています。この方法は、脂質製剤に基づく非共有結合複合体形成を利用した生細胞への抗体のトランスフェクションが含まれます。技術は不死化細胞株および初代培養細胞に適応可能です。

抗体は、生体系で起こるさまざまな事象に対して新たな知見を得る手段を提供します。極めて特異性の高い抗体を作製できる能力は……

この手順の目的は、抗体が神経機能に関連する自己分子メカニズムや神経疾患の病態にどのように影響するかを調査するための、迅速で再現性のある手法を提供することです。まず、抗体をATTO 550 NHS蛍光ラベルで標識します。次に、抗体をトランスフェクション試薬と混合し、神経細胞にトランスフェクションします。培養において、トランスフェクションから48時間後にニューロンを固定し、DPI培地を用いて封入し、免疫蛍光顕微鏡で可視化します。トランスフェクション効率は、イメージングソフトウェアを用いて算出できます。この手法は、自己抗体がニューロン機能に関連する分子メカニズムや、免疫介在性神経疾患の病態をどのように変化させるかなど、神経科学および神経免疫学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の着想は、神経細胞で過剰発現しているhRPA1およびRNA結合タンパク質に対する抗体が神経変性のメカニズムに寄与しているという仮説を検証したいと考えた際に得られました。手順を実演するのは大学院生のJosh Douglasです。手順を開始する前に、実験の前日までに、1ウェルあたり100,000 cellsで播種され、少なくとも80%のコンフルエントに達した高品質で完全な神経細胞が準備されていることを確認してください。アッセイ当日に細胞を観察し、健全な状態であることを確認します。まず、8.4 gの重炭酸ナトリウムと29.2 gの塩化ナトリウムを1 Lの水に溶解し、0.1 Mの重炭酸ナトリウム緩衝液を調製します。次に、緩衝液500 µLのpHを8.4に調整します。ここに、今回導入する抗体であるanti H-N-R-N-P-A1を70 µL、およびラベル化試薬であるNHS-SULFO-NHSを35 µL添加します。溶液を室温で1時間回転させ、その後ダイアライザーに注入し、4°Cの2LのPBSで一晩透析します。翌日、スピンカラムを用いて透析後の標識抗体を濃縮します。最後に、NanoDrop分光光度計を用いて抗体濃度を測定します。8ウェルスライドを用い、完全DMEM 500 µLの容量で1ウェルあたり10,000個の細胞を播種します。細胞を37 °Cで一晩、または細胞のコンフルエンシーが少なくとも70%に達するまでインキュベートします。細胞が70%コンフルエントになったら、エッペンドルフチューブ内で2 µLの抗体、トランスフェクション試薬、および0.5 µg/µLのラベル化抗体2 µgを混合し、室温で10～15分間インキュベートして手順を開始します。その間に、細胞培養ウェルからSUP natumを除去し、1ウェルあたり正確に394 µLの新鮮な培地と交換します。トランスフェクション溶液の準備ができたら、100 µLのDMEMを加え、ピペッティングで混ぜ合わせます。次に、細胞を含む各ウェルに106 µLのトランスフェクション混合液を加え、1ウェルあたりの最終容量を500 µLにします。抗体の代わりにDMEMを添加した未導入（UNT TRANSFECTED）の陰性対照ウェルを必ず含めてください。細胞を37°Cで48時間インキュベートします。このインキュベーション後、培地を新鮮なDMEMに交換し、ラベル化から48時間後に蛍光顕微鏡を用いてライブイメージングを行います。ATO 50 NHSラベル抗体を可視化するには、ライブイメージング後にSI 3フィルターを使用し、培地を吸引除去した後、4%パラアルデヒドを添加してスライドを室温で15分間インキュベートし、細胞を固定します。細胞の固定後、PBSで4回洗浄し、各洗浄につきPBS中で5分間のインキュベーション時間を設けます。その後、PBSを除去し、DPIを含む封入剤を1滴滴下します。蛍光顕微鏡を用いて、各ウェルの細胞の上にカバーガラスをそっと配置します。細胞のイメージングを開始します。本実験では、ATO 550 NHS標識抗HNRNPA1抗体を正常にトランスフェクションしたニューロンのライブ蛍光細胞イメージングを実施しました。この画像は、神経細胞の細胞質や神経突起、および核の固定と核染色における抗体を示しています。ここで青色で示されているDPIを用いることで、導入細胞数を全細胞数で割ることにより、トランスフェクション効率を決定できます。本例では、この手順に従った結果、効率は50%でした。細胞内オルガネラにおける抗体の共局在や、標的抗原に対する抗体の特異性に関連した神経機能および完全性の変化など、さらなる疑問を解消するために、免疫細胞化学、RNA抽出、マイクロアレイ解析、ウェスタンブロットなどの他の手法を実施することができます。本ビデオでは、抗体を蛍光ラベルで標識する方法、蛍光標識抗体とトランスフェクション試薬の複合体を調製する方法、神経細胞へのトランスフェクション、およびトランスフェクション効率の算出方法について説明しました。この手法は、自己抗体が生存率、アポトーシス、神経輸送などの細胞機能にどのような影響を与えるか、また神経機能に関連する分子メカニズムや神経疾患の病態について評価する際に有用です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、黄色蛍光タンパク質(YFP)でタグ付けされた変異型ヒトタウタンパク質をコードするレンチウイルスをヒト神経細胞に形質導入し、タンパク質凝集を研究するプロセスを示しています。ウイルスの侵入から変異型タウの発現までのステップを概説し、ニューロンに目に見える細胞質タウ凝集体が形成されるまでのステップを概説しています。...

