組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上のin-situ灌流 lacZをタグ付き腫瘍細胞
2012年8月21日
本研究で報告された新たなプロトコルが組み合わせによるマウスの単一細胞の解像度で肺転移の選択的検出を可能にのin-situ肺血流との固定とX-Gal染色 lacZをタグ付きの腫瘍細胞。
この手順の全体的な目標は、膨らんだ肺の構造を維持しながら、ex vivo でのマウス肺の微小転移の検出を改善することです。これは、最初にPBSを使用して肺をin situUに灌流して、その組織の色の背景の主な原因である血液を除去することによって達成されます。次のステップは、PFAの注射によって肺を膨らませ、次にピンチオフして膨らませた状態で肺組織を固定することです。
次に、肺を切除し、さらにPFAに固定するか、または凍結切片のために単一の肺葉を埋め込みます。最後のステップは、Xal溶液で組織を染色し、LAザグ腫瘍細胞を視覚化することです。最終的には、全肺葉または肺組織切片への転移を双眼顕微鏡または光学顕微鏡で単一細胞レベルまで検出できます。この手法の主な利点は、空が自立しているような既存の方法と比較して、血液関連の背景の除去により微小転移の検出可能性が大幅に向上することです。
約 150 マイクロリットルの PBS にケタミン、キシラジン、およびエース プロマジンの腹腔内注射でマウスを麻酔することからプロトコルを開始します。マウスの痛みの反射が観察されなくなったら、手術台に固定します。背中を下げて、70%エタノールで髪をなめら
かにします。腹部から首にかけて皮膚を開きます。皮膚を側面に引っ張るか、取り除きます。胸部の腹膜を慎重に開いて、ベニナ頸静脈のような大きな血管の破裂を防ぎます。
これにより、灌流の効率が向上します。次に、21〜24ゲージの針が付いた20ミリリットルの注射器を使用して、肝臓の下の大静脈カルディスを切断します。肺が完全に白くなり、心臓の鼓動が止まるまで、鼓動している心臓の右心室に10〜15ミリリットルのPBSをゆっくりと注入します。
次に、血管クランプで肝臓と横隔膜の上の血管をつまみます。10ミリリットルのシリンジに3%パラホルムアルデヒドを入れ、21〜24ゲージの針を右心室に注入します。約2ミリリットル。
胸部の外側の気管を露出させ、胸部の外側から約3ミリリットルのアルデヒドを気管に注射して肺を膨らませます。次に、針を取り外した直後に、血管クランプで穿刺に寄り添った気管をつまみ、10分間待って固定します。次に、血管クランプの上の血管を横断します。
次に、クランプを取り外し、約2ミリリットルのPBSを右心室に注入して、余分なパワーホルムアルデヒドを取り除きます。すべての肺葉の下部を針で穿刺し、気管の血管クランプを取り外します。次に、3〜5ミリリットルの希釈包埋液を、もう一方の注射に甘やかされた気管に注入します。
肺たぶに隠れているパラフォームが溶液に置き換わったら、注射を止めます。鉗子で心臓を引っ張り、結合組織の靭帯、血管、気管を横断することにより、肺を慎重に切除します。心臓を肺に接続したままにしてください。
クライオ切片用に1つの葉を確保し、残りの肺組織全体を長時間染色します。蓋がしっかりと閉まるプラスチックカップに肺を入れ、2%ホルムアルデヒドとPBSで固定します。肺の上にガーゼを敷いて溶液に保持し、室温で30分間放置します。
30分後、固定液を取り出し、PB S3で組織を徹底的に洗浄し、1ミリリットルのXalストック溶液を1〜40個を基本的な染色液で希釈し、少なくとも10ミリリットルをカップに加えることにより、すぐに使用できるxal溶液を新たに調製します。ガーゼで肺を沈めます。蓋を緩く固定して空気交換を可能にし、光から保護されて摂氏37度で3〜5時間インキュベートします。
インキュベーション後、xal溶液を取り出します。肺をPBSで一度すすぎ、残留xal溶液を取り除き、PBSに少なくとも10ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドを追加します。.組織は組織学の準備ができており、摂氏4度で4%PFAに長期間保存することができます。
まず、埋込み型の3分の1を原液のポリフォルツェ埋込み用具で満たします。次に、肺葉を型にロードし、ローブが完全に覆われるまで培地を追加し続けます。気泡を作らないように注意して、埋め込まれたローブを摂氏4度で20分間インキュベートします。
次に、埋め込まれた肺をドライアイスとイソップペンタンの混合物でゆっくりと凍結することにより、切片化のために準備します。必要に応じて、マイナス80°Cの冷凍庫に移してクライオスタットに保管することができます ローブの7〜10ミクロンのクライオセクションをカット セクションを市販のクライオセクションにマウントします 準備ができたスライド マウントしたら、すぐに37°Cのxal染色溶液でセクションを加湿チャンバー内で24時間インキュベートします。翌日、スライドをPBSで2回、すすぎごとに5分間すすぎます。
これに続いて、蒸留水で短時間すすぎます。次に、スライドを核ファストレッドで10秒間カウンターステインして、xalをより優勢にする弱いカウンターステインを取得し、すぐにカウンターステインを蒸留水ですすいでください。カウンターステインを暗くするには、時間を最大30秒以上延長します。
スライドをイムノマウントで取り付けます。実施したLM8マウスOSモデルにおける転移の形成について再検討した。ここで述べる、制御完了細胞を注入したマウスにおいて、緩い形質導入細胞および非形質導入制御完了およびLM8細胞を同時に注射したマウスの灌流肺および非灌流肺の代表的な画像を用いた。
肉眼的および顕微鏡的転移は、灌流されていない肺および灌流された肺では検出できなかったままでした。しかし、興味深いことに、dun LA Z細胞を注射したマウスでは、xgl染色により、非灌流肺の表面に単一細胞または小細胞クラスターの青色微小転移巣が明らかになりました in situ灌流および肺の固定により、dun la Z微小転移の検出可能性がさらに向上しますが、対照LM8細胞を半透明に注射したマウスでは、巨視的病巣への伸長は観察されませんでした。 直径0.1ミリメートルを超えるかろうじて検出可能なマクロ転移巣が、灌流されていない肺で認められました。肺の灌流は病巣の検出を改善しませんでした。
