Name: 黒質や腹側被蓋野のドーパミン規制の包括的なプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学ぶ 黒質と腹側被蓋野の精密解剖法とHPLCによるドーパミン定量、タンパク質リン酸化解析を用いた包括的プロファイリング手法。単一組織から分子メカニズムを解明し、神経精神疾患研究に貢献します。

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この作品、として2,10を挙げて 、のための資金は、老化研究、エドワード·P.スタイルズ信託基金とノースウエストルイジアナ州の医学研究財団のためのアメリカ連合からMFサルバトーレの研究助成賞を受賞することによって、部分的には、提供されていましたとBSプルエットにアイクMuslow博士号を取得する前のフェローシップ、LSUの健康科学センターシュリーブポートから。

<ol><li>Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substantia+nigra+pars+reticulate+is+a+highly+potent+site+of+action+for+the+behavioral+effects+of+the+D1+antagonist+SCH23390+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat.</a> Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).</li>
<li>Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+reveals+a+role+for+nigral+tyrosine+hydroxylase+ser31+phosphorylation+in+locomotor+activity+generation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation.</a> PLoS ONE. 4, e8466(2009).</li>
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<li>Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+dopamine+regulation+in+mesoaccumbens+pathway+in+response+to+non-contigent+binge+and+escalating+methamphetamine+regimens+in+the+Wistar+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat.</a> Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).</li>
<li>Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+infusion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+into+the+ventral+tegmental+area+induces+long-lasting+potentiation+of+cocaine+seeking+after+withdrawal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal.</a> J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).</li>
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<li>Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+GDNF+administration+increases+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+rat+striatum+and+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra.</a> J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).</li>
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<li>Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+in+the+nigrostriatal+and+mesolimbic+systems+in+vivo%3A+Effects+of+acute+haloperidol+and+related+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds.</a> J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).</li>
<li>Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization-stimulated+catecholamine+biosynthesis%3A+involvement+of+protein+kinases+and+tyrosine+hydroxylase+phosphorylation+sites+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ.</a> J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).</li>
<li>Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+serine-19+phosphorylation+in+regulating+tyrosine+hydroxylase+studied+with+site-+and+phosphospecific+antibodies+and+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis.</a> J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).</li>
<li>Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tyrosine+hydroxylase+activity+and+phosphorylation+at+ser19+and+ser40+via+activation+of+glutamate+NMDA+receptors+in+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum.</a> J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

図1に概説され、上記詳述した方法は、ドーパミンの複数の読み出しおよびラットまたはマウスから得られたSNまたはVTAの1つのサンプルから、その調節タンパク質TH、DAT、およびVMA​​T2を生成する必要があります。再び、このプロトコルを実施する利点は、研究者はドーパミンが実質的にすべての実験的なパラダイムの下でin vivoでの規制と、そうすることで、いずれかに必要な動物数を減らすことによって、重要な実験的なリソースを節約する方法の運用をマッチさせた読み出しを得ることができるということです実験。 それは研究者が氷冷HPLCバッファ内の解剖（4°C）、組織の記憶（少なくとも-70°C）、組織の超音波処理（貯蔵温度から除去した後、ただちに超音波）に課せられた温度条件を観察し、ことが絶対不可欠である後続のペレットの形成と処理。ペレットを超音波処理し、SDS溶液で煮沸した後、サンプルはフュルトであり続けることができるERは、室温で処理されます。アーカイブされたHPLCのストレージは、サンプルを分析し、タンパク質分析用のサンプルバッファー調製したサンプルは-80℃と...

