Name: のフローサイトメトリーベースの精製 S.セレビ受精卵 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 9 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーを用いたS. cerevisiae受精卵の高純度精製法。GFPとmCherry二重標識により約90%の純度で分離し、酵母の配偶子形成と二倍体化過程の分子メカニズム解明に応用可能です。

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私たちは、イラスト付きのヘルプは以前の入力とイリヤAylyarovためのフローサイトメトリー、博士誕祭JaiswalさんとDrディウーのヘルプは博士R.マイケルSramkoskiに感謝します。 NIHグラントR01GM089872とメトリー＆ケース総合がんセンター（P30 CA43703）のイメージング顕微鏡の中核施設でサポートされている。

1。ハプロイド細胞増殖<ol><li> Sを育てる標準条件下S288C背景（BY4741）からcerevisiae細胞10。 </li><li> 2目立つ蛍光マーカー10のいずれかを表現するために半数を変換します。選択のマーカーは、細胞質に発現可溶性GFP（pEG220、URA3/YIp、BglIIで11で直鎖状）とmCherry（A.ジョンストンからpAJ1661、URA3/CEN、）と融合し、単一のリボソームタンパク質、RPL25です。私たちは、同等の2色の精製プロトコルが半数親細胞によって合成されている他の明るい蛍光タンパク質を利用することができることを期待しています。あるいは、細胞壁は蛍光レクチンで標識することができます。 </li><li>受精卵浄化の前日までに、各細胞タイプ5mlの培養物を接種すると°Cが1.0を超えないA600に到達するために23℃で一晩振とうしながら、それらを栽培しています。 2％グルコース（CSM-グルコース）を含む完全合成培地中のGFP形質転換体（ATY4442）を育てる10ウラシルを欠く合成選択培地中のNd RPL25-mCherry形質転換体（ATY4552）。室温で振盪しながら各細胞型の並列文化を維持している。 </li></ol> 2。十字架を実施<ol><li>新鮮な培地に1.0に各サンプルの光学密度（A600）を調整します。 [1光学密度単位〜3×10 7細胞/ ml] </li><li> 10秒間、1長い渦が続く簡潔に二つの文化、渦3倍、等量を混ぜる。 </li><li> CSM-グルコースプレートを準備します。プレートはルーチン成長に用いたものと同一であると45分注ぎ、寒天10の固化後に乾燥されています。 </li><li> CSM-グルコースプレートの表面の端から1cmの混合物のような多くの20として40 mlの滴を配布します。液滴は、第1の表面に適用されると、経過時間を測定するためにタイマーを起動します。液体が（約30分）吸収された後、プレートをカバーし、カンガルーに邪魔されずにそれらを残すmの温度。 </li></ol> 3。収穫の準備<ol><li> 23で収穫のサンプル1.75から2.5時間後℃で繰り返して氷の上に板を維持し、CSM-グルコース冷150ミリリットルを用いてプレートから個々の乾燥液滴を洗浄することにより。繰り返して回復を最大化するために同じ培地で滴面積を10〜20回を洗う。氷の上で15mlファルコンチューブに集める。 </li><li>氷上フィッシャーFB120ソニケーター（120Watt、120Volt、周波数20kHz）の間に60％の振幅で10倍のサンプルを超音波で分解するプローブ。 </li><li>ほとんどまたは全く凝集物が残っている位相差顕微鏡で確認します。細胞の15から50パーセントは、この時点で受精卵を形成していることが予想される。 </li><li>さらなる予防措置（凝集体が安定するように）として、10分間氷上で邪魔されずに垂直位置にあるセルのチューブのままにしておきます。 </li><li>ボリュームの最上位90％を回復し、ナイロンメッシュ（BDファルコンポリプロピレン管ストレーナーキャップ（参考352235）を用いて）を介してそれをフィルタリングします。典型的な実験で、10 7個の細胞で1プレートから回収した、この時点では、CSM-グルコースの4 mlに希釈した。 </li></ol> 4。フローサイトメトリー<ol><li>ソニーiCyt反射モデルフローサイトメーターを使用して、ソート·細胞、（高度に自動化された並列ソート）100ミクロンの先端を持つHAPS1。 GFPの励起は、488nmで青色アルゴンイオン、250ミリワットのレーザーを使用しています。 mCherry励起については、561 nmで100ミリワットのレーザーを使用しています。我々は他のマシンと経験を持っていないが、我々は正しいレーザーが装備されている場合ベクトン·ディッキンソンFACSAria、ベクトン·ディクソンの流入またはベックマン·コールターMoFlo XDPは大丈夫だろうと期待しています。 </li><li>生細胞にゲートにオーダー内を前方対後方散乱プロット上のパラメータをソートベース。 