しかし、ATE LAC Z細胞を注入したマウスでは、灌流されていない臓器の表面に複数のX gal stain青色マクロ転移が検出されました。微小転移は、灌流されていない臓器の表面にも検出されました。さらに、肺の灌流により、マクロおよびミクロ転移の検出可能性がさらに向上しました。
その結果、ミクロおよびマクロ転移は、主に臓器表面の下の病巣も見えるようになった灌流組織の半透明性により、より高い密度で、より多くの数で見えるようになりました。肺組織のクライオ切片を用いた追加の組織学的解析により、Dun LAX Z細胞由来の原発腫瘍を有するマウスにLAX Z形質導入完了およびLM 8細胞を注射したマウスにおける肺転移の検出可能性の改善が確認された。微小転移または単一細胞病巣でさえ、肺切片で認められました。
これは、それぞれの対照細胞の原発腫瘍を有するマウスでは観察されませんでした。さらに、マクロ転移は、LM eight LA C細胞を注射したマウスでは、対照LM eight細胞を投与した動物よりもはっきりと見えました。このビデオを見た後、ZI 2で肺灌流と固定を行う方法と、その後の切除された肺の転移の興奮染色についてよく理解しているはずです。
この技術は、あらゆる種類のがん研究において肺の転移分布について読み出される高感度のエンドポイントであり、転移性病変の早期検出に使用されるマイクロCT PETやMRIなどの現在のin vivoイメージング技術の改善のベンチマークとしても役立ちます。
概要
この研究は、マウスの肺転移を単一細胞分解能で選択的に検出するための新しいプロトコルを提示します。この方法は、in-situ 肺灌流、固定、および lacZ タグ付けされた腫瘍細胞の X-Gal 染色を組み合わせています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- 組織学
背景
- 肺内の微小転移は、血液に関連する背景のために検出が難しいです。
- 既存の方法は、単一細胞分解能で転移を視覚化する能力が不足しています。
- 改良された検出技術は、腫瘍の拡散をよりよく理解するために不可欠です。
- この研究は、肺組織内の微小転移の可視性を向上させることを目指しています。
研究の目的
- 単一細胞レベルで肺転移を検出することを可能にするプロトコルを開発すること。
- 検出プロセス中に肺構造を保存すること。
- 既存の方法と比較して微小転移の全体的な検出可能性を向上させること。
使用された方法
- 血液を除去するための PBS による in-situ 肺灌流。
- パラホルムアルデヒドを使用した肺組織の膨張および固定。
- 詳細な分析のための肺葉の埋め込みおよび凍結切片作成。
- lacZ タグ付けされた腫瘍細胞を視覚化するための X-Gal 染色。
主な結果
- 非灌流対照群と比較して、灌流された肺での微小転移の検出が向上しました。
- X-Gal 染色により、単一細胞または小クラスターの転移を識別できました。
- このプロトコルは、血液からの背景干渉を大幅に減少させます。
- 代表的な画像がこの方法の有効性を示しています。
結論
- 開発されたプロトコルは、単一細胞分解能で肺転移を検出するのに効果的です。
- この方法は、背景ノイズを減少させることで既存の技術を改良します。
- 将来の応用は、腫瘍生物学と転移の理解を深める可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate detection of micrometastases is critical for preclinical oncology studies, as undetected disease burden can lead to false-negative efficacy signals and costly late-stage failures. This protocol enhances target validation by enabling single-cell resolution visualization of lacZ-tagged tumor cells in lung tissue, reducing background interference from blood. The improved sensitivity supports mechanistic de-risking and predictive confidence in metastasis models, directly informing go/no-go decisions in therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing micrometastatic burden at single-cell resolution.
- Operational Value: Provides a low-cost, equipment-light method for functional target validation in metastasis models.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing dormant or early metastatic events otherwise missed by conventional imaging.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible tissue preparations suitable for quantitative metastasis scoring.
- Quantitative Output: X-Gal staining yields a chromogenic readout enabling digital pathology and automated counting of lacZ-positive cells.