HPLCシステム： 基本的なシステムは島津LC10-ADvp HPLCポンプ、ウォーターズWISP 717自動サンプルインジェクター、250 X 4.4ミリメートル、5ミクロンSpherosorb ODS-1 C18逆相カラム（Waters）、バイオ分析システム（BAS）TL12デュアルガラスで構成されています炭素電極、2 BAS LC4B電気化学検出器、およびウォーターズは、2のデータ収集およびデータの統合システムに力を与える。 列は30から45°C（BAS LC22Aカラムヒーター）に維持されています。移動相は0.1 Mリン酸ナトリウム液（pH3.0）、0.1mMのEDTA、0.2から0.4 mMの1 - オクタンスルホン酸（イーストマンコダック - ）、および0.35％0.45ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリル（v / v）である。流量は1.2 ml /分である。移動相の4リットルのバッチは、pH、オクタンスルホン酸およびカラム温度を調整することにより、分離のために最適化されています。移動相はリサイクルされており、継続的に溶存酸素を除去するためにヘリウムガスでパージされています。移動相のリサイクル合理的な期間のために良好な分解能を維持するためにほとんど不可欠である。移動相の貯蔵寿命は、各実行の最初の2から7分を無駄にそらすために、フロースイッチ（積分器によって制御される）を使用することによって維持されています。 電極はAg/AgC1参照電極に対して約0.78と0.95Vの電位で維持されています。より高い電位での電極は、トリプトファン（およびNMDA内部標準）を決定するために排他的に使用されます。 0.78 Vの電位はトリプトファン以外のモノアミン及びその化合物の検出のための雑音比に優れた信号を提供します。クロマトグラムをエンパワーワークステーションのハードドライブに保存され、その後、処理され、データは代謝産物の量およびグループのデータのコンパイルを計算するためのExcelスプレッドシートに直接転送されます。 ポンプ：島津LC-10AD 細胞：BASクロスフロー。 0.780および0.9で作用電極グラッシーカーボン50 Vの可能性。 検出器：BAS LC-4Bは、デュアルチャネルモードで動作する。 データACQ。システム：ウォーターズはPro 2をエンパワー。 インジェクター：ウォーターズWISP 717 カラム：ウォーターズSpherosorb ODS-1、5μm粒子、4.4ミリメートルX 250ミリメートル。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） </td><td> - JTベーカー</td><td> 4095から02 </td></tr><tr><td> Trizmaベース</td><td>シグマ</td><td> T1503-1KG </td></tr><tr><td> Trizma HClを</td><td>シグマ</td><td> T3253-1KG </td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ</td><td> G8773-500 mLの</td></tr><tr><td> PVP-40 </td><td>シグマ</td><td> PVP40-1KG </td></tr><tr><td> DPBS </td><td>ギブコ</td><td> 21600-069 </td></tr><tr><td> Tween20を</td><td>シグマ</td><td> P1379-500 mLの</td></tr><tr><td>グリシン</td><td>シグマ</td><td> G8898-1KG</td></tr><tr><td>ポンソーS </td><td>フルカ</td><td> 81460 </td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>シグマ</td><td> B8026-5G </td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>シグマ</td><td> D-9163 </td></tr><tr><td>タンパク質標準2mgのBSA </td><td>シグマ</td><td> P5619-25VL </td></tr><tr><td>ピアスBCAタンパク質アッセイ試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 23223 </td></tr><tr><td>プレシジョンプラスプロテインスタンダード</td><td>バイオラッド社</td><td> 161-0373 </td></tr><tr><td> [125] - 蛋白質、特定のアクティビティ</td><td>パーキンエルマー</td><td></td></tr></tbody></table> 表2特定の試薬 ​​が含まれています。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 式 </td></tr><tr><td> 10％SDS </td><td> 10グラムSDS、100 mLのDI H 2 0 </td></tr><tr><td> 1％SDS液（pH〜8.2） </td><td><ol><li> 10 mLの10％SDS </li><li> 60.5 mgのTrizmaベース</li><li> 37.22 mgのEDTA </li><li> 90mLのDI H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td>銅II硫酸溶液</td><td><ol><li> 1グラムの銅II硫酸</li><li> 25mLのDI H 2 0 </li></ol></td></tr><tr><td> 3Xサンプルバッファー</td><td><ol><li> Trizmaベース2.27グラム</li><li> SDS 6グラム</li><li>ジチオスレイトール0.463グラム</li><li>グリセロール30グラム</li><li>ブロモフェノールブルー10mgを</li><li> DIH 2 0（最初にメスシリンダーにH 2 O 40 mLに上記の試薬 ​​を加える;体積を100 mLに達するまで、その後H 2 0を追加） </li><li>塩酸（6.85のpHに到達するために、必要に応じて追加） </li><li> 50 2.0 mLチューブ内の溶液を凍結する。 </li></ol> （100 mLを行う）：3Xサンプルバッファーのボリュームは、サンプルで使用されているSDSの=½のボリュームを必要としていました。 </td></tr><tr><td> 1Xサンプルバッファー</td><td> DI H 2 0を使用して1Xサンプルバッファーに3Xサンプルバッファーを希釈する</td></tr><tr><td> 10X<html>ランニング緩衝液（4 Lになります） </td><td><ol><li> Trizmaベース121.1グラム</li><li>グリシン577グラム</li><li> SDS 40グラム</li></ol></td></tr><tr><td> 10X転送バッファ（4 Lになります） </td><td><ol><li>グリシン360グラム</li><li> Trizmaベース96グラム</li></ol></td></tr><tr><td>ポンソー</td><td><ol><li>ポンソーS·0.5グラム</li><li>酢酸5 mLを</li><li> DI H 2 0〜95 mLの</li></ol></td></tr><tr><td> 0.2パーセントのHCl溶液</td><td> DI H 2 O 500mlを5.2 mLの塩酸</td></tr><tr><td> PVP-T20はSolnをブロックします。 （4 Lになります） </td><td><ol><li> PVP-40 40グラム</li><li> DPBS 38.2グラム</li><li> Tween20を2グラム</li><li> Thimerisol 0.4グラム</li><li> 1MトリスpHは7.6（60.6グラムトリスHCl + 500mlのDI H 2 0 13.9グラムトリスベース） - 50 mLの</li></ol></td></tr><tr><td> 10Xブロット緩衝液（4 Lになります） </td><td><ol><li> Tween 20を20グラム</li><li>トリスベース14グラム</li><li>トリスHCl 61グラム</li></ol></td></tr></tbody></table>ontent &quot;&gt; 表3。タンパク質アッセイおよびウェスタンブロッティング式。 チロシン水酸化酵素の基準：この研究室で使用されるキャリブレーションTH蛋白質およびリンの基準は、最終的にドクター·ジョン干し草の山11の研究室に由来する以前にキャリブレーションTH規格に対してTHタンパク質含有量とリン化学量論を分析したPC12細胞抽出物から誘導される。

