Name: 水性を検出するタンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過と熱解離のステップを使用し変更されたEPAメソッド1623クリプトスポリジウムとジアルジア属。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 学ぶタンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過と熱解離を用いた水媒介性クリプトスポリジウムとジアルジア属の検出法。免疫蛍光顕微鏡による可視化で、環境微生物学の研究に有用です。

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私たちは彼の技術サポートについては、この原稿とダグ·ハミルトンの重要なレビューのためにアングリムとマイケル·ジマーマンに感謝します。

<ol><li>DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptosporidium+and+Giardia+recoveries+in+natural+waters+by+using+Environmental+Protection+Agency+Method+1623%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952(2002).</li>
<li>Hill, V. R., Kahler, A. M., Jothikumar, N., Johnson, T. B., Hahn, D., Cromeans, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistate+evaluation+of+an+ultrafiltration-based+procedure+for+simultaneous+recovery+of+enteric+microbes+in+100-liter+tap+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 4218-4225 (2007).</li>
<li>Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Hahn, D., Narayanan, J., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Amburgey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid+method+for+simultaneous+recovery+of+diverse+microbes+in+drinking+water+by+ultrafiltration+with+sodium+polyphosphate+and+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 6878-6884 (2005).</li>
<li>Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+hollow-fiber+ultrafiltration+to+the+USEPA+VIRADEL+technique+and+USEPA+method+1623%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Qual%22%5BJournal%5D)">Comparison of hollow-fiber ultrafiltration to the USEPA VIRADEL technique and USEPA method 1623.</a> J. Environ. Qual. 38, 822-825 (2009).</li>
<li>Holowecky, P. M., James, R. R., Lorch, D. P., Straka, S. E., Lindquist, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+ultrafiltration+cartridges+for+a+water+sampling+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of ultrafiltration cartridges for a water sampling apparatus.</a> J. Appl. Microbiol. 106, 738-7347 (2009).</li>
<li>Lindquist, H. D., Harris, S., Lucas, S., Hartzel, M., Riner, D., Rochele, P., Deleon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+ultrafiltration+to+concentrate+and+detect+Bacillus+anthracis%2C+Bacillus+atrophaeus+subspecies+globigii%2C+and+Cryptosporidium+parvum+in+100-liter+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Using ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples.</a> J. Microbiol. Methods. 70, 484-492 (2007).</li>
<li>Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+1MDS+electropositive+microfilters+for+simultaneous+recovery+of+multiple+microbe+classes+from+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 260-266 (2007).</li>