615の放出プロットを確立+ / - 30 nmのバンドパスフィルタ（mCherry）対525 + / - 25 nmのバンドパスフィルタ（GFP）の4つの象限にイベントを分割する、 &quot;赤+緑&quot;、 &quot;赤+緑+&quot;、 &quot;赤グリーン&quot;と&quot;赤緑+ &quot;（ 図S2）。標準fとして非蛍光細胞を使用または &quot;赤 - 緑 - &quot;象限の決定。 </li><li> 21.5 psiのシース圧、43400滴/秒の滴周波数、20.5 psiのサンプル圧力でソート細胞。 </li><li> 初期の並べ替え（ &quot;リカバリモード&quot;）：CSM-グルコース冷たい250mlのチルドを含むエッペンドルフチューブにサンプルを収集します。冷蔵微量で最高速度（トミーMRX-150、15,000 rpm）で土砂10秒とフロー溶液（フローサイトメトリーシース液（1mMのEDTAを含むPBS）BioSure商品番号1027）を吸引除去する。 CSM-グルコース冷たい500mlに懸濁します。 </li><li> 第二分類（ &quot;純度モード&quot;）： &quot;純度モード&quot;オプションを使用して、最初の並べ替えのためにソートを行う。土砂精製された細胞と500ミリリットル-1.0ミリリットルのCSM-グルコースでペレットを再懸濁します。代謝の回復を可能にするために23℃で24ウェルプレートで15分間振とうする。 </li></ol> 5。 DeltaVision顕微鏡<ol><li>次のようにアガロースパッドを準備します（超純1.5％アガロースの懸濁液を持参次に沸騰し、CSM-グルコースのアガロース、Invitrogen、カタログ＃15510から07）、渦簡潔に、水平標準スライドガラスの表面にアガロース溶液0.3mlのサンプルを適用し、（なしの二つ目のスライドで一度にそれらをカバー）圧力を加える。 </li><li> 10分間冷却した後、優しく滑らかな表面を残すために、アガロース層を乱さないように注意しながら、水平方向にスライドさせて、上部スライドを削除します。 （上部スライドが削除されている場合には、細胞の試料を1から2分以内に適用されるべきである。上部スライドを削除せずに室温で湿潤チャンバー内に保持する場合は、パッドを使用する前日にアップするために保存することができます。） </li><li>底質試料及び預金アガロースパッド上にペレットを1mlのアリコート（表面に触れることなく）。直ちに平方1号カバースリップでサンプルをカバーしています。片刃黒人で過剰アガロースを切り落とす。注射器から分配ワセリンを有する製剤を封印。 </li><li> Deltavision（アプライドPrecisioを使用したイメージ∞/ 0.17/FN26.5）;ビニングなしの100倍油浸対物レンズ（オリンパスUPlanApo 100x/1.40持つn）。 </li><li> softWoRx 5.0.0プログラム（使用してz-スタックデコンボリューション<a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a>侵襲）、処理を。連続したZ-平面は、一般的に0.2から0.4ミクロンの間隔で収集した。 </li></ol> 6。代表的な結果 形質転換されたハプロイド細胞における蛍光強度レベル：半数体における蛍光のレベル図S1に示されている。クロス、落射蛍光検査では、基本的にすべてのGFP形質転換体が緑だったし、すべてmCherry形質転換体は、しばしば暗いが、赤だったということが実証される前に。クロスに使用されるすべての細胞が確かに蛍光灯であることを確実にするために、私達は最も明るい蛍光シグナルと亜集団を使用していました。 収量：FTER初期ソート、赤+緑+サンプル（S2図 ） は、典型的には、8月20日のセルの入力数の％および永続的な細胞間接着などが原因で半数体細胞の過剰な数が含まれています。高濃縮を単一のソートで達成されていないので、部分的に精製されたサンプルは、プローブが再選別で60％の振幅で二回超音波処理しなければなりません。 （1〜2時間の間に、通常、最後の回復にソートし、二つ目はわずか15分を必要とする。）第二ソートを受けた細胞の、赤+緑+のサンプルは、入力セルの百分の23から52までが含まれていた。 位相顕微鏡検査：位相差顕微鏡による検査は、最終的な受精卵の調製物の純度は21製剤（86パーセントから91パーセントまでの範囲）で約90％を平均したことを示した。汚染物質が互いに接触していた半数体の緑色または赤色の半数、またはペアのどちらかであった。 図3は持っている受精卵の割合を集計ノー芽、内側蕾（MED）、側芽（LAT）や頂芽（任期）、同じ色のペアの半数体の数（ &quot;2Same&quot;）、または別の色（ &quot;2Hap&quot;）だけでなく、個々の半数（ HAP）。細胞は1.75時間後に回収したときは、50％以上がunbuddedたと他のサブカテゴリが（内側、外側、または端末蕾と）同じように表されていました。 2.5時間後、4つの各カテゴリ（unbudded、内側、側面または端末芽を含む）中で受精卵のほぼ同数であった。 顕微鏡観察（図4）： 接合体の構造は、精製時に変わらないように見えます。