Name: 磁気共鳴イメージング、体積CT画像と超音波を用いた乳がんの骨転移のヌードラットモデルにおける血管新生のマルチモーダルイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: 学ぶ乳がん骨転移のヌードラットモデルにおける血管新生の非侵襲的評価法。MRI、VCT、超音波を用いて骨破壊病変の血管構造、血流量、灌流、透過性をリアルタイムで可視化し、悪性骨病変のイメージングと治療戦略に貢献する。

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この作品は、ドイツ学術振興（SFB-TR 23およびSFB-TR 79、TBとDK）によってサポートされていました。著者らは、優れた技術支援をLeottaとリサSeylerカリン、レナーテBangertに感謝します。

1。細胞培養<ol><li> 10％FCS（Sigma社、ドイツ）を補充したRPMI-1640培養におけるMDA-MB-231ヒト乳癌細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション）（Invitrogen社製、ドイツ）。すべての標準的な条件下で培養（37℃、加湿雰囲気、5％CO 2）と通路細胞週2-3回は、それら対数増殖に保つために保管してください。以下に説明する動物モデルでは、腫瘍テイク率が90％以上の1であるように、MDA-MB-231細胞の骨固有sublinesの使用の必要はありません。 </li><li>で2mMのEDTAを使用した後、収穫サブコンフルエントの腫瘍細胞をPBS-（2 +およびMg 2 +のCaなく、リン酸緩衝生理食塩水）と、0.25％トリプシン（Sigma社、Taufkirchen、ドイツ）。カウント·ノイバウアーのチャンバー内のMDA-MB-231細胞とRPMI-1640（1ミリリットルで5×10 5細胞）にそれらを中断します。 </li></ol> 2。骨転移のヌードラットモデル<ol><li>すべての実験は、責任政府のアニマによって承認されましたリットル倫理委員会。 </li><li> 6から8週齢でヌードラットを使用して、それらの適切な小動物系（例えばミニバリアシステム）の病原体フリーの条件下で保持します。制御された条件下で動物を飼う（21 + / - 2℃、室温、60％湿度、および12時間明暗リズム）とラットにオートクレーブ処理飼料および水を自由に摂取を提供します 。 </li><li>動物の手術前に、鎮痛薬を注入（例えば、カルプロフェン4 mg / kgを皮下あり、その単回投与と（約8時間）半減期が短いためには、カルプロフェンは、腫瘍の成長に影響を及ぼすべきではありません）。酸素の混合物（0.5リットル/ min）とイソフルラン（1〜1.5体積％）でラットを麻酔し、ラットが適切に麻酔をかけており、次の手順を開始する前に、定期的に呼吸することを確認してください。 </li><li>適切な眼の手術用顕微鏡（例えばライカ）の下で麻酔動物を配置し、16倍の倍率で動作します。 </li><li> inguで皮膚と皮下組織を切断して手術を開始します。鋏（はさみBC060rアイリス108ミリメートル）を使用して、2〜3センチメートルの長さでinal地域。大腿動脈（FA）の分岐すべての動脈は浅腹壁動脈（SEA）、下降膝動脈（DGA）、膝窩動脈（PA）と伏在動脈（SA）を含む解剖する必要があります。 </li><li>一時的にローカルの血流を閉塞するためのDGA、PAやSAにだけでなく、SEAの原点の近位大腿動脈にクリップを入れてください。 （ 図1A）出血せずに、この容器の開口を可能にするために、その遠位部でSEAをライゲーションする。 </li><li>ライゲーションの近はさみ（VannasマイクロSCRの溝STR 85ミリメートル）（ 図1B）を使用して SEAを切って、容器の緩和のために針の後続の挿入を容易にするために、SEAに1％papaverinソリューションを管理（ 図1C）。 </li><li>はさみでSEAの直径の約半分を切り取り、holdiながらSEAの内腔に針（0.3 mm径と42 mmの長さ）を挿入するngの鉗子（ 図1D、E）と容器のカット終了。利用可能な場合、血管壁の穿孔につながる不規則な動きを減らすために外部デバイスに針を固定します。針にシリンジを接続します。遠FAからクリップを削除し、伏在動脈（ 図1F）の上に置きます。 </li><li>ゆっくりと海に0.2ミリリットルのメディアに懸濁し、MDA-MB-231細胞を注入します。クリップのおかげで、MDA-MB-231細胞は、DGAとPAに送られます。針を除去し、動脈クリップを離陸する前に、出血を防ぐために、SEAを連結。外科用クリップを使用して傷を閉じ、吸入麻酔を終了します。 </li><li>ポスト·プロシージャのモニタリングのために、ラットは、通常、重度の骨格合併症を避けるために7-8週腫瘍細胞接種後に安楽死されています。この時間の間に、動物は腫瘍の大きさや痛みの証拠（例えば、行動の逸脱、体重減少、モーターの欠陥）を評価するために毎日監視する必要があります。動物が腫瘍を示している場合腫瘍の成長時の痛みの倫理的に許容限度又は証拠を超えるサイズは、彼らは安楽死する必要があります。 </li><li>免疫不全（ヌード）ラットは、ヒトMDA-MB-231乳癌細胞のxenogenous移植のために使用された。ヌードラットの方が成長する腫瘍を可視化するために選ばれていませんでした。 </li></ol> 3。磁気共鳴イメージング（MRI） <ol><li>腫瘍細胞接種後、イメージングを開始する前に、腫瘍増殖の約25-30日を許可します。 