水性を検出するタンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過と熱解離のステップを使用し変更されたEPAメソッド1623

この手順の全体的な目的は、水中に存在するクリプトスポリジウムおよびジアルジア属の種を検出し、可視化することです。まず、タンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過を用いて水試料を濃縮します。次に、遠心分離ステップを経て、ろ過膜から微生物を溶出し、不純物を除去します。

免疫磁気分離により、濃縮されたデブリから寄生虫を選択的に分離することが可能です。熱解離によって磁気ビーズを寄生虫から切り離し、磁石を用いて除去します。その後、シストおよびOシストをスライドガラス上に配置し、サンプルを染色して免疫蛍光顕微鏡で可視化します。

hofiろ過の既存技術に対する主な利点は、超フィルターが大幅に安価であること、およびCryptosporidiumやGiardiaに加えて、ウイルスや細菌などの複数の微生物を捕捉できることです。一般的に、免疫分離に不慣れな方は、非常に多様な気候条件下で採取されたさまざまなサンプルに付随するデブリの量や種類に苦慮することがあります。まず、バイオセーフティキャビネット内で超ろ過装置を組み立ててください。

装置を組み立てた後の動作は以下の通りです。水サンプルが黒色のT字コネクタを通ってシステムに導入され、ポンプヘッドと圧力計を経て中空糸限外フィルターへと移動します。ろ過された水はフィルターの側面から排出され、廃棄容器に入ります。生物を含む濃縮水はリテンテートボトルへと強制的に送られ、水量が減少するまでシステム内で再循環されます。手順を開始するには、ベントキャップを取り外し、ピンチクランプ2以外のすべてのクランプを開いてください。ピンチクランプ2を閉じることで、リテンテートボトルに水が充填されるようになります。ポンプの方向を、水サンプルがフィルターに向かって流れるように設定してください。

次に、ポンプの速度を25%に調整し、リネイトボトルが3分の2まで満たされたところでポンプをオンにします。ピンチクランプ2を締め、ベントキャップを使用してボトルを素早くしっかりと密閉します。すべてのラインと継手を確認し、漏れがないことを確かめてください。

次に、メスシリンダーとタイマーまたは流量計を使用して、ポンプ速度をゆっくりと約 1.5 liters per minute まで上げ、ろ液速度（流出ラインから出る水の速度）が実際に 1.5 liters per minute であることを確認します。ろ過プロセスを監視し、液量はわずかに増減する可能性がありますが、リテンボトルが空にならないようにしてください。液量が3分の1以下に減少した場合は、ベントキャップを取り外し、ピンチクランプ2を閉じます。

再度、ボトル内の液量が3分の2になるまで待ちます。次に、ベントキャップをしっかりと閉め、クランプ2を再び開きます。サンプル容器が空になったら、すぐにピンチクランプ1を閉じ、ポンプ速度を20%に下げます。濃縮液ボトルのベントキャップを取り外し、フィルターカラムの流出液チューブと廃液タンクを接続しているランプクランプを閉じます。

ランプクランプを締めたり緩めたりして、リテンテートボトル内の容量を約200 millilitersに調整します。次に、サンプルを溶出させるためにランプクランプを締めて溶出液を流します。まず、サンプル容器に500 millilitersの溶出液を加え、その際に容器内部を洗浄します。

次に、サンプル採取ラインに接続された10 milliliterピペットを溶出液容器に入れます。ピンチクランプ1を開き、ピンチクランプ2を一時的に閉じて溶出液を吸い上げます。溶液がすべて充填されたら、ピンチクランプ1を閉じ、ピンチクランプ2を開き、ポンプ速度20%で5分間溶液を循環させます。ランプクランプを締めるか緩めて、回収ボトル内のサンプル量を約100 millilitersに調整します。

次にランプクランプを完全に締め、サンプルを1分間再循環させます。この時点で、ポンプの方向を20秒間逆転させます。これにより、tateボトルに約225 millilitersのサンプルが蓄積されます。

次に、ポンプの電源を切ります。ポンプヘッドからチューブを外し、フィルターから出ているチューブを取り出して、残っているサンプルがすべてボトルに入るように、ボトル上でチューブを保持します。その後、ボトルからすべてのチューブを取り外し、通気性のあるキャップを非通気性のキャップに交換します。

濃縮したサンプルを250 milliliterのコニカル遠心チューブに移します。容器を10 millilitersの試薬水で2回すすぎ、その洗浄液を遠心チューブに移してください。サンプルを1500 times G以上の条件で15分間遠心分離します。

遠心分離を停止させる際にブレーキを使用しないでください。遠心分離後、上清をペレットの5 mL上まで慎重に吸引します。液面の上部に留まり、O cystsおよびペレット内のcystsを吸引しないよう十分注意してください。

