Name: 組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上のin-situ灌流 lacZをタグ付き腫瘍細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学ぶマウス肺転移の単一細胞解像度検出法。in-situ灌流とX-Gal染色を組み合わせ、血液由来の背景を除去し微小転移の可視化を向上させる。組織構造を保ちながら高感度に転移巣を検出できる。

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著者らは、肺血流のテクニックで彼の忠告博士Luborベルジッヒ（生理学研究所、チューリッヒ大学）に感謝したいと思います。この作品は、カントンチューリッヒのKrebsliga、ウォルターL.とヨハンナウルフ財団、チューリッヒ、リディアHochstrasser財団、チューリッヒ、スイス国立科学財団、SNF、スイス、Schweizerischer法令に基づく連合組織体Balgrist、大学からの補助金によって支えられてチューリッヒの。

1 のIn-situ肺血および固定<ol><li> 112.5 mg / kgの（体重）ケタミン、16.5 mg / kgのキシラジン、および15 mg / kgのアセプロマジン（または適切な鎮痛剤を含む他の麻酔による）を含む緩衝化生理食塩水（PBS）〜150μlのリン酸塩の腹腔内注射によりマウスを麻酔。 </li><li>マウスの反射神経は、もはや観察されていない場合、バックダウン手術台の上にそれを修正し、なでつける毛に70％エタノールで毛皮を濡らす。 </li><li>首に腹部から皮膚を開き、両側に引っ張ったり、それを削除します。 </li><li>腹膜と十分な大きさに胸を開きます。その後の灌流の効率低下を避けるために大きな血管（静脈の脈など ）の破裂を防ぐ。 </li><li>肝臓の下に下大静脈尾側をカットします。 </li><li>肺は完全に白であるとまでは鼓動する心臓の右心室にゆっくりと10〜15ミリリットルのPBSを注入するために24G針 - 21Gを搭載した20ミリリットルの注射器を使用し心臓が（心静止）暴行を停止します。 </li><li>血管クランプで肝臓と横隔膜上の血管をピンチオフ。 </li><li>右心室にPBS中の3％パラホルムアルデヒド〜2ミリリットル（PFA）を注入する注射針24G - 21Gを搭載した10 mlの注射器を使用しています。 </li><li>胸郭の外気管を発見。肺が膨張するまで気管に頭蓋のPBS中の3％PFA（胸郭の外側）の約3ミリリットルを注入するために、同じ注射器を使用しています。直ちに針を除去した後、血管クランプで穿刺の気管尾をピンチオフと固定を可能にするために10分間待ちます。 </li><li>血管クランプ上記血管を横断し、クランプを取り外し、過剰PFAを削除するには右心室に〜2mlのPBSを注入します。 </li><li>穿刺針を持つすべての肺葉の下の部分は、気管に血管クランプを取り外して、中のPFAまで初回穿刺の気管尾に培地/ PBSで1:1を埋め込むPolyFreezeのソリューションの3〜5 mlを注入する肺ローブは、ソリューションに置き換えられます。 </li><li>鉗子で心を引いて、結合組織の靭帯、血管や気管をtransectingによって注意深く肺を取り外します。肺に接続されている心を保つ。 </li><li>肺組織分析の進め方に応じてセクション2または3に概説プロトコルに進みます。あなたは両方の分析を行いたい場合は、1つの肺葉を削除して、3で説明したように進みます。 2で説明したように心臓に接続、残りの葉を処理します。 </li></ol> 2。全体肺葉における lacZ-タグ転移性腫瘍細胞の可視化<ol><li>タイトな開閉蓋のプラスチックカップに肺を置き、30〜60分間、室温でPBS中2％ホルムアルデヒドで固定します。 </li><li>固定液を取り除き、PBSで十分に3回洗浄します。 </li><li>新たに5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリル-β-D-ガラクトシド（X-Gal）を染色液（X-galストック溶液[40 mg / mlで製造された少なくとも10ミリリットルを追加ジメチルホルムアミド] 1時40分基本的な染色液で希釈し、pHは7.1（ 表1）、光から保護する）。 </li><li>溶液中で完全にそれを維持し、空気の交換を可能にするために鍋でのみゆるく蓋を置くスイミング肺の上にガーゼを入れてください。 </li><li>光から保護して3から5時間37℃でインキュベートする。 </li><li> X-gal溶液を取り除き、残留X-gal溶液（オプション）を削除し、4％PFAを追加するには、PBSで一回すすいでください。 </li></ol> 3。肺凍結切片における lacZ-タグ転移性腫瘍細胞の可視化<ol><li>原液PolyFreeze埋め込み培地で1月3日にプレフィルラベルの付いた埋め込み型。