黒質や腹側被蓋野のドーパミン規制の包括的なプロファイリング

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

ドーパミンは中枢神経系で精力的に研究神経伝達物質である。確かに、その自発運動への関与と報酬に関連する動作は、ドーパミン調節に関連する分子の不備にお問い合わせの五十年を促進しています。線条体および側坐核、黒質線条体とmesoaccumbens経路のターミナルフィールド領域におけるその調節の分子基盤に応じて脳フォーカスのドーパミン調節のこれらの問い合わせが多数。さらに、このような研究が唯一のウェットティッシュの重量に正規化とドーパミン組織含有量の分析に集中している。そのようなチロシンヒドロキシラーゼ（TH）タンパク質、THのリン酸化、ドーパミントランスポーター（DAT）、および小胞モノアミン輸送体2（VMAT2）タンパク質として、ドーパミン調節するタンパク質の研究は、しばしば同一のサンプルにおけるドーパミン組織含有量の分析が含まれていません。ドーパミン組織のコンテンツとその調節タンパク質（ポスト-TRAを含む両方を分析する能力nslational変更）TH、DATのタンパク質レベルと機能とドーパミンの関係を解釈する固有の力を与える、またはVMAT2だけでなく、サンプルの経済を拡張するだけでなく。この低コストに変換し、さらには研究者の選択の事実上すべてのパラダイムにおけるドーパミンの分子制御への洞察を生成します。 我々は中脳での分析の焦点を合わせる。 SNとVTAは、通常、ドーパミン調節のほとんどの研究では無視されていますが、これらの核は簡単に実践して解剖されています。包括的なドーパミン組織のコンテンツとTHの読み出し、DAT、またはVMAT2を行うことができる。そこに行動上のSNとVTAのドーパミン機能の影響に関する文献を急成長し、そこに1から5外因性物質または疾患過程のimpingementsされています。さらに、成長因子などの化合物は、SNまたはVTAで比較的大きい程度に、ドーパミンやドーパミン調節蛋白質に大きな影響を持っている<sup&gt; 6-8したがって、この方法論は、特定の治療法は行動とドーパミンの調節を調節する方法でそれらの照会を拡張する研究室への参照のために提示されています。ここでは、マルチステップ法がげっ歯類の脳から黒質およびVTAドーパミン組織からコンテンツの分析、THのタンパク質レベル、DAT、またはVMAT2、およびTHリン酸化のために提示されています。 THリン酸化の解析だけではなく、TH活性が調節されている方法ではなく、与えられたパラダイムの細胞体核に影響を受けたシグナル伝達カスケードに重要な洞察を得ることができます。 我々は、これらの2つの核とそれぞれの原子核（図1）の特定のin vivoでのドーパミン調節の分子機構を明らかにプロファイルを生成し、解剖組織サンプル処理を分離するために解剖の手法を説明します。

