Name: 実験室規模の合成クモの糸生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: 学ぶ 合成クモの糸の実験室生産法。バクテリアで組換えシルクタンパク質を大量生産し、クロマトグラフィー精製と凍結乾燥後、シリンジ紡糸と引き伸ばし処理で繊維化します。低コストでスケールアップ可能なバイオマテリアル製造技術です。

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この作品は、それぞれ &quot;ブラックウィドウスパイダーシルクとスパイダー接着剤シルクの力学的挙動の分子特性&quot;と題されたNSF RUI助成MCB-0950372およびDMR-1105310によってサポートされていました。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

この方法論をつむいだ糸合成繊維は天然繊維に比べて機械的に同じ大きさのオーダーである。スプーリングとポストスピンドロープロセスを機械化によるヒューマンエラーの量を減少させることによって、サンプル間の実験的な変動は、より制御されており、大幅に減少しました。 私たちの方法論は、クモの遺伝子ファミリーの他のメンバーのcDNAからエンコードされた組換えタンパク質から紡糸された他の繊維の機械的性質を調査する可能性を提供しています。潜在的に、それはフィブロイン内、または異なるフィブロインタイプ間の異なったタンパク質モジュールの機械的な役割を決定することができる23以上の絹タンパク質または他の分子を結合または追加することができますようにまた、複合材料としてのシルク繊維のテストが可能とタンパク質の混合物として分社。 この紡績方法論は、APPAのように、簡単に上に展開する他の研究室のためのプラットフォームです。ratusesは、安易な方法で構築することができます。これはまた、ユニークな機械的性質を持つ特定の繊維の設計を最適化...

クモの糸が出高張力鋼、ケブラーとナイロンを含むいくつかの人工材料を、実行する特別な機械的特性を持っています。1スパイダーは、多様な機械的特性を表示し、少なくとも6月7日の異なる繊維の種類、引張強さと拡張性の様々な量で設計をそれぞれスピン特定の生物学的なタスクを実行することができます。2研究の科学者が急速にために共食いの3,4。ので、その優れた機械的性質、それらの生体適合性、およびそれらの非毒性と緑の材料の性質の次世代バイオマテリアルとしてのクモの糸を使用して追求され、農業を通してクモの糸を収穫クモの毒の性質は、工業規模の製造のために必要な需要を満たすための実践的な戦略ではありません。したがって、科学者たちは、から合成繊維の紡糸をin vitroで組み合わせるトランスジェニック生物における組換え絹タンパク質の生産になっているSE精製したタンパク質。フルレングスの組換えクモの糸タンパク質の5-8表現が彼らの非常に反復的な性質と物理的な長さ（&gt; 15キロバイト）、GC-リッチコンテンツとバイアスを含むそれらの遺伝子配列の固有の性質与えられた技術的に困難であったアラニンとグリシンのコドン使用。現在までに9-11、ほとんどのラボは、部分的なcDNA配列または合成遺伝子を用いて主要なampullate糸タンパク質MaSp1またはMaSp2の切り捨てられた形を表現に焦点を当てている。12月15日スピニング合成クモの絹が必要とする困難なプロセスです。いくつかの科学分野、および紡糸プロセスの複雑さの習得と知識が完全に映像表現で一般大衆に明らかにされていない。実際には、世界中のラボのほんの一握りでは、クモの糸のcDNAを発現する絹タンパク質を精製、合成繊維を回転させ、ポストスピンドローを実行するための専門知識を持っているし、最後にそれらの生体材料の特性をテストします。 図8に示すように、紡績の合成繊維の16,17異なるアプローチは、湿式と乾式紡糸などエレクトロの方法を包含している16,18,19すべての手順は、一般的な1つの目標がある-機械的性質と合成クモの糸を生成するプロトコルの開発をそのライバル、自然のスレッド大規模な商業的な製造プロセスのために。 ここでは、湿式紡糸方法を用いて実験室規模で人工的なクモの糸を生成する手順を説明します。他の紡績方法と比較して、湿式紡糸は、繊維分析のための最も一貫した結果を生み出しています。私たちは彼らの精製に続いて​​細菌における組換え絹タンパク質の発現と、この手順の開始を概説し、その後でスレッドを生成する &quot;などの紡糸&quot;繊維に適用後のスピンドローの方法論を含めて、紡績のためのタンパク質の準備手順について説明します。天然のクモの糸の品質に近づく材料特性。私たちのmethodologyは密接に絹繊維の自然な紡糸プロセスを模倣し、それがオーブとCOB-織りスパイダーから絹生産腺のアーキテクチャおよび機能の専門知識に大きく描画するよう設計されています20から22はまた、我々が必要と結論研究者は究極の強さ、究極​​の歪み、繊維の靭性を計算できるように応力 - ひずみ曲線をプロットする張力計を用いた合成繊維の材料特性を決定するための手順を実行します。最後に、しかし重要な価値が、紡績スプール、および描画装置は、かなり手の込んだ、高価なカスタマイズされた機器を購入するより、市販の部品を使用して、自宅に構築することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/機器 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>のpBAD / TOPO ThioFusion発現キット</td><td>インビトロジェン</td><td> K370-01 </td><td></td></tr><tr><td> 10倍FastBreakのCell Lysis試薬、 </td><td>プロメガ</td><td> V857C </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTAアガロース</td><td>キアゲン</td><td> 30210 </td><td>バッファの手順が含まれています</td></tr><tr><td> ProteoSilverシルバーステインキット</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> PROTSIL1-1KT </td><td></td></tr><tr><td>フリーゾーン凍結乾燥機</td><td> Labconco </td><td> 7960041 </td><td>フリーゾーン12Plus </td></tr><tr><td>ヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 52512 </td><td></td></tr><tr><td>注射器</TD&gt; <td>ハミルトン</td><td> 7657から01 </td><td> 250μL </td></tr><tr><td>針</td><td>ハミルトン</td><td> 7780から01 </td><td> 26Sゲージ、ブラントエンドニードル</td></tr><tr><td>注射器ポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td> 702208 </td><td> 11Plus </td></tr><tr><td>デジタルノギス</td><td>カレラ</td><td> CP5906 </td><td> 0〜150ミリメートルの範囲</td></tr><tr><td>ステンレス製の鉗子</td><td>世界の精密機器</td><td> 501764 </td><td>ミニデュモン＃M5S </td></tr><tr><td>モーター</td><td>自然ミル</td><td> 7090529 </td><td> 12VDC、2つの回転速度</td></tr><tr><td>リニアアクチュエータ</td><td>ワーナー電気</td><td> 01-D024-0050-A06-LP-IP65 </td><td> 24VDC、6インチの範囲</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>ライカMZ16 </td><td></td></tr><tr><td>デジタルmicroscOPE、光エレクトロニクスカメラ</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> DFC320 </td><td>ソフトウェア：ライカアプリケーションスイートv2.8.1 </td></tr><tr><td> Vannasはさみ</td><td>世界の精密機器</td><td> 500260 </td><td></td></tr><tr><td> Microtensometer </td><td>オーロラの科学</td><td> 310C </td><td> 5Nデュアルモードシステム</td></tr></tbody></table>