十字架の期間によると、人口は上記で説明したように、unbuddedと出芽受精卵の異なる比率を持っていた。緑と赤の半数体の両方が蛍光シグナル強度にはかなりのばらつきが認められたのでcomparinによって観察されるように他の人が、主に緑だったが、一部の受精卵は、主に赤だったグラム図4の合成画像に単色画像。 GFP（MW 26kDa）が核に入り、核が融合していなくても、核内で見つけることができることにも注意してください。空胞は黒色、非蛍光球として際立っている。 浄化の最終製品は、開発のさまざまな段階で多様な人口をもたらします。受精卵は、核融合を経ていない標識した。タイプBの受精卵はunbuddedされています。タイプCは小さな芽を持っている。型が大きい芽を持っているD、およびEタイプの受精卵は分裂を起こししようとしています。以前の受精卵の多くは依然として非蛍光内側分割線（*）を示し、液胞&quot;継承構造&quot;（私は）12が頻繁に芽に受精卵から延びるように見ることができることにも注意してください。いくつかのケースでは、緑色の信号が赤の信号はそれほど大きい程度に相手に再配布しています。これはポリソームの特徴である（Tartakoff、準備中）転送の遅延を反映している。 6個の受精卵を回収。我々は細胞のこの番号からのRNAの約1.5 mgをフェノール - クロロホルム抽出分離プロトコルを使用している。 精製された受精卵は、先行さらなる分析に、冷やしされているので、我々は℃の成長培地中で23℃でインキュベーションすることをお勧めします。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> 図1。接合体形成の年表。半数と二倍体の間の中間のような受精卵。この図では、古典的な半数体の活性化（shmooing）、それらの融合、および初期芽の形成を示している。蕾はどちらか、（M）は内側横（L）または端末（T）とすることができる。 <imgALT = &quot;図1&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg&quot; /&gt; 図2。受精卵精製プロトコールの概略。インキュベーション後グルコースを含む完全培地中の寒天プレートの表面には、細胞混合物を洗浄することにより回収し、純度モード&quot;で第二ソート続いて&quot;リカバリモード&quot;で最初の並べ替えを行った。 &quot;黄色はmCherryとGFP両方の信号が受精卵で表示されていたことを意味します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> 図3。精製した画分における受精卵の品種。合混合物は、比較的早期対相対的に、より成熟した受精卵に富む画分を回収するために1.75または2.5時間後に回収した。異なる色で指定された8つの独立した実験は、各時点に対して行った。グラフは、接合体の相対的な数字を示していることヘクタール花芽形成の空間的に異なるパターンをVEの。インキュベーションの短い時間（室温で2.5未満の時間）は、与えられた観測されたすべての芽が初期接合子の発芽のイベントです。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> 図4。濃縮されたフラクションのDeltaVision検査。典型的なフィールドがDeltavision顕微鏡で調べた。イラストはどちら赤と緑または単一の両方の色を示しています。赤は細胞質GFPにポリソームラベル（Rpl25p-mCherry）と、緑に対応しています。液胞（V）、蕾（b）に示すように、核（n）は、液胞 &quot;継承構造&quot;（i）、および親を分離するために表示されるパーティション（*）：受精卵の高濃縮、および指定された細胞内の特徴に注意してください。比較的早い受精卵のドメイン。それらの変数は全体の色が融合した半数体の相対的な強さを反映している。 2つの親ドメインが保持している場合などではマーカーの異なる色、平衡（細胞質GFP、mCherryタグ付きポリソーム）が不完全であった。進行中の時間経過の研究は前ポリソームに対する可溶性GFPの再配布。ことを示す<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 補足伝説<img alt="図S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> 図S1に。ハプロイド細胞の蛍光左端：mCherryタグ付きポリソームを発現する細胞は緑色の信号を検出するために検討した。矩形窓は陰性細胞を回避するために設定されていました。真ん中のグラフ：細胞質GFPを発現する細胞は陽性のはっきりと明るい主要な人口を示す、分析した。右端：mCherryタグ付きポリソームを発現する細胞を分析した。矩形は（左端上のものと同一）明るい細胞が含まれており、すべてのことができます避けるべきネガ。名称 &quot;R2&quot;が指示された矩形内に回収された細胞の割合を示します。 <img alt="S2図" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> S2図。第一及び第二のソートでは、細胞分布。これら2色のプロットは、右上の象限（R5）で緑+赤+細胞の割合を示す。この割合は、第二ソートには52％に増加します。横軸：緑信号。縦軸：赤信号。