MRイメージングのために適切な動物コイルを持つ専用の実験的なスキャナや人間のMRシステムを使用しています。我々は、人間のMRシステム（シンフォニー、シーメンス、ドイツ）、83ミリメートルと120ミリメートル（ 図2A）の使用可能な長さの内径を持つ円筒共振器のボリュームとして設計された高周波励起および検出のための自作コイルを使用していました。 </li><li>酸素と上記のようにイソフルランでラットを麻酔。尾静脈にカテーテルを置き、タップを使用して、尾でそれを修正する<html> E。造影剤（; Magnevist、バイエル·シエーリング··、ドイツ約0.5 mlの例えば0.1ミリモル/ kgのGd-DTPA）を含む注射器を接続します。 </li><li>吸入麻酔を維持するためのMRシステムにラットを配置します。骨転移を見つけるために形態のMRシーケンスで始まる（例えば、T2強調：ターボスピンエコーシーケンス、TR 3240ミリ秒、TE 81ミリ秒、マトリクス152×256、FOV 90×53.4ミリメートル2、スライス厚1.5ミリメートル、3平均、スキャン時間3時40分）。 </li><li>最大径が骨転移のスライスを決定し、DCE-MRIのシーケンスを開始します（例えば飽和回復ターボフラッシュシーケンス、TR 373ミリ秒、TE 1.86ミリ、マトリクス192×144、FOV 130×97.5ミリメートル2、スライス厚5 mmの測定値512、平均1、スキャン時間の午前6時55分の分）。約30秒後、10秒の期間に造影剤を注入し始める。 MRI検査を実行するために、上記の手順については、合計時間は動物当たりおよそ15-20分である。 </li></ol>タイトル &quot;&gt; 4。体積コンピューター断層撮影​​（VCT） <ol><li>ヒトまたは実験的なスキャナのいずれか、適切なCTシステムを選択します。ここでは、体積計算断層撮影（;ボリュームCT、シーメンス、ドイツ図2B）を装備し、フラットパネルのプロトタイプを使用していました。 </li><li>酸素と上記のようにイソフルランでラットを麻酔。尾静脈にカテーテルを配置し、テープを使用して尾でそれを修正してください。造影剤（; Imeron 400、ブラッコ、ドイツ約0.5 mlのkg当たり例えば、1 gのヨウ素）を含む注射器を接続します。 </li><li>吸入麻酔下でスキャナにラットを配置します。 VCTには、次のスキャンパラメータを使用します。管電圧80 kVの、管電流50mA、スキャン時間51秒、回転数10秒、第120あたりのフレーム数、マトリックス512×512、スライス厚さ0.2ミリメートル。フラットパネルシステムの第二の回転中に造影剤を注入します。 VCT検査を実行するために、上記の手順については、合計時間は、アニム当たり約5-10分です。アル。 </li><li>変更されたFDK（フェルトカムプデービス-クレス）コーンビーム再構成アルゴリズム（カーネルH80a、アフラ、ドイツ）を使用して画像を再構築します。 </li></ol> 5。超音波（米国） <ol><li>実験的および臨床米国のシステムはこの目的のために用意されています。我々は、15L8線形トランスデューサー（;シーメンスACUSON、カリフォルニア州マウンテンビュー図2C）と臨床システムACUSONセコイア512超音波システムを使用していました。 </li><li>酸素と上記のようにイソフルランでラットを麻酔。尾静脈にカテーテルを配置し、テープを使用して尾でそれを修正してください。マイクロバブル造影剤（; SonoVue、ブラッコ、イタリアなど約0.5 mlの1.6ミリリットル/ kg）を含んだ注射器を接続します。三脚を使用して、それぞれの後肢に、米国のトランスデューサーを修正し、トランスデューサーと後肢の間に米国のゲルを適用します。 </li><li>骨転移の最大直径を決定し、tのトランスデューサーを修正する;：Bモードイメージング（0.51メカニカルインデックス17 MHzの伝送周波数）を実行する彼の位置。組織灌流の詳細については、Bモード画像上にドップラー信号を追加します。皮質骨を混乱させるだけの病変は、米国の波にアクセス可能であることを心に留めておいて下さい。 </li><li>ダイナミック造影米国（DCE-US）がケイデンスコントラストパルスシーケンス（CPS）モード（7 MHzで、機械的なインデックス：送信周波数0.18）で、米国のデバイスを設定するために、マイクロバブルを注入し、90秒の長さのシネループを記録します。米国の検査を実行するために、上記の手順については、合計時間は、動物ごとに約10-15分です。 </li></ol> 6。イメージングデータの後処理<ol><li>軟部腫瘍（MRI、米国）、骨転移の骨破壊（VCT）を特徴づけるとDICOMビューア（例えば、OsiriXのDICOMで病変の位置、病変サイズとボリュームを決定するためにMRI、VCTと米国からの形態情報を使用ビューア）。 </li><li>骨転移（血管造影）で血管の分岐パターンを取得するには、VCTデータを使用することができます。投稿引き算のテクニック（例えば、OsiriXは、DICOMビューア）の有無にかかわらず動脈相の情報を使用して、2Dまたは3D画像を構築します。 </li><li> DCE-MRI、DCE-VCTとDCE-USから血管のパラメータを定量化するためには、モダリティのために特定のソフトウェアツールを使用します。 