実験室規模の合成クモの糸生産

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

社会が進行するとリソースがscarcerになるにつれ、それは、高性能特性を持つエンジニアの次世代バイオマテリアル、新しい技術を開拓するためにますます重要になっています。これらの新しい構造材料の開発は、コスト効率の高い、迅速で、処理の方法論と環境に優しい持続可能な製品を含んでいる必要があります。スパイダーはライバル最高の人工と天然素材というバイオミミクリーのために次世代のエンジニアリング材料の豊富なソースを提供し、多様な機械的性質の異なる繊維の種類の多数のスピン。天然のクモの糸の大量のコレクションが現実的ではありませんので、合成絹の生産は、スレッドの無制限の供給へのアクセス権を持つ科学者を提供する能力を持っています。紡糸工程の合理化と完成することができますそのため、人工のクモの繊維がボディアーマーに至るまで幅広いアプリケーションに、縫合糸のための潜在的な用途を持っているS、綱及びケーブル、タイヤ、楽器用文字列、および航空宇宙技術の複合体。合成絹の生産工程を進めるために、スピン、スピンからその材料の特性で、低分散を表示する繊維を得るために、我々は、細菌、精製やタンパク質の濃度の組換えクモの糸タンパク質の発現を統合し、湿式紡糸プロトコルを開発しました、繊維の押出及び機械的なポスト·スピン治療が続く。これは、実験室規模での人工絹の繊維をスピンし、分析するステップ·バイ·ステップのプロセスを明らかにする最初の視覚的に表現したものです。また、同じ紡糸をつむいだ糸繊維間のばらつきの発生を最小限に抑えるため、詳細情報を提供します。総称して、これらの方法は、天然のクモの糸を凌駕する高品質の繊維につながって、人工絹の生産のプロセスを推進します。