<ol><li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHerskowitz%2C+I+%22Control+of+cell+type+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+Mating+type+and+mating-type+interconversion%22">Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion</a>. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).</li>
<li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+Van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li>
<li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li>
<li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li>
<li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li>
<li>Dujon, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDujon%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Yeast+Saccharomyces%3A+Life+Cycle+and+Inheritance%22">Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance</a>. Jones, E., Strathern, J., Broach, J. , Cold Spring Harbor Press. 505-635 (1981).</li>
<li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+yeast+mating+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li>
<li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mating%3A+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li>
<li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+mating+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li>
<li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+D+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%2C+2005+Edition%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition</a>. , Cold Spring Harbor Press. (2005).</li>
<li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li>
<li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelles+on+the+move%3A+insights+from+yeast+vacuole+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

精製された受精卵の可用性は、別の方法として、受精卵が出発生成される可能性がトランスクリプトミクス、プロテオミクス、リピドミクス、並びに受精卵が細胞周期の再入国、細胞壁のリモデリング、出芽と継承の特性を受ける際のメカニズムの調査を含む生化学的研究等を促進しなければならない一方または両方の両親に特性変異を有する菌株による。また、精製された受精卵は、半数体または二倍体細胞の場合と、15％グリセロールを含む培地中で凍結することができ、後で再発新進の側面を監視するために解凍した。 微視的な目的に適した他の蛍光マーカー（ 例えば、タグ付けされたヒストンまたはミトコンドリアタンパク質）を使用して予備実験では受精卵の信頼回復を許可されていませんが、それは同等の精製は、その細胞壁ハプロイド細胞から始まる達成できる可能性がある、または赤に結合されている緑色蛍光団。我々は、sを避けてきましたUCH手続き彼らがさらなるストレスを課し、接合体形成の初期段階に影響を与える可能性があるためです。