<li>Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hollow-fiber+ultrafiltration+primary+concentration+of+pathogens+and+secondary+concentration+of+viruses+from%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from.</a> 176, 38-45 (2011).</li>
<li>Shaw, N. J., Villegas, L. F., Eldred, B. J., Gaynor, D. H., Warden, P. S., Pepich, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+to+EPA+Method+1623+to+address+a+unique+seasonal+matrix+effect+encountered+in+some+U.S.+source+waters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Modification to EPA Method 1623 to address a unique seasonal matrix effect encountered in some U.S. source waters.</a> J. Microbiol. Methods. 75, 445-448 (2008).</li>
<li>Simmons, O. D. 3rd, Sobsey, M. D., Heaney, C. D., Schaefer, F. W. 3rd, Francy, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+detection+of+Cryptosporidium+oocysts+in+surface+water+samples+by+method+1622+using+ultrafiltration+and+capsule+filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Concentration and detection of Cryptosporidium oocysts in surface water samples by method 1622 using ultrafiltration and capsule filtration.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 1123-1127 (2001).</li>
<li>Sobsey, M. D., Glass, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+water+quality+on+enteric+virus+concentration+by+microporous+filter+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of water quality on enteric virus concentration by microporous filter methods.</a> Appl. Environ. Microbiol. 47, 956-9560 (1984).</li>
<li>USEPA. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Office+of+Water%22">Office of Water</a>. 815-R-05-002, EPA. (2005).</li>
<li>Ware, M. W., Wymer, L., Lindquist, H. D., Schaefer, F. W. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+alternative+IMS+dissociation+procedure+for+use+with+Method+1622%3A+detection+of+Cryptosporidium+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an alternative IMS dissociation procedure for use with Method 1622: detection of Cryptosporidium in water.</a> J. Microbiol. Methods. 55, 575-583 (2003).</li>
<li>Zuckerman, U., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+continuous+flow+centrifugation+and+method+1623+for+monitoring+of+waterborne+protozoa+from+large+volumes+of+various+water+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices.</a> J. Appl. Microbiol. 100, 1220-1227 (2006).</li>
</ol>

地下水や飲料水のテクニカル·サポート·センターのオフィスと共同で研究開発の自国の官庁を通じて、米国環境保護庁は、ここで説明する研究に資金を供給した。すべての作業は、米国環境保護庁（EPA）、シンシナティ、オハイオ州でのオンサイトでサポートされていました。この資料に記載されている情報は、ショーの環境とインフラ社との契約に基づき米国環境保護庁（契約EP-C-06-031）によって完全にまたは部分的に資金を供給されていますが、それは必ずしもの見解を反映するものではありません庁と公式承認を推測する必要があります。それは代理店のレビューに付し、出版のために承認されています。

タンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過は、水からクリプトスポリジウムオーシストとジアルジアシストの初期濃度の代替と有効な手法である。中空糸限外ろ過は、従来のフィルタより安価です。それは別の水の行列の様々なクリプトスポリジウムオーシストとジアルジアシストを集中する能力を持っているので、それはEPAメソッド1623に使用されている現行の濾過技術に有用な代替手段です。他のほとんどのろ過方法と同様に、中空糸限外ろ過は、非常に濁ったサンプルで汚れが発生しやすくなります。高水圧は、フィルタ目詰まりに起因する、従ってそれはろ過の実行中に圧力を監視することをお勧めします。 クリプトスポリジウムオーシストとジアルジアシストに加えて、中空糸限外ろ過は、細菌やウイルス1-3,5,8を集中することが可能であることが示されている。中空糸限外ろ過Oこの方法でutlinedは、単一サンプル中の複数の生物を集中することができます。それは200と250ミリリットルの間の最終的な体積を求めること（OO）嚢胞が失われる可能性があり、余分な遠心操作ので、濃度の手順の重要な最後のステップ、（ステップ2.2）回避されていることは注目に値する。残留液ボトルにすべてのオーシストやシストを強制するのに十分な液量はないだろうしかし、ボトル内のボリュームが低すぎるドロップすることができますことは、回収に不利な影響を及ぼす可能性があります。したがって、それは200と250ミリリットルの間の最終的な音量を維持することをお勧めします。 熱解離法1623の酸解離のステップに代わるものです。この代替手順は、 クリプトスポリジウムオーシスト回収を改善し、川や試薬水9のいずれかから単離されたときに、メソッドのバリエーションを減らすことが示されている。酸と熱解離法のside-by-sideの比較では、解離に熱を使用していることを実証TEは、免疫磁気ビーズから生物がCryptosporidiumおよび Giardiaの両方に対して高い平均回収率を作り出した。さらに、 クリプトスポリジウムとジアルジアの回収率の精度は、酸解離9と比較して熱解離で処理した試料で良好であった。 濃縮工程としてHFUFの取り込みは、複数の生物を集中する能力を提供することによって、より柔軟にすることができます。それに加えて、現在のメソッド1623ろ過オプションへの安価な代替手段です。

<table border="1"><tbody><tr><td> 機器/試薬 </td><td> ベンダー </td><td> カタログ＃ </td></tr><tr><td>旭化成は、25 S / Rウェット中空糸限外濾過をRexeed </td><td>医療をダイヤル</td><td> REXEED25S / R </td></tr><tr><td> I / P 73（Masterflex R-3603）、または同等の</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-06408から73 </td></tr><tr><td> L / S 24（Masterflexプラチナ硬化）、または同等の</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-96410から24 </td></tr><tr><td> L / S 15（Masterflexプラチナ硬化）、または同等の</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-96410から15 </td></tr><tr><td> L / S 36（Masterflexプラチナ硬化）、または同等の</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-96410から36 </td></tr><tr><td> I / P精密ブラシレスドライブ</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-77410から10 </td></tr><tr><td> I / Pイージーロードポンプヘッド</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-7761月10日</td></tr><tr><td>黒いHDPEティー、1/4 &quot;×3/8&quot;×3/8 &quot; </td><td>米国のプラスチック</td><td> 62064 </td></tr><tr><td> Masterflex T-コネクタL / S 15から25 </td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EG-30613から12 </td></tr><tr><td>ナルゲン頑丈なPP 1 Lボトル</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-06257から10 </td></tr><tr><td> 10 mlのピ​​ペット</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 13から678-11C </td></tr><tr><td> 1/4 &quot;チューブ用ナルゲン充填/ベントキャップ、53B </td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-06258から10 </td></tr><tr><td>圧力計</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> -680-46から10 </td></tr><tr><td>ストレートカップリング、NPT（F）、1/4 &quot; </td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-06469から18 </td></tr><tr><td> NPTブランチティー、天然のPP </td><td>コー​​ルパーマー</td><td> - 30610から75 </td></tr><tr><td>ピンチクランプ、1/2 &quot; </td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-06833から00 </td></tr><tr><td> Cuのstom適合DINアダプタ</td><td>成形品（株） </td><td> MPC-855NS.250 </td></tr><tr><td>リングスタンド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14-670B </td></tr><tr><td>リングスタンドクランプ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 05から769-6Q </td></tr><tr><td>ケックランプクランプ、14ミリメートル</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-06835から10 </td></tr><tr><td>ポリリン酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 305553 </td></tr><tr><td>チオ硫酸ナトリウム五水和物</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 72050 </td></tr><tr><td>消泡剤Y-30エマルジョン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A5758 </td></tr><tr><td>トゥイーン-80 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P1754 </td></tr><tr><td> 10 L折りたたみ高密度ポリエチレンcubitainer </td><td> VWR </td><td> IR314-0025 </td></tr><tr><td>遠心ボトルラック</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 05-663-103 </td></tr><tr><td> 250ミリリットルコニカル遠心チューブ</td><td>コー​​ニング</td><td> 430776 </td></tr><tr><td>使い捨て漏斗</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> U-6122から10 </td></tr><tr><td>洗浄瓶</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> U-06252から40 </td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>ベックマン·コールター</td><td>アレグラX-15R </td></tr><tr><td>スイングバケットローター</td><td>ベックマン·コールター</td><td> ARIES SX4750 </td></tr><tr><td> 250ミリリットルコニカルチューブ用バケットアダプタを遠心分離</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 349849 </td></tr><tr><td> 200μlの大口径のピペットチップ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 02-707-134 </td></tr><tr><td> VacuShieldフィルタ</td><td>ゲルマン</td><td> 629-4402 </td></tr><tr><td> 5mlのピペット</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 13から678-11D </td></tr><tr><td>ダイナ： クリプトスポリジウム/ジアルジアコンボキット</td><td>私はDEXX </td><td> 73002 </td></tr><tr><td> 50 mlコニカル遠心チューブ</td><td>ファルコン</td><td> 352098 </td></tr><tr><td> DYNAL L10フラット両面チューブ</td><td> IDEXX </td><td> 74003 </td></tr><tr><td>タイマー</td><td> VWR </td><td> 23609-202 </td></tr><tr><td> DYNAL MPC-6磁石</td><td> IDEXX </td><td> 12002D </td></tr><tr><td> 1 mlのピ​​ペット</td><td> VWR </td><td> 53283-700 </td></tr><tr><td> 1.5ミリリットルの低接着微量遠心チューブ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 02-681-320 </td></tr><tr><td> 1000μLピペット＆対応するバリアのヒント</td><td>ギルソン</td><td> P1000/DF1000ST </td></tr><tr><td> 100μlのピペット＆対応するバリアのヒント</td><td>ギルソン</td><td> P100/DF100ST </td></tr><tr><td> 9インチのパスツールピペット</td><td> VWR </td><td> 14672-412 </td></tr><tr><td> DYNAL MPC-Sマグネット</td><td> IDEXX</td><td> 12020D </td></tr><tr><td>渦</td><td> VWR </td><td> 14216-188 </td></tr><tr><td>ダイナ回転子ミキサー</td><td> IDEXX </td><td> 94701 </td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 11-718-2 </td></tr><tr><td>ラボアーマービーズ</td><td>ラボアーマー</td><td> 42370-750 </td></tr><tr><td>デジタル体温計</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 15-077-60 </td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩1X pH7.4の（1X PBS） </td><td>シグマ</td><td> P4417 </td></tr><tr><td>シングルスポットスライド</td><td> IDEXX </td><td> 30201 </td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>コー​​ニング</td><td> 287018 </td></tr><tr><td>直接キットをEasyStain </td><td> BTF </td><td> - </td></tr><tr><td> 10μlのピペット＆対応するバリアのヒント</td><td>ギルソン</td><td> P10＆DF10ST </td></tr><tr><td> 4 &#39;、6&#39;-DiamidINO-2 - フェニルインドール二塩酸塩（DAPI） </td><td>シグマ</td><td> D9542 </td></tr><tr><td>マニキュアをクリア</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S30697 </td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> L6815 </td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>キンバリークラーク</td><td> 34155 </td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td> Boekel科学</td><td> 133000 </td></tr><tr><td>暖かいスライド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 11-474-521 </td></tr><tr><td>浸油は、ND = 1.515を入力します。 </td><td>ニコン</td><td> MXA20234 </td></tr><tr><td> DIC機能を備えたニコン90I顕微鏡</td><td>ニコン</td><td> MBA 77000 </td></tr><tr><td>計画APO 100X油浸対物</td><td>ニコン</td><td> MRD01901 </td></tr><tr><td> Achro 20Xを計画する</td><td>ニコン</td><td> MRL00202 </td></tr><tr><td> FITCフィルター</td><td>ニコン</td><td> 96302 </td></tr><tr><td> DAPIフィルター</td><td>ニコン</td><td> 96301 </td></tr><tr><td> X-citeの蛍光照明</td><td>ニコン</td><td> 87540 </td></tr><tr><td>レンズペーパー</td><td>ニコン</td><td> 76997 </td></tr><tr><td>バイオハザード使い捨て袋</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 01-829D </td></tr><tr><td>バイオハザードシャープコンテナ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14-827-117 </td></tr><tr><td> 3％の過酸化水素</td><td> VWR </td><td> BDH3540-2 </td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 1952030 </td></tr><tr><td> Wypall </td><td>キンバリークラーク</td><td> 34790 </td></tr></tbody></table>

水性を検出するタンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過と熱解離のステップを使用し変更されたepaメソッド1623<em&gt;クリプトスポリジウム</em&gt;と<em&gt;ジアルジア属。</em

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Cryptosporidiumおよび Giardiaの種が世界的に水性下痢性疾患の発生を引き起こすこと原虫最も一般的の2つです。優れたこれらの病原体の有病率を特徴づけるために、EPAメソッド1623を開発し、米国の飲料水中のこれらの生物のレベルを監視するために使用されたは12を供給しています 。メソッドは3つの主要な部分を持っています。最初の生の表層水の少なくとも10 Lがフィルタリングされているサンプルの濃度である。生物と閉じ込められた破片は、フィルターから溶出し、さらにサンプルを濃縮するために遠心分離されています。メソッドの第二部では、濃縮水のサンプルは、特に濃縮された破片から寄生虫の具体的な除去を可能にするクリプトスポリジウムオーシストとジアルジアシストにバインド免疫磁気ビーズに適用される免疫分離の手順を使用しています。これらの（OO）嚢胞は、酸解離proceことにより、磁性ビーズから切り離されdure。メソッドの最後の部分は、（OO）嚢胞が染色されたスライドに適用され、顕微鏡で列挙されて免疫蛍光染色と列挙です。 Envirochekフィルタ（ポール·コーポレーション、アナーバー、MI）、Envirochek HVフィルター（ポール·コーポレーション）、Filta-Maxのフィルター（IDEXX、ウェストブルック、MA）：方法1623は、水のクリプトスポリジウムオーシストとジアルジアシストをキャプチャするための4つの上場サンプル濃度のシステムを持っているまたは連続フロー遠心分離（Haemonetics、ブレーンツリー、MA）。