クモの糸の傑出した機械的および生化学的特性にもかかわらず、この材料は、従来の手段によって大量にで収穫されたすることはできません。ここで我々は次世代の生体材料としてクモの糸生産とその使用方法を勉強し調査官するための重要なプロセスである人工的なクモの糸繊維をスピンするための効率的なの戦略を、について説明します。

社会が発展し資源が乏しくなるにつれ、次世代の……を構築する新しい技術を育成することがますます重要になっています。

本手順の全体的な目的は、天然のクモ糸紡糸プロセスを模倣することで、ラボ内で絹を紡ぐプロセスを再現し、合成クモ糸を作製することです。クロマトグラフィーによる精製と凍結乾燥による濃縮を経て、バクテリア内で大量のリコンビナント絹タンパク質を産生します。このタンパク質を可溶化し、紡糸ドープを細径針の付いたシリンジで脱水アルコール浴中に押し出します。最後に、合成された紡糸後の繊維に後延伸を施し、タンパク質鎖の分子配向性を向上させます。エレクトロスピン法や乾式紡糸法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、コストが低く、操作が容易であること、そして大規模生産形式へ展開できる可能性があることです。この技術がもたらす影響は、新しいクラスのバイオマテリアルの開発へと広がります。これらの材料は、縫合糸やボディアーマー、楽器の弦など、幅広い用途に利用可能です。この手法はクモ糸の材料特性に関する知見を提供できるだけでなく、組換えタンパク質から紡がれた他の種類のバイオポリマーの研究にも適用できます。一般的に、この技術に不慣れな方は、バイオエンジニアリング、生物物理学、細胞生物学、分子生物学、および生化学など、多くの分野にわたる専門知識が必要となるため、習得に苦労する可能性があります。この手法の着想は、合成繊維を製造するためにクモが行う天然の紡糸プロセスを模倣する必要があった際に得られました。クモ糸生産に使用するプラスミドを作成するために、目的のクモ糸CDNAを特異的なプライマーセットを用いて増幅し、pBBA topo thio fusionなどの原核生物用発現ベクターにライゲーションします。このベクターには、糸状タンパク質の可溶化を促進するためのN末端チオレドキシンタグと、タンパク質精製のためのC末端6x hisタグが含まれています。ライゲーション後、ライゲーション産物をコンピテントな E. coli 細胞に形質転換し、プラスミド含有コロニーを培養します。次に、aoseを添加してクモ糸タンパク質の発現を誘導し、細胞をペレット化して、細菌細胞を溶解させるまで-80 °Cで保存します。20 mLの1x lysis bufferを細胞ペレットに加えて再懸濁し、細胞を完全に分散させ、さらなる細胞溶解を促進します。次に、染色体DNAを消化するためにリゾライムを1 mg/mLの濃度で添加し、これにより溶液の粘性を低下させます。100 µgのDNAを使用します。次に、サンプルをオービタルシェーカーに載せ、室温で20分間緩やかに揺らす。溶液を設定19で1分間超音波処理して清澄化し、4°Cで16,000 Gsにて10分間遠心分離する。遠心後、上清の粘性がなく透明であることを確認する。もし溶液に粘性があり濁っている場合は、さらにDNAを加えて超音波処理を行い、再度上清を回収する。上清が透明になったら、それをニッケルNTAアフィニティークロマトグラフィー用の清潔な25 milliliter BioRad poly prepカラムに回収します。融合タンパク質を精製するために、0.5 milliliterのビーズを含む1 milliliterのニッケルNTAスラリーをカラムに加え、キャップとストップコックをしっかりと締め、ロッカーに1時間置いて平衡化させ、6 X hisタグをニッケルNTAビーズに結合させます。カラムをスタンドに直立させ、ニッケルNTAビーズを約2分間沈降させます。ビーズが完全に沈降すると、底部に淡い青色の層が見えます。キャップを取り外し、ストップコックから溶液を流します。溶液を15 milliliterのコニカルチューブに回収してください。さらなる解析のため、1x洗浄バッファーを20 milliliters加え、ビートを沈殿させます。ストップコックを開き、流出液を5 milliliterずつ4つの分注管に回収します。解析のため、これらの分注液を、短期間の場合は4 °Cで、長期間保存の場合は-80 °Cで保存してください。不純物タンパク質を減少させるために洗浄液の量を増やすことができますが、これによりタンパク質の総収量が低下する可能性があることに注意してください。次に、1x溶出バッファーを20 mL加え、レジンを沈降させた後、ストップコックを開いて溶液を流します。この溶液（計20 mL）を、後の解析のために5 mLずつ4つの分注管に回収します。