上に肺葉を入れて、葉が完全に覆われるまで、メディアを埋め込んでいっぱい。気泡がないように配慮してください。 </li><li> 20分間、4℃で埋め込まれた肺をインキュベートする。 </li><li>その後-80℃でゆっくりとドライアイスとイソペンタンと店舗の混合物中に埋め込ま肺を凍結</li><li> 7から10μmの凍結をカットクライオスタットのセクションとSuperFrostPlus顕微鏡スライド上にマウントします。 </li><li>加湿チャンバー内で24時間37℃でのX-Gal染色液で直ちにセクションをインキュベートする。 </li><li>蒸留水で簡単にその後5分間のために2回、PBSでスライドを洗浄します。 </li><li> 10から30秒のための核ファーストレッドで対比染色、蒸留水ですすぎ、免疫マウントにスライドをマウントします。 </li></ol> 4。代表的な結果浅井ら高転移LM8サブ細胞株由来のものとは異なる親のダン細胞由来の皮下原発腫瘍が、自発的に検出可能な肺転移を形成しないことをダン由来LM8 OSのマウスモデルの元の記事で報告同系のC3Hマウス14。ここで報告技術により、我々はDunn/LM8マウスのOSモデルにおける転移の形成を再調査。我々は安定したlacZの形質ダンとLM8細胞を利用しましたsおよびマウスでのin-situ肺血流および固定のためのプロトコル。 lacZを形質導入し、非形質制御ダンとLM8細胞は図1に示されている皮下注射したマウスの灌流および非灌流肺の代表画像。制御ダン細胞を注射したマウスでは、肉眼的および顕微鏡的転移は非灌流灌流した肺（ 図1A、I-IV）で検出不可能であった。しかし、興味深いことに、ダン-lacZの細胞を注射したマウスでは、X-gal染色は非灌流肺（ 図1A、vi）の表面上の単一細胞や小さな細胞クラスター（&lt;0.1 mm）の青微小転移病巣を明らかにした。 イン肺の in situ灌流および固定がさらにダン-lacZを微小転移（ 図1A、ⅷ）の検出を改善しました。しかし、巨視的巣に伸長（ 図1A、V、VII）は観察されなかった。&lt;/ P&gt; 直径0.1mm以上LM8細胞、半透明の、かろうじて検出macrometastatic巣大きなコントロールを注射したマウスでは、非肺灌流した（ 図1B、i）で認識された。肺の灌流（ 図1B、iii） は病巣の検出を改善しなかった。しかし、マウスで複数のLM8-lacZの細胞を注入しX-Galを青く染色マクロ（ 図1B、v）と微小転移（ 図1Bは、vi）が非灌流した臓器の表面に検出された。また、肺の血流はさらにマクロおよび微小転移（ - VIII 図1B、vii）の検出能を向上させました。その結果、マイクロおよびmacrometastasesは主として臓器表面の下に巣も見えるようになっている組織灌流さの半透明に、より高い密度とより多くの目に見えるようになった。 追加のH肺組織の凍結切片を用いた分析は 、lacZ istological形質ダンとLM8細胞を注射したマウスの肺転移の検出能の改善を確認した。ダン-lacZまたはLM8-lacZを細胞に由来する原発腫瘍を持つマウスでは、それぞれのコントロール細胞、微小転移あるいは単一細胞病巣の原発腫瘍を持つマウスと異なり肺切片（ 図2）に認識された。また、macrometastasesも制御LM8細胞（ 図2C、D）を注射した動物に比べLM8-lacZを細胞を注射したマウスで、よりはっきりと見えた。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> 図 （I、II、V、VI）が非灌流灌流し、非形質導入（I〜IV） および lacZ形質導入（V-VIII）ダン（）とLM8（B）細胞の自発的な転移の1。検出C3Hマウスにおいて（III、IV、VII、VIII）肺。代表のX-Gal-STAへの転移ined全体の肺（v、およびBのvii）及びそれぞれのクローズアップ（VI、VIIIでAおよびB）を青色で表示されます。非タグ付けLM8細胞（BにおけるI-IV）を注射したマウスの臓器内Macrometastatic病巣が（&gt; 0.1ミリメートル）は、アスタリスクによって示されます。クローズアップに示す領域が全体の肺のための代表的なものである。スケールバーは全体の肺の画像で1ミリメートルとクローズアップさ0.1mmを示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> 図2：ダンと肺凍結切片における微小転移の検出LM8。 10月組み込み肺組織の切片を加湿チャンバー内で24時間37℃でのX-Gal染色液中でインキュベートした後、核ファーストレッドで対比染色した。矢印はダン-lacZを（B）またはLM8-lacZの細胞（D）を注射したマウスの肺切片において認識微小転移巣を指す。 Micrometastasesは非形質ダン（A）またはLM8セル（C）を注射したマウスの肺切片では検出できなかった。スケールバーは0.1mmを示す。