ドーパミンは、はっきりとドーパミンニューロンの細胞体と樹状突起を含む脳核、で規制されています。ここでは黒質（SN）とげっ歯類では腹側被蓋野（VTA）の中​​脳核のドーパミン調節では、結果を最大化するために解剖し、サンプル処理のアプローチを説明し、その結果、結論と洞察力。

ドーパミンは、中枢神経系（CNS）において精力的に研究されている神経伝達物質である。実際、運動機能および報酬関連行動への関与により、5つの…

本手順の全体的な目的は、中脳辺縁系の体細胞樹状突起領域から採取した単一の組織切片から、ドーパミン調節に関連する分子リードアウトの情報を最大化することです。これは、まず精密な解剖を行い、黒質を腹側被蓋野から分離させることで達成されます。次に、HPLCによるドーパミン分析のために組織を処理し、さらに分析のために沈殿させた内因性タンパク質を処理します。次に、沈殿させたタンパク質を用いて総タンパク質量を処理することで、サンプルのドーパミン組織含有量の読み取りと併せて、どのドーパミン調節タンパク質またはタンパク質リン酸化を測定できるかを決定します。最終的に、中脳の個別の細胞体・樹状突起領域におけるドーパミンおよびその調節タンパク質の分析により、ドーパミン調節に関連する分子メカニズムに関する結論を導き出すことが可能になります。モノアミンは多くの行動上の結果に影響を及ぼしており、実際、依存症、生物学、およびパーキンソン病などの運動機能障害の分野の研究者は、私の研究室で研究しているドパミンのようなモノアミンが行動上の結果にどのように影響するかに非常に強い関心を持っています。しかし、モノアミンが分子レベルでどのように調節されているかを理解することで、モノアミンを研究することの重要性はさらに高まります。本手法の利点は、中枢神経系（CNS）組織から得られた単一のサンプルから複数のリードアウトを取得できるため、分子レベルの事象がモノアミンの調節不全にどのように影響するかについて、包括的なリードアウトを得られることです。得られたデータを、行動にどのような影響が出るかという文脈に当てはめて考えることができます。一般的に、この手法に不慣れな人は苦労することがあります。なぜなら、タンパク質およびリン酸化の定量には、研究者が選択した抗体に応じて、正確な読み取りに必要な総タンパク質量の知識が必要だからです。そのため、この手法を視覚的に提示することが極めて重要となります。解剖技術と、調節タンパク質を用いたモノアミン濃度の測定は、in vivoでの調節を解析するための比較的新しいアプローチです。この手順を開始するには、齧歯類の脳マトリックス、カミソリ5本と11番メスを入れたペトリ皿を、濡れた氷の上に置いて冷却します。また、解剖に必要な本数のチューブをドライアイスで予冷しておきます。ラットを安楽死させた後、脳を取り出し、小脳の外側が氷冷マトリックスの切り欠きに適合するように、脳を逆さまに配置します。1分後、線条体および側坐核の解析のため、視交叉から吻側へ約2 mmの位置から、冷やしたカミソリブレードを冷却された脳に挿入します。その後、脳橋の中央まで1 mm間隔で冷やしたカミソリブレードを挿入し続けます。この際、マトリックスから取り出しやすくするため、各ブレードの配置をずらして挿入してください。カミソリを抜く際、海馬の始端を確認してください。海馬が中脳を完全に包み込んでいる部位が、SNとVTAが存在することを確認するための最良の指標となります。まず、11番のメス刃を用いて切片を作成し、SNをVTAから切り離します。その後、上層にある皮質と海馬を除去してください。次に、SNの色素沈着領域をVTAから分けるように垂直に切断します。この際、解剖の間、カミソリが常に濡れた氷に接触しているようにしてください。続いて、SNの背側および外側端のすぐ上で、正中線またはその付近で水平に切断します。最後に、SNを脳幹の残りの部分から慎重に剥離します。SNを除去した後、VTAを中脳の残りの部分から慎重に分離します。解剖した組織を、直ちに予め冷却しておいたマイクロ遠心チューブに入れます。