しかし、 クリプトスポリジウム及びジアルジア （OO）嚢胞の回収率は1,14を使用したソース水行列およびフィルタに応じて大きく変化しています。新タンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過（HFUF）システムは、最近クリプトスポリジウムオーシストを回収する時に、より効率的で堅牢であることが示されている 様々な水行列からジアルジアのシスト、また、他のカプセルフィルターオプションよりも安価であるsと1-3,5-8,10,11同時に複数の病原体を集中することができます。さらに、ヒルらによる以前の研究では、直接Envirochek HVフィルター4と比較した場合HFUFが大幅に改善されることプトスポリジウムオーシストの回収率を示した。現在のメソッドに追加の変更は、メソッドのパフォーマンスを向上させることが報告されている。熱解離して酸解離手順を置き換えることは、いくつかの行列の9,13の磁性ビーズからクリプトスポリジウムを分離することで、より効果的であることが示された。 このプロトコルは、熱解離ステップで新しいHFUFろ過システムを使用して変更された方法1623について説明します。この修​​正法を用いたHFUFの使用は、現在のEPAメソッド1623ろ過オプションへの安価な代替手段であり、複数の生物の濃度を許容することによって、より多くの柔軟性を提供します。

このプロトコルは、水性の検出のための代替手順として、タンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過試料濃度システムの使用と熱解離について説明します。<em&gt;クリプトスポリジウム</em&gt;と<em&gt;ジアルジア</emEPAメソッド1623を使用して&gt;種。

水性を検出するタンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過と熱解離のステップを使用し変更されたEPAメソッド1623<em&gt;クリプトスポリジウム</em&gt;と<em&gt;ジアルジア属。</em

クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）属およびジアルジア（Giardia）属は、世界各地で水系下痢症のアウトブレイクを引き起こす最も一般的な原生動物の2種です。これをより適切に...

この手順の全体的な目的は、水中に存在するクリプトスポリジウムおよびジアルジア属の種を検出し、可視化することです。まず、タンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過を用いて水試料を濃縮します。次に、遠心分離ステップを経て、ろ過膜から微生物を溶出し、不純物を除去します。免疫磁気分離により、濃縮されたデブリから寄生虫を選択的に分離することが可能です。熱解離によって磁気ビーズを寄生虫から切り離し、磁石を用いて除去します。その後、シストおよびOシストをスライドガラス上に配置し、サンプルを染色して免疫蛍光顕微鏡で可視化します。hofiろ過の既存技術に対する主な利点は、超フィルターが大幅に安価であること、およびCryptosporidiumやGiardiaに加えて、ウイルスや細菌などの複数の微生物を捕捉できることです。一般的に、免疫分離に不慣れな方は、非常に多様な気候条件下で採取されたさまざまなサンプルに付随するデブリの量や種類に苦慮することがあります。まず、バイオセーフティキャビネット内で超ろ過装置を組み立ててください。装置を組み立てた後の動作は以下の通りです。水サンプルが黒色のT字コネクタを通ってシステムに導入され、ポンプヘッドと圧力計を経て中空糸限外フィルターへと移動します。ろ過された水はフィルターの側面から排出され、廃棄容器に入ります。生物を含む濃縮水はリテンテートボトルへと強制的に送られ、水量が減少するまでシステム内で再循環されます。手順を開始するには、ベントキャップを取り外し、ピンチクランプ2以外のすべてのクランプを開いてください。ピンチクランプ2を閉じることで、リテンテートボトルに水が充填されるようになります。ポンプの方向を、水サンプルがフィルターに向かって流れるように設定してください。次に、ポンプの速度を25%に調整し、リネイトボトルが3分の2まで満たされたところでポンプをオンにします。ピンチクランプ2を締め、ベントキャップを使用してボトルを素早くしっかりと密閉します。すべてのラインと継手を確認し、漏れがないことを確かめてください。次に、メスシリンダーとタイマーまたは流量計を使用して、ポンプ速度をゆっくりと約 1.5 liters per minute まで上げ、ろ液速度（流出ラインから出る水の速度）が実際に 1.5 liters per minute であることを確認します。ろ過プロセスを監視し、液量はわずかに増減する可能性がありますが、リテンボトルが空にならないようにしてください。液量が3分の1以下に減少した場合は、ベントキャップを取り外し、ピンチクランプ2を閉じます。再度、ボトル内の液量が3分の2になるまで待ちます。次に、ベントキャップをしっかりと閉め、クランプ2を再び開きます。サンプル容器が空になったら、すぐにピンチクランプ1を閉じ、ポンプ速度を20%に下げます。濃縮液ボトルのベントキャップを取り外し、フィルターカラムの流出液チューブと廃液タンクを接続しているランプクランプを閉じます。ランプクランプを締めたり緩めたりして、リテンテートボトル内の容量を約200 millilitersに調整します。次に、サンプルを溶出させるためにランプクランプを締めて溶出液を流します。まず、サンプル容器に500 millilitersの溶出液を加え、その際に容器内部を洗浄します。次に、サンプル採取ラインに接続された10 milliliterピペットを溶出液容器に入れます。ピンチクランプ1を開き、ピンチクランプ2を一時的に閉じて溶出液を吸い上げます。溶液がすべて充填されたら、ピンチクランプ1を閉じ、ピンチクランプ2を開き、ポンプ速度20%で5分間溶液を循環させます。ランプクランプを締めるか緩めて、回収ボトル内のサンプル量を約100 millilitersに調整します。次にランプクランプを完全に締め、サンプルを1分間再循環させます。この時点で、ポンプの方向を20秒間逆転させます。