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

Dunn/LM8マウスOSモデルでここに示された結果は、肺組織のin-situ灌流/固定でのlacZ-タグ腫瘍細胞のX-gal染色を組み合わせて新たに確立された方法の力を発揮。 2つの技術のこの組み合わせは、単一細胞レベルに微小転移病変の高感度検出を停止でき、また、肺の表面（ 図1）と同様の肺切片における（ 図2）macrometastasesの可視化を向上させます。 X-gal染色も自然なので、血液と組織関連の色の他の臓器のin-situ灌流/固定で（マイクロ）転移の検出がわずかに肺以外の組織における転移巣の検出能を向上させることができますがこれらの器官13。灌流が別の臓器に向けられている場合であっても、肝臓を例えば 、血液の除去は部分的にしかコントラストベットを改善するであろう〜だと思うX-gal染色や臓器の自然な色。しかし、この方法はlacZをタグ付きの腫瘍細胞の任意のタイプに適用され、飛躍的に休眠中の単一セルの微小転移のレベルに肺転移の検出能を向上させ、ダウンマクロおよび微小転移の簡単で信頼性の高い定量が可能になります。この方法の限界及びルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質を含むレポーター遺伝子に基づいている他のすべての技術は、導入遺伝子の発現の安定性である。 図2dに示すように、macrometastatic病巣内の全ての腫瘍細胞は、β-ガラクトシダーゼ活性の不足を示す青色に染色されています。これは、壊死に関連するかもしれないが、それは可能性が高く、導入遺伝子発現の損失によるものである。私たちは、ダンとLM8細胞が発現させるためであっても連続的な選択の下lacZおよび他の導入遺伝子のダウンレギュレーションに非常に有効であることを観察した。そこで我々は、マウスK12に最近の研究で切り替えとK7M2と人間HOS、143BとSAOS-2骨肉腫細胞株、in vitroでのすべての維持安定lacZ発現ならびに生体内では、最大時間をかけて100％に。 lacZの発現が保証されて安定したら、この技術は、機構的に転移性病変の根絶15を目指して新たな治療法の開発およびテストを行うためだけでなく、組織の植民地化13のプロセスを調査するために例えば、遺伝子操作された腫瘍細胞を用いた研究で適用することができます、16。さらに、転移性病変の早期検出のために使用される、例えば、PET、（マイクロ）、CTやMRIなどの現在の放射線イメージング技術、改善のためのベンチマークとして機能することができます。異なるトレーサーとの最近のPET研究（未発表）では、我々 は 、in vivoで検出された肺で記述されたプロトコルで、その後、ex vivoで転移が確認された。新しい小動物マイクロCTとの継続的な研究では（SkyScan）我々はこれまでにABですleは0.5ミリメートルとex vivoでダウンして0.3 mmまでのサイズにインビボで肺転移をダウン検出するが、我々は0.1ミリメートルの分解能を目指しています。興味深いことに、これは我々がマクロからのin-situ灌流およびX-gal染色を組み合わせた方法で微小転移を区別するために設定されたサイズ制限があります。これは、再びこの簡単かつ費用対効果の高い技術の感度と有用性を強調している。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> Narketan10（ケタミン） </td><td> VétoquinolAG </td><td></td><td> 100 mg / mlの溶液を</td></tr><tr><td> Xylazin（キシラジン） </td><td> StreuliファーマAG </td><td></td><td> 20 mg / mlの溶液を</td></tr><tr><td> Prequilan（アセプロマジン） </td><td> Fatro SpAの</td><td></td><td> 10 mg / mlの溶液を</td></tr><tr><td>ブルドッグのタイプは、血管クランプを止血小鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 18051から35 </td><td>湾曲した、35ミリメートル</td></tr><tr><td>蓋付きのプラスチックカップ</td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td>蓋つきの25ミリリットルのコップ</td></tr><tr><td> 5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリル-β-D-ガラクトシド（X-Gal）を、粉末</td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td>店舗-20℃で光保護、N-ジ-メチルホルムアミドに40 mg / mlで、Nに溶解</td></tr><tr><td> maxの光保護4℃で保存されてpHが7.1に平衡化の基本的な染色液、、。 1ヶ月</td><td>自分で作った</td><td></td><td> 100ミリリットル/ L 10xPBS、1.64 g / LのK3Fe（CN）6、2.1 g / LのK4Fe（CN）6、2ミリリットル/ L 1MのMgCl2、2ミリリットル/ L 10％NP40、1ミリリットル/ Lの10％のナトリウムデオキシコール酸</td></tr><tr><td> PolyFreezeの埋め込みミディアム</td><td> Polysciences社、スイスの代理店：Brunschwig </td><td> 19636から1 </td><td></td></tr><tr><td>埋め込み型</td><td>ポリサイエンス</td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td>ライカCM1850UVクライオスタット</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> SuperFrostスライド</td><td>メンツェル</td><td> J1800AMN​​Z </td><td></td></tr><tr><td>核ファストレッド - 硫酸アルミニウム溶液</td><td>課クロマヴァルデック社＆CO KG DISTributor：Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td>免疫マウント</td><td>サーモエレクトロンは、スイスの代理店：Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> 表1試薬および器具。