DCE-MRIについては、ダイナラボと骨転移で（血液量に関連付けられている）と交換速度定数k EP（血流と血管の透過性に関連付けられている）（Mevis研究、ブレーメン、ドイツ）に基づいて血管のパラメータの振幅を決定する2つの-糖度8,9のコンパートメントモデル。評価のための代替薬物動態モデルが入手可能であり、Toftsモデル10を 、例えば。 </li><li> DCE-VCTデータを定量化するために、曲線（AUC）またはダイナラボ（Mevis研究、ブレーメン、ドイツ）とのピークの強化（PE）の下でそのような領域などのパラメータを計算するデータの記述分析を実行します。 </li><li>定量分析ソフトウェアを使用してリアルタイムDCE-USからの情報を定量化する（例えばQontras実装ボーラス注射モデルに従ってシネ·ループを分析することによって、T、ブラッコ、イタリア）。骨転移を介して関心領域（ROI）を配置し、色分けされたマップは、例えば地域の血液量、局所血流と充填時からカーブや定量的なパラメータの下でそのような領域として説明する要因のいずれかを決定します。 </li></ol> 7。代表的な結果 SEAへのMDA-MB-231細胞（ 図1）の動脈内注入後、サイト固有の骨転移では、ヌードラットのそれぞれの後肢に開発しています。大腿骨に限局して溶骨性病変は、脛骨と腓骨は約25-30日ポスト噴射を開始MRI、VCT、米国（ 図2）非侵襲的イメージングと数週間のために、フォローアップすることができます。ネイティブおよび造影技法を含む、MRI、VCTと米国を組み合わせる場合は、補完的な情報は、軟組織から構成されている骨転移で評価することができる腫瘍（腫瘍細胞と間質）とそれぞれの溶骨性病変（骨破壊）。技術の間にそれぞれのデータの比較については、3つのすべての画像診断法は、同じラットに連続して使用することができます。 MRIは当初骨髄空洞に閉じ込められ、その後、開発の過程で皮質骨を超えている骨転移の軟組織の形態を表示します。そのような地域の血液量、血流と血管透過性などの機能のパラメータは、（ 図3）DCE-MRIおよび定量から得ることができます。骨の構造、転移の特定の溶骨性変化は、VCTにより、高分解能で評価されています。 MRI所見と相補的な、溶骨性病変は腫瘍の成長を髄内に隣接して配置されています。 VCT血管造影検査では骨転移の変更されたmacrovesselアーキテクチャを明らかにし、DCE-VCTは、微小循環のそれぞれの側面（ 図4）が表示されます 。 metastatiの皮質骨の局所的破壊に起因するcの病変は、米国がB-モードおよびドップラー技術の使用により軟部腫瘍の形態学的および機能的特徴を評価するために適用されます。マイクロバブルのアプリケーションによって、DCE-USは、骨転移における血管新生のリアルタイムイメージング（ 図5）が可能になります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4178/4178fig1.jpg" /> 図1：手術用顕微鏡を介して撮像し、腫瘍細胞接種のために準備ヌードラットの後肢。浅腹壁動脈（SEA）、下降膝動脈（DGA）、膝動脈（PA）と伏在動脈（SA）を含む大腿動脈の、分岐パターン（FA）。動脈クリップSA、PAと近FAなどSEAのライゲーションに置かれ、B、SEAは、ライゲーションの近位カットされた、C、パパベリンの添加後にSEAの筋弛緩、D、に取り込まれたSEAの切開（鉗子）、E、SEAに針を挿入し、SEAのF、執着針（外部FI<html>クリップのおかげで、DGAとPAにSEAを介してデバイス）とMDA-MB-231腫瘍細胞の注入をxating。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4178/4178fig2.jpg" /> 図2は 、人間のMRシステム（シンフォニー、シーメンス、ドイツ）、スキャナに置か高周波励起および検出のための自作コイル; B、体積計算断層撮影装置（ボリュームCT、シーメンス、ドイツ）を装備し、フラットパネル、C、臨床超音波システムACUSON Sequioa 512（シーメンスACUSON、マウンテンビュー、CA）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4178/4178fig3.jpg" /> 図3軸MRのセクションを参照してください。左側のパネルで、T2w MRI、中央のパネルは、振幅A（DCE-MRI）、右側のパネルには、為替レートの定数k EP（DCE-MRI）。矢印は、骨転移を指す。赤（高い値）から青（低い値）にDCE-MRIデータ範囲のカラーマップ。 78/4178fig4.jpg &quot;/&gt; 図4。溶骨性骨転移（左パネル）と血管造影（中央パネル）などのパラメータのピーク強化（右パネル）から軸方向にDCE-VCTセクションの3D VCTの再建。赤（高い値）から青（低い値）にDCE-VCTデータ範囲のカラーマップ。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4178/4178fig5.jpg" /> 骨転移のB-モード（形態、左パネル）、ドップラー（血流、中央のパネル）とCEUS（右側のパネルに、血管新生のリアルタイムイメージングからマイクロバブルの注入後にピークエンハンスメント）から図5米国の画像。 補足の映画は、1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4178/4178movie1.mov" target="_blank">補足ムービーを見るにはここをクリックして</a> 。