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/機器 </td><td> ソース </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> pEG220、URA3/YIpコードする細胞質GFP 11） </td><td> E·グロート</td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661、URA3/CEN、mCherryに融合されたエンコーディングRPL25 </td><td> A.ジョンストン</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーFB120ソニケーター</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td></td></tr><tr><td>ストレーナキャップ付きポリプロピレンチューブ</td><td> BDファルコン</td><td> REF 352235 </td></tr><tr><td>冷蔵フュージ</td><td>トミー</td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td>フローサイトメトリーシース液</td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> iCyt反射モデルフローサイトメーター</td><td>ソニー</td><td></td></tr><tr><td> DeltaVisionデコンボリューション顕微鏡</td><td>アプライドPrecision </td><td></td></tr><tr><td>直立落射蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td></tr><tr><td>超高純度アガロース</td><td>インビトロジェン</td><td> 15510から07 </td></tr><tr><td> CSMのグルコース製剤 注意：寒天プレートの場合は、単に2％寒天（Difco）を含む</td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

のフローサイトメトリーベースの精製<em&gt; s.セレビ</em&gt;受精卵

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

受精卵は、酵母（ 図1）1 を含む多くの生物のライフサイクルにおける半数体と二倍体の状態の間の本質的な中間体である。S. cerevisiaeは異なる交配型（マタ、MATalpha）の半数体細胞の融合の結果を受精卵と相次い著しく非対称な有糸分裂2の結果と同様に多くの20倍体子孫を生成し、対応する安定した二倍体を生じさせる。接合子形成はイベントの複雑なシーケンスによって調整されます：このプロセスでは、可溶性交配因子が受容体を同族に結合し、細胞と細胞の融合細胞周期と絶頂に達するの中断を促進するレセプター媒介性シグナル伝達カスケードをトリガする。受精卵は、前駆細胞または幹細胞機能のモデルと考えられるかもしれません。 多くの受精卵の形成について学習されていないが、受精卵は一般signifの細胞分子質問を調査するために使用されているもののicanceは、ほとんどすべての研究は、受精卵が3月8日ハプロイド細胞の大多数の人口と混在されている交配混合物を利用してきました。接合子形成と接合子の継続生命の生化学の多くの側面は、したがって、未調査のままである。 酵母の接合体の浄化のレポートでは、沈降特性9に基づいてプロトコルを記述しますが、この沈降ベースの手順は私たちの手の中に約90％の純度が得られなかった。また、細胞は高張ソルビトールにさらさ​​れているという欠点を有している。そこで我々は、汎用性の高い精製法を開発しました。この目的のために、赤色または緑色蛍光タンパク質を発現するハプロイド細胞のペアは、接合体形成、様々な時期に収穫し、得られた受精卵は、フローサイトメトリーベースのソートプロトコルを用いて精製したを可能にするために共同でインキュベートした。この手法は、純粋さと成熟の便利な視覚的評価を提供します。平均純度画分の約90％である。収穫のタイミングに応じて、成熟度の異なる受精卵を回収することができる。精製されたサンプルは、 &quot;-OMIC&quot;研究のために、初期の子孫の回復のため、この前駆細胞の系統的な調査のための便利な出発点を提供しています。

の受精卵を精製するために<em&gt; S.セレビ</em&gt;、反対の交配型の半数体細胞をフローサイトメトリーベースのプロトコルを使用して接合体​​形成を可能にするために共インキュベート、赤色または緑色蛍光タンパク質を発現するように操作し、分画した。高濃縮画分は初期の子孫のその後 &quot;-OMIC&quot;研究、リカバリ、および受精卵形態形成の体系的な調査が可能になります。

のフローサイトメトリーベースの精製<em&gt; S.セレビ</em&gt;受精卵

接合子は、酵母（図1）を含む多くの生物のライフサイクルにおいて、倍数性と単倍数性の状態を繋ぐ不可欠な中間体である 1。S. cerevisiae ...