組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上<em&gt;のin-situ</em肺組織とのx-gal染色の&gt;灌流<em&gt; laczを</em&gt;タグ付き腫瘍細胞

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

転移は、がんの種類やがん研究の結果として、主な焦点の大半の死亡の主な原因である。しかし、放射線イメージングおよびそれらの治療根絶の成功により、微小転移の検出が制限されたままです。 動物モデルでは、がん研究のための貴重なツールが1であることが証明されているが、微小転移のモニタリング/可視化は、潜在的に臨床試験2で残念な結果につながる前臨床試験で転移拡散の挑戦と不正確な評価のままです。その結果、最終的にダウンして正常組織における単一細胞レベルへの転移の再現性と信頼性の高い検出を可能にするための方法を洗練することに大きな関心がある。主な焦点は、したがって、マイクロコンピューター断層撮影（マイクロCT）、陽電子放射断層撮影（PET）、生物発光や蛍光イメージングのようなin vivoでの腫瘍細胞の検出を可能にする技術は、オンになっている&lt;&gt; 3,4（商標）。我々は現在、別の骨肉腫モデルにおける原発腫瘍の増殖や転移の in vivoモニタリングのために、これらの技術を最適化している。これらの技術のいくつかは、定量PCR 5、6、FACSまたは組織学的染色の異なるタイプのような古典的な方法の横に転移の ex vivo での解析に使用することができます。ベンチマークとして、我々は発色基質5 -ブロモ-4 -クロロ-3 -インドリル-β-Dを代謝する細菌酵素β-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子と本研究では、腫瘍細胞の安定なトランスフェクションまたは形質導入を確立している不溶性の藍色染料7〜-ガラクトピラノシド（X-Gal）を、ここに示すように、単一細胞レベルにマウス組織を ex vivoでの腫瘍細胞の高感度かつ選択的な組織化学ブルー染色をダウンできます。これは、新規性を評価する研究で転移8の正確な検証を可能にする機器を集中的に低コストではないツールですticancer療法9-11。 X-gal染色の制限要因はよく血管化組織の血液関連赤い染色をEGに低いコントラストである。肺組織では、この問題はその場での肺血流、最近ベルジッヒら 12血液からそれらをクリアすると下にその場でこれを修正して埋め込 ​​むことが麻酔下のマウスの肺を灌流することによって確立された手法によって解決することができます気管を通じてインフレ。この方法はまた、肺の崩壊を防ぎ、それによって組織学的分析のために組織の品質を向上させる機能的な肺胞の形態を維持しています。そこで、本研究では 、lacZ 発現腫瘍細胞と肺組織のin-situ灌流および固定のX-gal染色の組み合わせを活用して新しいプロトコルを記述します。この洗練されたプロトコルは、肺内の単一の転移細胞の高感度検出を可能にし、A〜Dの最近の研究で私たちを有効にもともと14非転移性であることが記載されたマウスモデル13に&quot;休止状態&quot;肺の微小転移をetect。