<ol><li>Bäuerle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+rat+model+with+site-specific+bone+metastasis+induced+by+MDA-MB-231+breast+cancer+cells+and+its+application+to+the+effects+of+an+antibody+against+bone+sialoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of a rat model with site-specific bone metastasis induced by MDA-MB-231 breast cancer cells and its application to the effects of an antibody against bone sialoprotein.</a> Int. J. Cancer. 115, 177-186 (2005).</li>
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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

撮像法との組み合わせでここで紹介する実験的な骨転移を誘導する方法は、長手方向にヌードラットでは溶骨性病変をフォローアップすることができます。私たちのモデルでは、MDA-MB-231ヒト乳癌細胞は、pudendoepigastricトランクと大腿動脈を経由して腸骨動脈との間の吻合であるSEAに注入される。その結果、膝関節の供給領域に血流は海のライゲーション後も維持されています。に比べて骨転移の確立されたモデルと比較して、このモデルの利点は、心臓内注射モデル11と標的組織への腫瘍細胞の血管外遊出と遊走の病原性のプロセスを含めると比較して骨転移のサイト固有の外観です。脛骨インジェクションモデル12。さらに、特定の内臓の普及で、全身の腫瘍の負担は、このモデルでは、SE以上の縦断的研究を可能にしている省略されているveral週間、したがって、必要な動物1,13の削減を可能にします。 骨転移の病態に腫瘍細胞の増殖を促進し、骨吸収を誘導するために不可欠なプロセスとして血管新生の役割は、以前にex vivoでの研究...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> MDA-MB-231ヒト乳癌細胞</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC） </td><td> HTB-26 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td>インビトロジェン</td><td> 61870 </td></tr><tr><td> FCS </td><td>インビトロジェン</td><td> 10270 </td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> 25300 </td></tr><tr><td>カルプロフェンRimadyl </td><td>ファイザー</td><td> PZN 110208 </td></tr><tr><td> Magnevist </td><td>バイエル·シエーリング</td><td> PZN 6961516 </td></tr><tr><td> Imeron 400 MCT </td><td>ブラッコ</td><td> PZN 228654 </td></tr><tr><td> SonoVue </td><td>ブラッコ</td><td> PZN 1567358 </td></tr><tr><td> Papaverin </td><td>アルファAesar社</td><td> L 04152 </td></tr><tr><td> Isofluran </td><td>バクスター</td><td> HDG 9623 </td></tr><tr><td>シンフォニー（磁気共鳴イメージング） </td><td>ジーメンス</td><td></td></tr><tr><td>ボリュームCT（コンピュータ断層撮影容積） </td><td>ジーメンス</td><td></td></tr><tr><td> ACUSON Sequioa 512（超音波） </td><td>シーメンスACUSON </td><td></td></tr></tbody></table>