本実験の全体的な目的は、精製された酵母接合子の集団を作製することです。まず、反対の接合型を持つ半数体細胞において、細胞質GFPまたはM cherryタグ付きのpoly zonesを発現させます。これらの細胞を対数増殖期まで培養した後、混合して共インキュベートし、接合体を形成させます。次に、交配混合物を回収し、リカバリーモードでのフローサイトメトリーによって分取し、赤色および緑色のダブルポジティブ細胞を単離します。このサブポピュレーションには、接合前および接合後の個体がどちらも含まれています。サンプルをさらに精製するため、赤色および緑色のダブルポジティブ集団に対して2回目のフローソートを行います。純度重視モードを使用します。この手順により、視覚的検査および蛍光顕微鏡による細胞の定量に基づき、平均90%の接合子の純度が得られます。沈降法などの既存の手法と比較した本手法の利点は以下の通りです。第一に、この手法により、接合子の純度と成熟度を簡便に視覚的に評価することが可能です。第二に、我々の検討では、接合子画分の平均純度は約90%であり、既存の手法よりも大幅に高い値となりました。我々の精製法は、真核細胞における倍数性の変化（半数体から二倍体への移行）に関する重要な生物学的疑問に分子レベルで答える一助となり得ます。これについては、下等真核生物と高等真核生物の間でかなりの保存性が認められています。したがって、酵母の接合子を研究することは、接合子の生物学に関する全般的な理解を促進すると考えられます。また、接合子は前駆細胞や幹細胞機能のモデルとしても検討できる可能性があります。凍結保存した酵母株を固形アガー増殖培地にストリークし、接合子精製の前日まで、室温または 30 °C でコロニーが出現するまでインキュベートして、Grow s cera, VCA, Matt A および Matt alpha BY 47 41 の細胞を増殖させます。形質転換した soluble GFP および RPL 25 M.Cherry の soluble 表見体を培養するために、2本の 50 mL コニカルチューブにラベルを貼ります。一方の培養チューブに、細胞質で soluble GFP を発現する形質転換表見体を接種し、もう一方に、単一のリボソームタンパク質を発現する形質転換表見体を接種します。mCherryを融合させたRPL 25。培養液を23°Cで一晩振盪培養し、A600が1.0を超えないように調整します。次に、交雑を行うため、各サンプルの光学密度を新鮮な培地で1.0（約3 × 10⁷ cells/mLに相当）に調整します。次に、2つの培養液を等量ずつ、新鮮な培地を用いて50 mLコニカルチューブ内で混合します。短時間に3回ボルテックスした後、さらに10秒間ボルテックスします。その後、ピペットチップを液面に1 cm上の位置に配置します。温度設定済みのCSMグルコースプレートを用意します。30分のタイマーを開始し、混合培養液 40 µLをプレートの周囲に沿って、円周全体に滴下します。蓋を開けたままベンチトップ上で約30分間、プレートを乾燥させます。液体が吸収されたら、プレートに蓋をし、室温で1.75から2.5時間そのまま放置します。極性成長のプロセスにより、特徴的なschmo様形態が形成されます。schmoフェーズの間、2つのhaid細胞は、細胞同士が接触するまで互いに成長を続けます。その後の細胞融合により接合子が形成されます。新生した接合子はその後、有糸分裂細胞周期に再び入り、最初の二倍体出芽を生じさせます。インキュベーション後、プレートを氷上に置き、個々の乾燥したドロップレット領域を150 µLの冷 CSM glucoseで10〜20回洗浄してサンプルを回収します。洗浄液を15 mLのコニカルチューブに回収し、氷上で保持します。次に、サンプルを氷上に置いたまま、各チューブを60%の振幅で10回プローブ超音波処理します。