短期間の保存には4 °Cで、長期間の保存には-80 °Cで保存してください。必要に応じて、ニッケルNTAレジンからさらに溶出液を回収できることに注意してください。次に、分子量に基づいてタンパク質を分離します。SDS-PAGE分析を用い、銀染色またはクマシーブリリアントブルーR-250でタンパク質を可視化します。以降のステップには、純度の高い画分のみを使用してください。ウェスタンブロット分析により精製タンパク質の同一性を確認します。塩類を除去してタンパク質を濃縮するため、付属文書の指示に従って透析を行い、サンプルを凍結乾燥させ、凍結乾燥サンプルを-80°Cで保存します。次のステップの目的は、安全フード内で作業し、紡糸プロセス用のドープとシリンジを準備することです。乾燥タンパク質粉末が入った各チューブに、適量のヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）を慎重に添加し、200 mg/mLから500 mg/mL、または20%から50% w/vの濃度にします。HFIPの添加後、速やかにチューブに蓋をし、パラフィルムで封止してロッカーに設置し、タンパク質を可溶化させます。可溶化を促進するためにボルテックスミキサーを用いてください。この工程には最大で2日かかる場合があります。可溶化した後、サンプルを16,000 Gsで2〜3分間遠心分離します。タンパク質が溶液中に溶け込んだ状態のものを紡糸ドープと呼びます。この溶液は非常に高い粘性を持ちます。シリンジが詰まる可能性があるため、凝集体が存在しないことを確認してください。次のステップでは、内径127 micronの針を備えたHamilton Gastタイトシリンジに、紡糸ドープを少なくとも25 µL慎重に充填します。この際、プランジャーを押すために、針を上に向けてシリンジを持ってください。気泡が残っていると繊維に不均一性が生じるため、気泡を完全に取り除くことが非常に重要です。次に、シリンジをHarvard Apparatus社製の11 Plusシリンジポンプに固定します。95%イソプロパノールを満たした400 mLビーカーを移動式スタンドに配置し、シリンジの先端がアルコールの表面にちょうど浸かるように調整します。シリンジポンプを15 µL/minに設定し、スタートボタンを押します。ファイバーの押し出しを行います。紡糸ドープの初期量に応じて、約1～2分かかります。すべての溶液がファイバーに紡がれた後、完全に平衡状態にするため、ファイバーをイソプロパノールに20分間浸したままにします。次に、スプーリングデバイスを用いてサンプルを回収します。ここで使用したスプーリングデバイスは、デジタルノギスに金属製のコームを接着して作成したものです。この画像に示すように、スプーリングデバイスのコームの両面に両面テープを貼ります。次に、巻き取り装置をモーターに取り付けます。モーターを2 RPMに設定して、繊維を巻き取ります。続いて、ピンセットを用いて繊維の端をそっと掴み、イソプロパノールからゆっくりと引き出します。それをスプールのコムアームの一方の端に取り付けます。両面テープを使用します。繊維の乾燥を防ぐため、次の数ステップは停止せずに連続して行ってください。モーターを起動し、ガラス棒を用いて、繊維を慎重にスプーリングデバイスへと導きます。ファイバーが二重に重なったり積み重なったりしないようにしてください。両面テープを使用することで、ファイバー全体の滑りを防ぎ、キャリパーアーム内のファイバー内側のセグメントを選択的に伸長させることができます。ファイバー全体を巻き終えたら、スプールをモーターから取り外し、両面テープ上の各シルクファイバーの端に接着剤を塗布します。これにより、クモの糸が装置に固定されます。次に、スプールをリニアアクチュエータに取り付け、ポストスピンドロー（後延伸）を行います。Cを用いてファイバーの初期長を測定します。これはファイバーの内部の長さであり、スプールに接着および巻き付けられた部分の長さは含みません。スプールを75%イソプロパノール浴に浸します。繊維を10分間静置し、平衡状態にします。リニアアクチュエータの速度を1.5 millimeters per secondに設定します。初期長に基づき、目的とする後延伸比（post bin draw ratio）となる最終長を算出します。伸展量は、セットアップに応じて速度または長さに基づいて制御できます。例えば、初期長が15 millimetersで、目的とするビン後の伸展比が3倍の場合、最終長は45 millimetersになります。これは、リニアアクチュエータを1.5 millimeters per secondの速度で20秒間動作させることでも算出可能です。次に、ポストビンドローが完了したら、スプールをイソプロパノールからゆっくりと引き上げます。サンプルを回収するため、イソプロパノールの液滴を1分間蒸発させます。