これにより、tateボトルに約225 millilitersのサンプルが蓄積されます。次に、ポンプの電源を切ります。ポンプヘッドからチューブを外し、フィルターから出ているチューブを取り出して、残っているサンプルがすべてボトルに入るように、ボトル上でチューブを保持します。その後、ボトルからすべてのチューブを取り外し、通気性のあるキャップを非通気性のキャップに交換します。濃縮したサンプルを250 milliliterのコニカル遠心チューブに移します。容器を10 millilitersの試薬水で2回すすぎ、その洗浄液を遠心チューブに移してください。サンプルを1500 times G以上の条件で15分間遠心分離します。遠心分離を停止させる際にブレーキを使用しないでください。遠心分離後、上清をペレットの5 mL上まで慎重に吸引します。液面の上部に留まり、O cystsおよびペレット内のcystsを吸引しないよう十分注意してください。チューブをボルテックスし、ペレットを完全に再懸濁させます。次に、10 X SLバッファーAおよびバッファーBを各1mLずつ含むフラットサイドのdyal L 10チューブにサンプルを移します。遠心チューブを2.5mLの試薬水で2回洗浄し、その洗浄液をdyal L 10チューブに加えます。最終容量を12mLにするため、磁気ビーズ標識抗クリプトスポリジウム抗体および抗ギアジア抗体を各100µLずつチューブに加えます。その後、回転ミキサーを用いて、チューブを室温で18 RPMで1時間回転させます。チューブの平らな面をMP sixマグネットに合わせ、チューブをマグネットから離さずに2分間ゆっくりと揺らします。平らな面を上に向けたまま、上清をデカントして取り除きます。磁石の近くにあるチューブの平坦側にとどまっているビーズを乱さないように注意します。サンプルチューブを磁石から外し、チューブの丸い側にあるデブリを避けながら、チューブの平坦側を500 µLのバッファーAで3回洗浄します。各洗浄液を、MPCSマグネット内に保持した1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。マグネットを垂直に配置します。チューブを閉じ、1分間緩やかに揺らします。次に、マグネットを配置したまま、チューブの底に置いたパスツールピペットを使用して上清を吸引し、1 mLのPBSをチューブにゆっくりと加えます。ビーズペレットを乱さないように注意してください。マグネットに隣接するチューブの壁面に固定します。マグネットストリップを取り外し、ビーズが再懸濁されるまでチューブを静かに揺らしてください。磁気ストリップを垂直位置に再度挿入します。チューブを1分間緩やかに揺らし、ビーズを乱さないように注意しながら、できるだけ多くのデブリを除去しつつ上清を吸引します。この洗浄後、マグネットを取り除き、ビーズパレットに直接50 µLの試薬水を加えます。チューブを最大速度で50秒間ボルテックスし、ビーズを再懸濁させます。次に、サンプルを80 °Cで10分間インキュベートし、Giardiaシストとcryptosporidium oシストをビーズから解離させます。インキュベーション後、サンプルを30秒間ボルテックスします。その後、磁気ストリップを斜めの位置でMPCSに配置し、懸濁液中のシストおよびOシストからビーズを分離させます。シストおよびOシストを含む上清をウェルスライドに転移させます。上清を同じスライドに加えて、水の添加、ボルテックス、および熱解離の工程を2回繰り返します。その後、スライドを37 °Cのスライドウォーマーに置き、懸濁液を乾燥させます。まず、サンプルを固定するために50 µLのメタノールをスライドに滴下し、室温で乾燥させます。次に、50 µLのDPI溶液を加え、室温で2分間インキュベートします。核を染色するために、キムワイプを使用してウェルから液を吸い取りますが、この際ウェルに触れないよう注意してください。次に、easy stainを50 µL加え、Giardiaシストおよびcryptosporidium oシストの細胞壁を染色します。サンプルを35 °Cで30分間インキュベートします。前述と同様に、Kimwipeを用いて染色液を除去します。次に、冷やしたeasy stain固定バッファー 300 µLをゆっくりと加えます。この際、ピペットチップをウェルの外側に慎重に配置し、液体がウェル内に流れ込むようにしてください。スライドを室温で2分間インキュベートします。その後、キムワイプでバッファーを取り除き、封入剤 10 µLを適用します。サンプルの上にカバーガラスをゆっくりと載せ、気泡を取り除き、透明なネイルポリッシュでカバーガラスを封止します。蛍光顕微鏡を用い、200倍から1000倍の倍率およびfse-DPIフィルターでスライドを観察します。200倍の倍率では、嚢子（シスト）およびオーシストは、縁が明るく強調された鮮やかなアップルグリーンの蛍光を発する卵形構造として観察されます。Cryptosporidium Oのオーシストは円形で、サイズは4〜6 µmの範囲です。Giardiaのシストはより大きく、幅が5〜15 µm、長さが8〜18 µmで、1000倍の倍率では円形または卵円形に見えます。また、DPIフィルターを使用することで、シストおよびCYSの内部構造をより詳細に観察することができます。通常、DPI染色により空色の核として見える胞子虫が、Cryptosporidium O cysおよびGiardia Cys.DIC内に最大4個まで確認できます。顕微鏡観察は、さらなる形態学的特徴を把握できるため、寄生虫の正確な同定に役立ちます。Cryptosporidiumの胞子虫はDICで観察可能であり、Giardiaの嚢子には、視認可能な核、正中体と呼ばれる三日月型の細胞小器官、および軸糸と呼ばれる内部鞭毛構造など、1つまたは複数の識別可能な内部構造がしばしば認められます。ホロファイバー限外ろ過の手順により、複数の微生物を捕捉できる点に留意することが重要です。さらに、濃縮されたサンプルに対してQPCRやジェノタイピングなどの他の検出アッセイを適用できるため、この手法はより柔軟であり、さまざまなアプリケーションに適応させることが可能です。ご視聴ありがとうございました。ご質問がある場合はお知らせください。

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