本研究で報告された新たなプロトコルが組み合わせによるマウスの単一細胞の解像度で肺転移の選択的検出を可能に<em&gt;のin-situ</em&gt;肺血流との固定とX-Gal染色<em&gt; lacZを</em&gt;タグ付きの腫瘍細胞。

組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上<em&gt;のin-situ</em肺組織とのX-gal染色の&gt;灌流<em&gt; lacZを</em&gt;タグ付き腫瘍細胞

転移は大多数のがん種における主要な死因であり、その結果、がん研究における主要な焦点となっています。しかしながら、...の検出は...

本手順の目的は、膨張した肺の構造を維持しながら、マウス肺のex vivoにおける微小転移の検出能を向上させることです。まず、組織におけるBGC（背景色）の主因となる血液を除去するため、in situでPBSを用いて肺を灌流します。次に、PFAを注入して肺を膨張させ、その後、肺組織を膨張した状態で固定するためにピンチオフ（遮断）を行います。次に、肺を取り出してPFAでさらに固定するか、あるいは単一の肺葉を凍結切片作成用に包埋します。最終ステップとして、組織をXal溶液で染色し、LA zag腫瘍細胞を可視化します。最終的に、全肺葉または肺組織切片における転移を、双眼鏡顕微鏡または光学顕微鏡を用いて単一細胞レベルまで検出することが可能です。既存の手法と比較した本手法の主な利点は、血液由来のバックグラウンドが除去されるため、微小転移の検出能が大幅に向上することにあります。ケタミン、キシラジン、およびアセプロマジンを約150 microlitersのPBSに溶解した溶液を腹腔内投与し、マウスを麻酔させることからプロトコールを開始します。マウスの痛覚反射が消失したことを確認後、手術台に固定します。背面の毛を寝かせ、70%ethanolで脱毛させます。腹部から頸部まで皮膚を切開します。皮膚を左右に引っ張るか、取り除きます。頸静脈などの太い血管の破裂を防ぐため、胸部の腹膜を慎重に切開します。これにより、灌流の効率が向上します。次に、21〜24ゲージの針を装着した20 mLシリンジを用いて、肝臓の下にある心大静脈を切断します。拍動している心臓の右心室に10〜15 mLのPBSをゆっくりと注入し、肺が完全に白くなり、心拍が停止するまで続けてください。次に、血管クランプを用いて肝臓の上方の血管と横隔膜を挟みます。10 mLシリンジに3%パラホルムアルデヒドを充填し、21〜24Gの針を用いて右心室に約2 mL注入します。胸郭外で気管を露出し、胸郭の外側から気管内にアルデヒド約3 mLを注入して肺を膨らませます。その後、直ちに針を抜き、穿刺部位の気管を血管鉗子で挟んで遮断し、固定されるまで10分間待ちます。次に、血管鉗子の上の血管を切断します。次に、クランプを取り外し、右心室にPBSを約2 mL注入して過剰なパラホルムアルデヒドを除去します。針を用いてすべての肺葉の下部を穿刺し、気管の血管クランプを取り除きます。その後、前回の注入と同様に、希釈した包埋液3〜5 mLを気管内に注入します。肺葉内のパラホルムが溶液に置き換わった時点で、注入を停止します。ピンセットで心臓を牽引し、結合組織の靭帯、血管、および気管を切断して、慎重に肺を取り出します。その際、心臓が肺に接続されたままの状態を維持してください。1つの肺葉を凍結切片用に取り分けておき、残りの肺組織を全肺染色のに使用します。肺を密閉可能なプラスチックカップに入れ、2% formaldehydeとPBSで固定します。肺の上にガーゼを置き、溶液に浸った状態にして室温で30分間放置します。30分後、固定液を取り除き、組織をPBSで3回十分に洗浄します。Xalストック溶液1mLを基本染色液で1:40に希釈して、使用直前にXal溶液を調製し、それを少なくとも10mLカップに加えます。ガーゼを用いて肺を浸します。空気交換ができるよう蓋を軽く閉め、遮光した状態で37°Cで3～5時間インキュベートします。インキュベーション後、xal溶液を除去します。PBSで肺を1回洗浄して残留xal溶液を取り除き、4%パラホルムアルデヒド（PBS溶液）を少なくとも10 mL加えます。これで組織の準備が整い、組織学的検査に使用可能となり、4°Cの4% PFA内で長期間保存することができます。まず、埋め込みモールドの3分の1まで未希釈のpoly forze埋め込み剤を満たします。次に、肺葉をモールドに入れ、肺葉が完全に覆われるまで埋め込み剤を追加し続けます。