- Platform Reuse: The perfused lung preparation serves as a reusable platform for screening anticancer compounds across multiple studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Maintains alveolar architecture and tissue morphology, ensuring metastasis detection reflects physiologically relevant lung microenvironment.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing consistent, histology-based metastasis readouts.
- Risk-Adjusted Decisions: Improves confidence in preclinical efficacy data, reducing attrition due to undetected metastatic progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing a reliable ex vivo endpoint for metastasis assessment that complements in vivo imaging modalities.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct visualization of tumor cell dissemination and colonization in lung tissue.
- Screening: Delivers standardized, background-reduced tissue samples for consistent compound evaluation in metastasis assays.
- Analytics: Produces quantitative, single-cell resolution readouts that facilitate statistical comparison across treatment groups.
- Translational Research: Ensures histological fidelity for preclinical-to-clinical extrapolation by preserving lung structure and metastatic niche.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, transferable protocol for metastasis detection across oncology discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in metastasis models by reducing false-negative detection due to vascular background.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories through defined perfusion, fixation, and staining parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by increasing the reliability of preclinical metastasis data, reducing wasted investment in ineffective candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions based on accurate micrometastatic burden assessment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse surgery, perfusion techniques, and histological processing.
- Dependent on access to perfusion equipment, cryostat, and standard histology tools (microscopes, embedding molds).
- Necessitates cross-team standardization between in vivo pharmacology and histology teams for consistent tissue handling.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of perfusion pressure and fixation timing.
- Practical limitation: X-Gal staining sensitivity depends on lacZ expression levels and may require signal amplification for low-expressing models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
In-situ Lung Perfusion and Fixation
8:00
Conclusion
3:30
Visualizing lacZ-tagged Metastatic Tumor Cells in Entire Lung Lobes
4:31
Visualizing lacZ-tagged Metastatic Tumor Cells in Lung Cryosections
5:48
Metastases Analysis in Dunn/LM8 Osteosarcoma-bearing Mice