まず、片端をピンセットで保持しながら、ファイバーのもう一方の端を切断します。その端をカットし、試験用に光ファイバをカードストックまたはフォイルフレームに固定します。さらに後段の描画比率（draw ratio）が必要な場合は、スプールを再び75%isopropanolバスの中に下げます。ファイバを10分間平衡化させ、その後、次のポストビンへ進みます。延伸比。繊維に影響を及ぼす可能性があるため、湿度と温度を記録します。機械的特性。採取したサンプルを標準的なラボ環境に馴化させます。機械的試験を行う前に、少なくとも1時間、湿度40%、25 °Cの条件下に置くことが理想的です。カードストックフレームに繊維を取り付け、カードストックまたはフォイルの端に瞬間接着剤を塗布して、フレーム上の繊維を固定します。フレームの開口部のサイズを確認してください。これが試験対象となる繊維の初期長さになります。ここでは1インチの開口フレームを示しています。100倍以上の倍率の光学顕微鏡を用いて、繊維の長手方向の軸に沿って直径を測定してください。少なくとも3回の測定値を記録してください。倍率を高くし、測定回数を増やすほど、精度が向上します。カードストックフレームをテンター機械負荷フレームに固定してください。次に、張力が繊維のみにかかるように、フレームの両側をカットします。テンターを破断させ、データを収集します。標準的なひずみ速度として、1秒間に2%を推奨します。機械的データの収集手順は、研究に使用されるテンターのブランドによって異なる場合があります。平均直径として収集されたデータを用いて、Microsoft Excelで応力-ひずみ曲線を作成できます。破断した繊維は、形態学的分析および破断点直径の測定のため、走査型電子顕微鏡（SEM）に設置して観察を行います。破断点から離れたファイバーセグメントを用いて、光学顕微鏡で測定した初期直径の推定および確認を行うことができます。クモ糸タンパク質MASP 1を細菌から発現・精製し、ファイバーを紡糸する前にタンパク質の純度を決定するため、タンパク質のサイズ分画を行いました。ここに示すように、SDS-PAGE解析およびそれに続く銀染色による可視化により、6つの溶液のうち、サンプルの大部分が最初の4つの分画に放出されていることがわかります。クモ糸タンパク質TUSP1を本プロトコルに従って調製し、合成管状形態の機械的特性を決定するために繊維へと紡糸しました。繊維を紡糸し、後延伸比を段階的に高めて操作を行いました。この画像の色は、2.5倍から6倍までの異なる後延伸比を適用した繊維を示しています。各比率のグループ内では、繊維のばらつきは小さいことがわかります。ポストマン延伸比が増加するにつれて、繊維の強度は向上し、一方で伸展性は低下します。しかし、繊維のタフネスは同等のレベルを示しました。繊維の超微細構造を評価するため、組換えtsp1タンパク質から紡糸した繊維の走査電子顕微鏡像を取得し、ここに示します。500倍の倍率および5,000倍の倍率で、滑らかな外表面が確認できます。高密度の内部コアは、繊維の自然な破断箇所から観察できます。これは、押出成形プロセスにおいて、組換えタンパク質が適切に組み立てられ、充填されていることを示唆しています。この手法を習得し、適切に実施すれば、10日間で完了させることが可能です。この手順を行う際は、凍結乾燥ステップの前に精製リコンビナントタンパク質からすべての塩を除去すること、および押し出しプロセス中にニードルが詰まるのを防ぐために適切な紡糸ドープ濃度を使用することが重要です。この手順に従い、mes、P one TUSB one、P ysb oneなどの他のフィブロインを、個別の繊維または複合体として紡糸することで、幅広いバイオマテリアルを製造することができます。この技術の開発により、バイオエンジニアリングおよび材料科学分野の研究者が、軍事、医療、芸術、スポーツ、および自動車産業に影響を及ぼすアプリケーションに向けて合成クモ糸の利用を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、細菌から精製したタンパク質を用いて、合成絹繊維や複合材料を紡糸する方法についてより深く理解できるはずです。AFibを取り扱う際は極めて危険であるため、本手順の実施中は常にドラフトチャンバー内で作業するなど、適切な予防措置を講じることを忘れないでください。

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Research

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実験室規模の合成クモの糸生産

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