磁気共鳴イメージング、体積ct画像と超音波を用いた乳がんの骨転移のヌードラットモデルにおける血管新生のマルチモーダルイメージング

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

血管新生は癌の増殖と転移形成に不可欠な機能です。骨転移では、血管新生因子は、腫瘍細胞の骨髄腔の増殖だけでなく、地元の骨破壊をもたらす腫瘍や骨細胞の相互作用のために重要である。私たちの目的は、非侵襲的イメージング技術を用いた骨格病変における血管新生の in vivo評価にできます。実験的骨転移のモデルを開発することでした。 この目的のために、我々はそれぞれの後肢1以外の体の部分に転移の成長を妨げ浅腹壁動脈、中に10 5 MDA-MB-231ヒト乳癌細胞を注入した。腫瘍細胞接種後25-30日後に、サイト固有の骨転移は、遠位大腿骨、脛骨近位端および近位腓骨を1に制限され、開発しています。血管新生の形態学的および機能的な側面は、骨メタで長手方向に調べることができます磁気共鳴イメージング（MRI）、体積CT検査（VCT）と超音波（米国）を使用してstasisの複数形。 MRIは、最初に骨髄腔に限局して進行していく中で続いて皮質骨を超えている骨転移の軟組織の一部に形態学的情報が表示されます。使用してダイナミック造影MRI（DCE-MRI）機能地域の血液量などのデータ、血流と血管の透過性が得られ、2-4を定量することができる。骨破壊は、形態学的VCTイメージングを使用して高解像度でキャプチャされます。 MRI所見と相補的な、溶骨性病変は髄内腫瘍の増殖部位に隣接して配置することができます。造影剤を塗布した後、VCT血管造影では、高解像度の骨転移でmacrovesselアーキテクチャを明らかにし、DCE-VCTは、これらの病変5,6の微小循環に洞察することができます。米国による骨病変から形態学的および機能的特徴を評価するために適用されます皮質骨の局所骨溶解。 B-モードおよびドップラー技術を用いて、軟部組織の転移の構造と血流は、それぞれ評価することができます。 DCE-USは、バブル7の注入後の骨転移における血管新生のリアルタイムイメージングを可能にします。 結論としては、サイト固有の乳癌の骨のモデルではMRI、VCTと米国を含むマルチモーダルイメージング技術を転移形態とこれらの骨病変における血管新生の機能的なパラメータの補完的な情報を提供します。

