黒質や腹側被蓋野のドーパミン規制の包括的なプロファイリング

本手順の全体的な目的は、中脳辺縁系の体細胞樹状突起領域から採取した単一の組織切片から、ドーパミン調節に関連する分子リードアウトの情報を最大化することです。これは、まず精密な解剖を行い、黒質を腹側被蓋野から分離させることで達成されます。次に、HPLCによるドーパミン分析のために組織を処理し、さらに分析のために沈殿させた内因性タンパク質を処理します。

次に、沈殿させたタンパク質を用いて総タンパク質量を処理することで、サンプルのドーパミン組織含有量の読み取りと併せて、どのドーパミン調節タンパク質またはタンパク質リン酸化を測定できるかを決定します。最終的に、中脳の個別の細胞体・樹状突起領域におけるドーパミンおよびその調節タンパク質の分析により、ドーパミン調節に関連する分子メカニズムに関する結論を導き出すことが可能になります。

モノアミンは多くの行動上の結果に影響を及ぼしており、実際、依存症、生物学、およびパーキンソン病などの運動機能障害の分野の研究者は、私の研究室で研究しているドパミンのようなモノアミンが行動上の結果にどのように影響するかに非常に強い関心を持っています。しかし、モノアミンが分子レベルでどのように調節されているかを理解することで、モノアミンを研究することの重要性はさらに高まります。本手法の利点は、中枢神経系（CNS）組織から得られた単一のサンプルから複数のリードアウトを取得できるため、分子レベルの事象がモノアミンの調節不全にどのように影響するかについて、包括的なリードアウトを得られることです。

得られたデータを、行動にどのような影響が出るかという文脈に当てはめて考えることができます。一般的に、この手法に不慣れな人は苦労することがあります。なぜなら、タンパク質およびリン酸化の定量には、研究者が選択した抗体に応じて、正確な読み取りに必要な総タンパク質量の知識が必要だからです。そのため、この手法を視覚的に提示することが極めて重要となります。

解剖技術と、調節タンパク質を用いたモノアミン濃度の測定は、in vivoでの調節を解析するための比較的新しいアプローチです。この手順を開始するには、齧歯類の脳マトリックス、カミソリ5本と11番メスを入れたペトリ皿を、濡れた氷の上に置いて冷却します。また、解剖に必要な本数のチューブをドライアイスで予冷しておきます。

ラットを安楽死させた後、脳を取り出し、小脳の外側が氷冷マトリックスの切り欠きに適合するように、脳を逆さまに配置します。1分後、線条体および側坐核の解析のため、視交叉から吻側へ約2 mmの位置から、冷やしたカミソリブレードを冷却された脳に挿入します。その後、脳橋の中央まで1 mm間隔で冷やしたカミソリブレードを挿入し続けます。この際、マトリックスから取り出しやすくするため、各ブレードの配置をずらして挿入してください。

カミソリを抜く際、海馬の始端を確認してください。海馬が中脳を完全に包み込んでいる部位が、SNとVTAが存在することを確認するための最良の指標となります。まず、11番のメス刃を用いて切片を作成し、SNをVTAから切り離します。その後、上層にある皮質と海馬を除去してください。

次に、SNの色素沈着領域をVTAから分けるように垂直に切断します。この際、解剖の間、カミソリが常に濡れた氷に接触しているようにしてください。続いて、SNの背側および外側端のすぐ上で、正中線またはその付近で水平に切断します。最後に、SNを脳幹の残りの部分から慎重に剥離します。

SNを除去した後、VTAを中脳の残りの部分から慎重に分離します。解剖した組織を、直ちに予め冷却しておいたマイクロ遠心チューブに入れます。その後、処理を行うまで組織を-80°Cで保存します。

本手順では、ドライアイスから取り出した直後の組織を、氷冷した0.1 Mの過塩素酸EDTA溶液を用いて穏やかにホモジナイズします。その後、サンプルを再びドライアイス上に保持します。次に、サンプルを12,000 RPMで遠心分離し、沈殿させます。

ウェスタンブロットの定量に使用するタンパク質ペレットを得るため、続いて上清をHPLCバイアルに吸引します。HPLCバッファー処理によって得られた、まだ凍結している沈殿タンパク質ペレットを氷上に置いて融解させ、すべてのバッファーが除去され、保存されていることを確認します。SNの二方面処理では、300 µLの5 mM Trisおよび1 mM EDTAを含む1% SDSをペレットに加え、超音波処理を行います。一方、VTAの二方面処理では、200 µLの1% SDSで十分です。

次に、サンプルを沸騰水に約5分間浸し、タンパク質の変性を完了させます。その後、室温まで冷却させますが、このときキャップが確実に閉まっていることを確認してください。次に、2〜40 µgのタンパク質標準曲線の範囲を用いてBCAアッセイを行います。

5 µLのサンプル中のタンパク質濃度を決定するためには、3回繰り返し分析で得られた中央値を用い、標準曲線に基づいてタンパク質量を決定します。その結果をサンプル量で除して、タンパク質濃度を算出してください。その後、サンプルバッファーの色で判断し、必要に応じて還元剤としてDTTを含むサンプルバッファーを加え、10%アクリルアミドゲルでSDS電気泳動のためのサンプル調製を行ってください。

黄色に変化したら、青色が見えるまで10 µLずつ1 M Tris base (pH 8.2)をサンプルに加えてください。適切なpHであることを確認するため、10%アクリルアミドゲルを用いて適切な量の全タンパク質でSDS-PAGEを行い、次いでタンパク質を孔径0.45 µmのニトロセルロース膜に転写します。ホファータンクを少なくとも27 Vに設定し、一晩転写を行ってください。

翌日、ブロットを30分以上乾燥させます。次に、ポンソーS溶液で約5分間染色します。その後、個々のタンパク質バンドがはっきりと分かれ、背景の染まりが除去されるまで、0.2%塩酸溶液で十分に脱色します。

次に、Image Jを用いてポンソーS染色の画像を取得し、各レーンの相対的なタンパク質負荷量を定量化し、ここに示すチロシン水酸化酵素、ドーパミントランスポーター、または小胞モノアミントランスポーター2の結果を標準化します。これは、ラット黒質試料におけるSer31リン酸化チロシン水酸化酵素のウェスタンブロットです。校正済みのSer31リン酸化チロシン水酸化酵素標準曲線は0.3 nanogramsから2.0 nanogramsの範囲であり、検出の直線範囲内にあります。こちらは、ラット腹側被蓋野試料におけるSer40リン酸化チロシン水酸化酵素のウェスタンブロットです。

校正済みのSN 40リン酸化チロシン水酸化酵素標準曲線は0.2 nanogramsから1.5 nanogramsの範囲であり、検出の直線範囲内にあります。適切な温度管理およびチューブへのラベル貼付が重要です。また、結果のばらつきを抑えるために、タンパク質の正規化を行うことも重要です。

このプロトコルを徹底的に遵守することで、運動機能および依存行動分野の研究者は、脳内、特に我々が関心を持つドーパミンを中心としたモノアミン調節に影響を与える広範な分子リードアウトを得ることができます。その結果、これらのリードアウトにより、行動結果における意味についての非常に詳細かつ徹底的な分析が可能になります。このビデオを視聴することで、一度の組織切断から黒質および腹側被蓋野におけるモノアミン調節のリードアウトを最大化する方法について、十分に理解できるはずです。