超音波処理後、位相差顕微鏡で凝集塊がほとんど、あるいは全く残っていないことを確認してください。細胞の15〜50%が接合子を形成していることが予想されます。この時点で、残っている凝集塊を沈殿させるための予防策として、細胞の入ったチューブを垂直に立てた状態で、氷上で10分間静置します。上層の90%の容量を回収し、ストレーナーキャップ付きのナイロンメッシュポリプロピレンチューブでろ過します。標準的な実験では、1枚のプレートから10⁷個の細胞を回収し、4 mLのCSM Glucoseを用いて細胞ソーティングを行います。ソーティングには、100 µmのチップを備えたHAPS 1搭載のSony eyesight reflectionモデルフローサイトメーターを使用します。まず、win list 3DソフトウェアでGFP励起用の励起レーザーを選択します。M cherryの励起には、488 nanometersの青色Argonneイオン500 milliwattレーザーを使用してください。HAPSコントロールソフトウェアでは、561 nanometersの100 milliwattレーザーを使用します。リカバリーモードが選択されていることを確認し、ソーティング用のシース圧を21.5 pounds per square inch、液滴頻度を43, 400 drops per second、サンプル圧を20.5 pounds per square inchに設定します。生存細胞をゲートするために、前方散乱光対後方散乱光のプロットに基づいてソーティングパラメータを決定します。なお、ここで使用しているSony eyesightマシンでは、特異的にサイドスキャターのプロットをバックスキャターとして表示していますが、このバックスキャターは機能的にサイドスキャターと同等です。M cherry対GFPの放出プロットを作成し、イベントを4つのクアドラントに分割します。赤陽性・緑陰性、赤陰性・緑陽性、赤陽性・緑陽性、赤陰性・緑陰性、および赤陰性・緑陽性。赤陰性・緑陰性象限を決定するための標準として、非蛍光細胞を使用してください。初回ソート用です。リカバリーモードを選択し、250 mLの冷 CSM glucoseを含む冷却マイクロ遠心チューブにサンプルを回収します。回収後、冷却マイクロ遠心機を用いて最高速度で10秒間細胞を沈殿させます。遠心後、フロー溶液を吸引除去し、500 µLの冷 CSM glucoseで再懸濁します。1回のソートでは十分な濃縮が得られないため、部分的に精製したサンプルを60%の振幅で2回、短時間プローブソニケーションします。生存細胞に対して純度モード（purity mode）のオプションゲートを使用して再度細胞をソートし、M cherry対GFPの放出プロットを作成して、精製細胞（沈殿物）を0.5〜1.0 mLのCSMグルコースに再懸濁します。遠心分離後、24ウェルプレートの各ウェルに0.5 mLずつ移し、細胞を15分間振盪します。代謝回復を促すため、24ウェルプレートを用いて23 °Cで保持します。Agrosパッドを準備するには、1.5% AgrosをCSMグルコースに懸濁させた溶液を15 mLコニカルチューブに入れ、沸騰させます。溶液を短時間ボルテックスし、Agros溶液を0.3 mLずつ、少なくとも2〜3枚の標準ガラススライドの表面に塗布し、直ちに別のスライドで覆います。圧力をかけないでください。スライドを10分間冷却します。arosパッドをすぐに使用しない場合は、上のスライドを外さずに、室温の加湿チャンバーに入れてください。これらは最大1日間保存可能です。その後、上のスライドを水平に滑らせて、ゆっくりと取り除きます。表面を滑らかに保ち、aros層を乱さないように注意しながら、1〜2分以内に、表面に触れないようにして、沈殿した細胞の1 µL分注液をarosパッド上に滴下します。