気泡が入らないように慎重に操作し、埋め込まれた肺葉を4 °Cで20分間インキュベートします。次に、ドライアイスとイソペンタンの混合液でゆっくりと凍結させ、包埋した肺を切片作成用に準備します。必要に応じて、-80 °Cのフリーザーに移して保存することが可能です。クライオスタットを用いて、葉から7～10 µmの凍結切片を作成し、市販の凍結切片用スライドガラスに貼付します。貼付後、直ちに切片をXAL染色液に浸し、加湿チャンバー内で37 °Cで24時間インキュベートします。翌日、PBSでスライドガラスを2回、1回につき5分間洗浄します。続いて、蒸留水で短時間すすぎます。次に、核快紅（nuclear fast red）で10秒間対比染色し、xalをより際立たせるための淡い対比染色を施した後、直ちに蒸留水で対比染色液を洗い流します。より濃い対比染色が必要な場合は、染色時間を30秒以上に延長してください。イムノマウントを用いてスライドを封入します。done LM eightマウスOSモデルにおける転移の形成を再調査しました。laxyを形質導入した細胞と非形質導入のコントロールdoneおよびLM8細胞を同時に注入したマウス、およびコントロールdone細胞を注入したマウスの、灌流および非灌流肺の代表的な画像を、ここに記載の通り使用しました。非灌流および灌流肺において、肉眼的および顕微鏡的な転移は検出されませんでした。しかし興味深いことに、dun LA Z細胞を注入したマウスでは、xgl染色により、非灌流肺の表面に単一細胞または少数の細胞クラスターからなる青色の微小転移 foci が認められました。肺のin situ灌流および固定により、dun la z微小転移の検出能はさらに向上しましたが、対照のLM eight細胞を注入したマウスでは肉眼的fociへの増殖は見られませんでした。直径0.1 millimeter以上の、半透明でかろうじて検出可能な肉眼的転移 foci が非灌流肺で認められました。肺の灌流を行っても、これらのfociの検出能は向上しませんでした。しかしながら、ate LAC Z細胞を注入したマウスでは、非灌流臓器の表面にX gal染色の青色を呈する複数のマクロ転移が検出されました。また、非灌流臓器の表面にはマイクロ転移も検出されました。さらに、肺を灌流することで、マクロ転移およびマイクロ転移の検出能がさらに向上しました。その結果、灌流した組織の透明度が高まったことで、臓器表面の下にある病巣も可視化され、微小転移および巨視的転移がより高い密度で、より多く認められるようになりました。肺組織の凍結切片を用いた追加の組織学的解析により、LAX Z導入細胞およびLM8細胞を注入したマウス、ならびにDun LAX Z細胞由来の原発腫瘍を持つマウスにおいて、肺転移の検出能が向上したことが確認されました。肺切片において、微小転移あるいは単一細胞レベルの病巣が認識されました。これは、それぞれの対照細胞の原発腫瘍を持つマウスでは観察されませんでした。さらに、マクロ転移は、対照のLM eight細胞を注入した動物よりも、LM eight LA C細胞を注入したマウスにおいてより明確に確認されました。このビデオを視聴することで、ZE2における肺灌流および固定の手順と、それに続く摘出肺における転移の摘出後染色の方法について、十分に理解できるはずです。この手法は、あらゆる種類のがん研究において肺への転移分布を評価するための極めて感度の高いエンドポイント読み出し法であり、また、転移病変の早期検出に用いられるmicro CT、PET、MRIなどの現在のin vivoイメージング技術の改善に向けたベンチマークとしても活用できます。

improved-visualization-lung-metastases-at-single-cell-resolution-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

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学ぶマウス肺転移の単一細胞解像度検出法。in-situ灌流とX-Gal染色を組み合わせ、血液由来の背景を除去し微小転移の可視化を向上させる。組織構造を保ちながら高感度に転移巣を検出できる。

組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上

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