チューブをボルテックスし、ペレットを完全に再懸濁させます。次に、10 X SLバッファーAおよびバッファーBを各1mLずつ含むフラットサイドのdyal L 10チューブにサンプルを移します。遠心チューブを2.5mLの試薬水で2回洗浄し、その洗浄液をdyal L 10チューブに加えます。最終容量を12mLにするため、磁気ビーズ標識抗クリプトスポリジウム抗体および抗ギアジア抗体を各100µLずつチューブに加えます。

その後、回転ミキサーを用いて、チューブを室温で18 RPMで1時間回転させます。チューブの平らな面をMP sixマグネットに合わせ、チューブをマグネットから離さずに2分間ゆっくりと揺らします。平らな面を上に向けたまま、上清をデカントして取り除きます。

磁石の近くにあるチューブの平坦側にとどまっているビーズを乱さないように注意します。サンプルチューブを磁石から外し、チューブの丸い側にあるデブリを避けながら、チューブの平坦側を500 µLのバッファーAで3回洗浄します。各洗浄液を、MPCSマグネット内に保持した1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。

マグネットを垂直に配置します。チューブを閉じ、1分間緩やかに揺らします。次に、マグネットを配置したまま、チューブの底に置いたパスツールピペットを使用して上清を吸引し、1 mLのPBSをチューブにゆっくりと加えます。

ビーズペレットを乱さないように注意してください。マグネットに隣接するチューブの壁面に固定します。マグネットストリップを取り外し、ビーズが再懸濁されるまでチューブを静かに揺らしてください。

磁気ストリップを垂直位置に再度挿入します。チューブを1分間緩やかに揺らし、ビーズを乱さないように注意しながら、できるだけ多くのデブリを除去しつつ上清を吸引します。この洗浄後、マグネットを取り除き、ビーズパレットに直接50 µLの試薬水を加えます。

チューブを最大速度で50秒間ボルテックスし、ビーズを再懸濁させます。次に、サンプルを80 °Cで10分間インキュベートし、Giardiaシストとcryptosporidium oシストをビーズから解離させます。インキュベーション後、サンプルを30秒間ボルテックスします。その後、磁気ストリップを斜めの位置でMPCSに配置し、懸濁液中のシストおよびOシストからビーズを分離させます。

シストおよびOシストを含む上清をウェルスライドに転移させます。上清を同じスライドに加えて、水の添加、ボルテックス、および熱解離の工程を2回繰り返します。その後、スライドを37 °Cのスライドウォーマーに置き、懸濁液を乾燥させます。

まず、サンプルを固定するために50 µLのメタノールをスライドに滴下し、室温で乾燥させます。次に、50 µLのDPI溶液を加え、室温で2分間インキュベートします。核を染色するために、キムワイプを使用してウェルから液を吸い取りますが、この際ウェルに触れないよう注意してください。

次に、easy stainを50 µL加え、Giardiaシストおよびcryptosporidium oシストの細胞壁を染色します。サンプルを35 °Cで30分間インキュベートします。前述と同様に、Kimwipeを用いて染色液を除去します。

次に、冷やしたeasy stain固定バッファー 300 µLをゆっくりと加えます。この際、ピペットチップをウェルの外側に慎重に配置し、液体がウェル内に流れ込むようにしてください。スライドを室温で2分間インキュベートします。その後、キムワイプでバッファーを取り除き、封入剤 10 µLを適用します。サンプルの上にカバーガラスをゆっくりと載せ、気泡を取り除き、透明なネイルポリッシュでカバーガラスを封止します。蛍光顕微鏡を用い、200倍から1000倍の倍率およびfse-DPIフィルターでスライドを観察します。200倍の倍率では、嚢子（シスト）およびオーシストは、縁が明るく強調された鮮やかなアップルグリーンの蛍光を発する卵形構造として観察されます。

Cryptosporidium Oのオーシストは円形で、サイズは4〜6 µmの範囲です。Giardiaのシストはより大きく、幅が5〜15 µm、長さが8〜18 µmで、1000倍の倍率では円形または卵円形に見えます。また、DPIフィルターを使用することで、シストおよびCYSの内部構造をより詳細に観察することができます。

通常、DPI染色により空色の核として見える胞子虫が、Cryptosporidium O cysおよびGiardia Cys.DIC内に最大4個まで確認できます。顕微鏡観察は、さらなる形態学的特徴を把握できるため、寄生虫の正確な同定に役立ちます。Cryptosporidiumの胞子虫はDICで観察可能であり、Giardiaの嚢子には、視認可能な核、正中体と呼ばれる三日月型の細胞小器官、および軸糸と呼ばれる内部鞭毛構造など、1つまたは複数の識別可能な内部構造がしばしば認められます。

ホロファイバー限外ろ過の手順により、複数の微生物を捕捉できる点に留意することが重要です。さらに、濃縮されたサンプルに対してQPCRやジェノタイピングなどの他の検出アッセイを適用できるため、この手法はより柔軟であり、さまざまなアプリケーションに適応させることが可能です。ご視聴ありがとうございました。ご質問がある場合はお知らせください。