すぐに正方形のカバーガラスでサンプルを覆い、片刃カミソリで余分なアガロースを切り落とします。シリンジを使用してカバーガラスの端にワセリンを塗布し、DeltaVisionを用いて、ビニングなしの100倍油浸対物レンズで画像を撮影します。理想的な視野は、個々の細胞を識別できる十分な間隔を保ちながら、細胞が単層に並んでいる状態です。撮影が完了したら、0.2から0.4 micronの間隔でイメージングを行います。Softworks 5.0 0.0プログラムを用いてZacksをデコンボリューションし、標準的な20サイクルのデコンボリューションで最小限の処理を行います。DeVol画像における背景信号を最小限に抑えるため、赤色蛍光と緑色蛍光の強度を調整し、形質転換細胞における蛍光タンパク質の発現を評価します。交配前および交配後の細胞をフローサイトメトリーで解析しました。基本的に、すべてのM cherry形質転換体は赤色であり、すべてのGFP形質転換体は緑色でした。M cherryのシグナルはGFPのシグナルよりも強度は低かったものの、サイトメトリーと蛍光顕微鏡の両方で検出されたことに注意してください。細胞を分取し、R2クアドラントに現れる最も輝度の高い細胞を選択し、ここで示されているようにGFP形質転換体とともに2.5時間培養しました。交配後、赤色および緑色の陽性サンプルは全集団の8.89%を占めていました。最初の回収ソート後、これは52.4%まで濃縮され、その後、赤色陽性かつ緑色陽性の細胞の同様の調製試料21検体を位相差顕微鏡で検査した際の2回目の純度ソートによってさらに濃縮されました。接合子の数を評価したところ、平均純度は90%でした。不純物は、緑色または赤色の単倍体、あるいは接触していた単倍体のペアでした。これは、初期の接合子芽の出現キネティクス、および正中、外側、端における接合子芽の発生頻度と分布を決定するためです。単倍体は1.75時間または2.5時間交配させた後、フローサイトメトリーでソートし、エピ蛍光顕微鏡で検査しました。1.75時間後に細胞を回収したところ、50%以上が芽を持たず、中央部に位置していました。2.5時間後には、側芽と終端芽が同等に認められました。しかしながら、芽のないもの、および中央、側方、または終端に芽を持つものの4つのカテゴリーそれぞれに、ほぼ同数の接合体が存在しました。接合子の構造は、精製中も変化せず維持されていると考えられます。GFPは核内に移行するため、核が融合していない段階でも核内に認められることに留意してください。ESは、蛍光を発しない黒い球体として際立って見えます。精製の最終産物として、さまざまな発達段階にある多様な集団が得られます。Aとラベル付けされた接合子は、融合を起こしていません。タイプBの接合子は、未バター化の状態です。Cタイプは小さな出芽があり、Dタイプはより大きな出芽があり、Eタイプの接合子は細胞質分裂が起こる直前の状態です。また、初期の接合子の多くには、依然として非蛍光性の正中分裂線が見られ、極性遺伝構造が接合子から出芽へと伸びていることがしばしば観察されます。この手順を実施する際は、リカバリーソートとそれに続く純度ソートの両方を行うことが重要です。最終産物の接合子の純度を高めるには、2回目のソートが不可欠であることが分かりました。このビデオを視聴することで、フローサイトメトリーを用いて精製接合子を分取する方法、顕微鏡を用いた純度の評価方法、および蛍光脱畳み込み顕微鏡を用いて接合子を封入し撮影する方法について十分に理解することができます。

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生物学

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のフローサイトメトリーベースの精製

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