骨転移の病態に、血管新生は重要なプロセスであるため、イメージングおよび治療の標的を表しています。ここでは、サイト固有の乳癌骨転移のラットモデルを提示し、非侵襲的に画像の血管新生への戦略を説明<emin vivoでの&gt;</em&gt;磁気共鳴イメージング、体積CT検査と超音波を用いた。

磁気共鳴イメージング、体積CT画像と超音波を用いた乳がんの骨転移のヌードラットモデルにおける血管新生のマルチモーダルイメージング

血管新生は、がんの増殖および転移形成において不可欠な特徴である。骨転移において、血管新生因子は腫瘍細胞の...

この実験では、補完的なイメージング技術を用いて、ラット乳がんモデルにおける血管新生を非侵襲的に評価します。骨転移を誘導するため、まずヌードラットの下腹壁動脈にヒト乳がん細胞を注入し、後肢に部位特異的な溶骨性骨転移を誘発させます。25〜30日後、動物をイメージング解析に備えさせ、磁気共鳴画像法（MRI）、コンピュータ断層撮影（CT）、および超音波スキャンによってデータを取得します。次に、これらのイメージングモダリティから得られた相補的な形態学的および機能的データを用いて、骨溶性病変における血管新生のさまざまな側面を記述します。得られる結果には、大血管の構造、局所血流量、灌流、透過性に加え、骨転移における血管新生のリアルタイムイメージングが含まれます。これらの手法は、骨転移の病態形成における血管新生の役割に関する重要な疑問への回答に寄与し、悪性骨病変のイメージングおよび治療に影響を与えます。ここで述べる動物モデルでは、腫瘍の定着率が90%を超えるため、N-D-A-M-B 2 3 1 骨特異的サブ細胞株を使用する必要はありません。まず、10%胎児牛血清を添加したRPMI 1640培地で、ヒト乳がん細胞を対数増殖期まで培養します。トリプシンを用いてサブコンフルエントな腫瘍細胞を回収した後、ノイバウエル計数器を用いて細胞数を算出し、RPMI 1640に懸濁させます。すべての実験は、担当の政府動物倫理委員会の承認を得て実施されました。外科的手順に付随するテキストに従い、6〜8週齢のラットを麻酔します。倍率16倍の適切な双眼手術用顕微鏡を使用します。まず、鼠径部において皮膚および皮下組織を2〜3 cmの長さで切開します。次に、大腿動脈から分岐するすべての動脈を剥離し、S CAの起始部より近位の大腿動脈、およびDGA、PA、S SAにクリップを留置して、局所の血流を一時的に遮断します。次に、出血せずに血管を開通させられるよう、SEAの遠位部を結紮します。結紮部の近位側でSEAを切断し、1%pipen溶液をSEAに投与します。続いて、ハサミでSEAの直径の約半分を切断し、血管の切断端をピンセットで保持しながら、ルーメンに針を挿入します。可能であれば、血管壁の穿孔につながる不規則な動きを抑えるため、外部固定具で針を固定してください。その後、針にシリンジを接続します。遠位大腿動脈からクリップを取り外し、大伏在静脈に装着してください。MDA MD 2 31 乳がん細胞 0.2 milliliters を浅腹壁動脈にゆっくりと注入します。クリップによって、細胞が DGA および pa に誘導されることに留意してください。動脈クリップを取り外す前に、出血を防ぐため、針を抜き、浅腹壁動脈を結紮します。創傷を閉鎖し、吸入麻酔を終了させた後、動物内で25〜30日間腫瘍を成長させます。専用の実

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