その後、処理を行うまで組織を-80°Cで保存します。本手順では、ドライアイスから取り出した直後の組織を、氷冷した0.1 Mの過塩素酸EDTA溶液を用いて穏やかにホモジナイズします。その後、サンプルを再びドライアイス上に保持します。次に、サンプルを12,000 RPMで遠心分離し、沈殿させます。ウェスタンブロットの定量に使用するタンパク質ペレットを得るため、続いて上清をHPLCバイアルに吸引します。HPLCバッファー処理によって得られた、まだ凍結している沈殿タンパク質ペレットを氷上に置いて融解させ、すべてのバッファーが除去され、保存されていることを確認します。SNの二方面処理では、300 µLの5 mM Trisおよび1 mM EDTAを含む1% SDSをペレットに加え、超音波処理を行います。一方、VTAの二方面処理では、200 µLの1% SDSで十分です。次に、サンプルを沸騰水に約5分間浸し、タンパク質の変性を完了させます。その後、室温まで冷却させますが、このときキャップが確実に閉まっていることを確認してください。次に、2〜40 µgのタンパク質標準曲線の範囲を用いてBCAアッセイを行います。5 µLのサンプル中のタンパク質濃度を決定するためには、3回繰り返し分析で得られた中央値を用い、標準曲線に基づいてタンパク質量を決定します。その結果をサンプル量で除して、タンパク質濃度を算出してください。その後、サンプルバッファーの色で判断し、必要に応じて還元剤としてDTTを含むサンプルバッファーを加え、10%アクリルアミドゲルでSDS電気泳動のためのサンプル調製を行ってください。黄色に変化したら、青色が見えるまで10 µLずつ1 M Tris base (pH 8.2)をサンプルに加えてください。適切なpHであることを確認するため、10%アクリルアミドゲルを用いて適切な量の全タンパク質でSDS-PAGEを行い、次いでタンパク質を孔径0.45 µmのニトロセルロース膜に転写します。ホファータンクを少なくとも27 Vに設定し、一晩転写を行ってください。翌日、ブロットを30分以上乾燥させます。次に、ポンソーS溶液で約5分間染色します。その後、個々のタンパク質バンドがはっきりと分かれ、背景の染まりが除去されるまで、0.2%塩酸溶液で十分に脱色します。次に、Image Jを用いてポンソーS染色の画像を取得し、各レーンの相対的なタンパク質負荷量を定量化し、ここに示すチロシン水酸化酵素、ドーパミントランスポーター、または小胞モノアミントランスポーター2の結果を標準化します。これは、ラット黒質試料におけるSer31リン酸化チロシン水酸化酵素のウェスタンブロットです。校正済みのSer31リン酸化チロシン水酸化酵素標準曲線は0.3 nanogramsから2.0 nanogramsの範囲であり、検出の直線範囲内にあります。こちらは、ラット腹側被蓋野試料におけるSer40リン酸化チロシン水酸化酵素のウェスタンブロットです。校正済みのSN 40リン酸化チロシン水酸化酵素標準曲線は0.2 nanogramsから1.5 nanogramsの範囲であり、検出の直線範囲内にあります。適切な温度管理およびチューブへのラベル貼付が重要です。また、結果のばらつきを抑えるために、タンパク質の正規化を行うことも重要です。このプロトコルを徹底的に遵守することで、運動機能および依存行動分野の研究者は、脳内、特に我々が関心を持つドーパミンを中心としたモノアミン調節に影響を与える広範な分子リードアウトを得ることができます。その結果、これらのリードアウトにより、行動結果における意味についての非常に詳細かつ徹底的な分析が可能になります。このビデオを視聴することで、一度の組織切断から黒質および腹側被蓋野におけるモノアミン調節のリードアウトを最大化する方法について、十分に理解できるはずです。

comprehensive-profiling-dopamine-regulation-substantia-nigra-ventral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