タウタンパク質凝集解析のためのヒトニューロンのレンチウイルス媒介形質導入

ここでは、新生児マウスの脳へのアデノ随伴ウイルスの脳室内注射による広範なニューロン伝達の技術を示しています。...

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

タンパク質発現の制御は、生きているすべての生物にとって不可欠であるだけでなく、細胞モデルにおけるタンパク質機能を調査するための重要な戦略でもあります。提示されたプロトコルは、初代海馬ニューロンを含む哺乳類細胞における抗体干渉の適用を示し、タンパク質機能の研究における三次元再構成の使用を示しています。...

タンパク質機能および抗体干渉によるタンパク質発現の変化の役割と三次元再構成を学びます

この原稿は、ウイルスベクターを介した局所遺伝子送達が、中枢神経系における導入遺伝子の発現にどのように魅力的な方法を提供するかを説明しています。...

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの定位注射を介して、パーキンソン病のα-シヌクレインベースのラットモデルの開発

シュプリンガー依存組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) の脊柱の注入は、脊髄内の任意の遺伝子組み換えラベル セル型を操作する使用できます。ここで我々...

アデノ随伴ウイルスを介する遺伝子発現により脊髄のニューロンを遺伝的に定義されています。

このプロトコルの目的は、生体内でα-シヌクレインの形成を複製するセルベースのシステムを集約を提供することです。細胞内の α-シヌクレイン介在物は一次ニューロンに内面化することによって播かれ、伝搬の外因性投与罹患 α-シヌクレイン遺伝子組換えマウスから隔離されたネイティブのミクロソームによる...

線維形成の強力な細胞モデルとして α-シヌクレインのミクロソーム関連付けられた集計一次ニューロンの外因性投与

この手法の目的は、一次運動ニューロン (MNs) マウスの脊髄からの高濃縮文化を準備することです。ミネソタ病気を引き起こす突然変異の結果を評価するために述べるこれらの分離が magnetofection で、トランスフェクションの MNs...

株マウス一次運動ニューロンによるシャルコー ・ マリー ・ トゥース病の in Vitroモデル化

このプロトコルは、ヒトの神経細胞培養が変異型ヒトタウのためのコーディングをコードするレンチを用いて形質導入される手順を詳述する。形質導入培養物は、タウ凝集体および関連する病理を表示する。...

ヒトニューロンのレンチウイルス媒介性形質導入を用いたタウ凝集を研究するための in Vitro モデル

自己免疫性脳炎は、中枢神経系の抗体媒介性疾患の新しいカテゴリーです。海馬ニューロンは、これらの抗体を発見し、特徴付けるために使用することができる。この記事では、患者の血清および脳脊髄液中の自己抗体を決定するための初代細胞培養および免疫染色のプロトコルを提供します。...

自己免疫性脳炎に関与する新しい病原性抗体を検出および研究するための海馬神経培養

ここでは、初代海馬げっ歯類ニューロンのトランスフェクションと生細胞共焦点イメージングを組み合わせて、軸索輸送に対する病理学的タンパク質誘発性の影響を解析し、これらの影響を媒介する機構経路を特定する方法を示します。...

生細胞イメージングを使用して、初代海馬ニューロンの軸索輸送に対する病理学的タンパク質の影響を測定する

学ぶニューロンへの抗体トランスフェクション法。蛍光標識抗体を用いて神経細胞に導入し、免疫蛍光顕微鏡で可視化することで、自己抗体が神経機能に与える影響を迅速に解析できます。神経免疫学の研究に有用です。

疾患の病因を研究するツールとしてのニューロンへの抗体のトランスフェクション

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