マウスの内側前脳束の片側6-OHDAの病変を行うためのプロトコルが記述されています。このメソッドは、線条体ドーパミンと90.63の&gt;...

パーキンソン病の単方向、病変6-OHDAモデルマウスの開発

線条体の脳切片に電気的に誘発シナプス前ドーパミンのダイナミクスを測定するための高速スキャンサイクリックボルタンメトリーを使用する。...

高速スキャンサイクリックボルタンメトリーによる線条体の脳スライスにおけるシナプス前ドーパミンのダイナミクス

このビデオは、麻酔をかけたラットに電極とカニューレを埋め込んで、ポテンショスタットを使用して側坐核のドーパミン放出を測定し、腹側被蓋領域のドーパミン作動性活性を調節するための薬物を注入する方法を示しています。...

VTAドーパミン作動性ニューロン受容体操作によるラットモデルにおけるドーパミン放出のモニタリング

このプロトコルは、成体マウスの適応行動と脳修復の根底にある環境誘発性の脳変化を研究するための、2つの異なる環境操作と同時脳注入プロトコルを説明しています。...

成体マウスにおける中脳ドーパミンニューロンの数の環境モジュレーション

ファーストスキャンサイクリックボルタンメトリーは、薬剤、疾患、および他の実験的操作の文脈におけるインビボドーパミン神経伝達をモニターすることができる。この研究は、定量的な神経生物学的モデルに従って電気刺激されたドーパミン応答をモデリングしてドーパミン放出および再取り込み動態の推定を定量化するためのソフトウェアであるQNsim1.0の実施について記載している。...

QNsim1.0を用いた電気刺激されたドーパミン神経伝達データからの高速スキャンサイクリックボルタンメトリーデータのモデリング

シナプトソーム ドーパミンやドーパミン ・ トランスポーターの機能と線条体組織中ドパミンのレベルを評価することによりマウスにおけるドーパミン恒常性を調査するため高速液体クロマトグラフィー分析を表す実験ツールそれぞれ。ここでドーパミン組織量を測定、ドーパミン ・ トランスポーターの機能を評価するプロトコルを提案する.

高速液体クロマトグラフィー分析とシナプトソーム ドーパミンによるマウスにおけるドーパミン作動性恒常性の評価

側坐核ドーパミン D1-アルファ受容体の同定は、中枢神経系疾患の中に D1 受容体の機能不全を明らかにするため重要です。特定の脳領域の RNA 分子を可視化する交配アッセイの in situ新規 RNA...

検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

このプロトコルの目標は、直接腹側テグメンタル領域受容体を操作して、第二次ドーパミン放出への寄与を研究することです。...

高速スキャン環状ボルタンメトリー(CIS-FSCV)による注入と刺激を組み合わせて、パジカルドーパミンの腹側テグメンタル領域受容体調節を評価する

ここでは、ラットの実質的なニグラ・パルス・コンパクでのドーパミン作動性ニューロン数の半定量的決定のための自動化された方法を提示する。...

自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチングニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定

このプロトコルは、黒質のニューロメラニン感受性磁気共鳴画像データを取得する方法を示しています。...

黒質のニューロメラニン感受性磁気共鳴イメージングのための標準化されたデータ取得

学ぶ 黒質と腹側被蓋野の精密解剖法とHPLCによるドーパミン定量、タンパク質リン酸化解析を用いた包括的プロファイリング手法。単一組織から分子メカニズムを解明し、神経精神疾患研究に貢献します。

黒質や腹側被蓋野のドーパミン規制の包括的なプロファイリング

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