Name: 同所性膀胱腫瘍モデルと膀胱内Sarnaの治療の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学ぶ同所性膀胱腫瘍モデルの構築法。免疫不全マウスを用いて膀胱内saRNA治療の抗腫瘍効果を評価し、超音波とバイオルミネセンスイメージングで腫瘍成長をモニタリングします。

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本研究では、AACRヘンリー·シェパード膀胱がん研究助成金（09から60-30-LI）によって運営されている。

動物を対象とする手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物実験及び利用委員会（IACUC）によって承認されています。 1。細胞調製<ol><li>ヒト膀胱癌細胞株KU-7-luc2-GFP（キャリパーライフサイエンス、ホプキントン、MA）は、10％ウシ胎児血清、50μg/ mlのゲンタマイシンを含むRPMI-1640培地で栽培されています。 </li><li>培養は37℃で維持され、メディアと5％CO 2は、2〜3日ごとに変わります。 </li><li>細胞は、トリプシン消化により回収し、血球計算板を用いてカウントした。 50μlの2×10 6細胞の単一細胞懸濁液は、リン酸塩で調製した緩衝生理食塩水と氷上で保存する。 </li></ol> 2。同所性膀胱腫瘍モデル<ol><li> 8月10日週齢雌ヌード（NU / NU）マウス（シモンセン研究所Gilory、CA）を使用した。 </li><li>提供するために加温パッド上に滅菌ドレープを配置SA外科的プラットフォームを提供します。無菌の潤滑ゼリー、スタイレット針、硝酸銀溶液、および滅菌水で24-guageカテーテルが用意されています。 </li><li>一般的な麻酔薬は、吸入イソフルラン（誘導のために3％、メンテナンスのために1-2％）とノーズコーンを介して維持したままマウスで誘導される。無菌眼軟膏は、動物の目に適用され、熱パッドは体温を維持するために使用されています。 </li><li>仰臥位でマウスを置きます。 </li><li>穏やかに安定化のための鉗子で、動物の外陰部を把握する。 </li><li>削除針スタイレット24-guage静脈カテーテルを使用して、マウスの尿道にカテーテルを挿入されています。十分な潤滑を使用する必要があります。マウスの仰臥位で、尿道は外陰部のひだと膣の前方にすぐに後方に位置しています。 45度の角度は、最初は恥骨の下にある尿道をカニューレを挿入し、合格するために取られます。より浅い角度は、膀胱に尿道を通過する取得されます。穏やかな骨盤の圧力尿道がしばしば助けることができるまっすぐにしてください。注意これは尿道や膀胱穿孔につながることができますので、抵抗に対してあまりにもハードにプッシュしないように注意する必要があります。カテーテル内に見られる尿は、膀胱内腔の位置を確認します。 </li><li>スタイレット針を用いてカテーテルや膀胱内腔から尿を吸引します。スタイレット針を所定の位置にカテーテルを残し、後続のすべての願望と注射のために使用されます。これは、カテーテル内のデッドスペースをなくすことで正確な量の注入を可能にし、それが繰り返されるカテーテル挿入が不要になります。 </li><li>膀胱尿路上皮のグリコサミノグリカン層を損なうために、0.5 M硝酸銀の10μLを注入し、10秒間滞留を許可されている。これは、残りの尿と白色沈殿物を形成することがあります。 </li><li>スタイレット針を用いて沈殿物、膀胱内容を吸引して廃棄します。 </li><li> 100μLの滅菌水を注入して膀胱を洗浄します。水を吸引して廃棄します。 REPE4回洗浄の合計滅菌水で洗浄3回。 </li><li>カテーテル抜去の準備のために尿道を閉塞するために尿道口の周りに4から0絹のネクタイを配置します。 </li><li>注入する前にスタイレット針を用いて50μLで2×10 6 KU-7-luc2-GFP細胞を用意しました。 </li><li>同時に絹のネクタイで閉塞尿道を残して、カテーテルとスタイレット針を削除します。 </li><li>絹のネクタイが削除され、動物が起こされる前に、マウスが2時間全身麻酔下で維持されます。 </li></ol> 3。超音波検査<ol><li>全身麻酔は、ノーズコーンを介して気化したイソフルラン維持で誘導されています。 </li><li> RMV-704 40 MHzのプローブを用いたin vivoで VisualSonics VEVO 770高解像度マイクロイメージングシステム（VisualSonics株式会社、トロント、オンタリオ、カナダ）を用いた。 </li><li>超音波プラットフォーム上で仰臥位にマウスを置きます。 </li><li>動物の後ろ足を確保するテープで超音波プローブの操作中に過剰な運動を避けることができます。 </li><li>マウスの骨盤に超音波ゲルを適用します。 </li><li>横または縦の画像を得るために、マウスの骨盤の上にRMV-704（40 MHz）の超音波プローブを下げます。 </li><li>腫瘍が見つかった場合、画像は、腫瘍の大きさの測定のために保存することができます。 </li></ol> 4。生物発光イメージング<ol><li> 200μLの腹腔内注射（150 mg / kg）のルシフェリン基質を実行します。 </li><li>イソフルラン気化して全身麻酔を誘導し、ノーズコーンを介して維持されます。 </li><li>生物発光イメージャー内に仰臥位にマウスを置きます。 </li><li>ルシフェリン投与5分後には、1秒当たりの光子の動物から生物発光を測定します。 </li></ol> 5。 Sarnaの準備<ol><li> 50から100マイクロモルのスケールでのRNAオリゴヌクレオチドを​​合成する。 </li><li>私は、相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを​​アニールNTO二重saRNAs。 </li><li> [1,3]ジオキソラン（DLinKC2-DMA）、disteroylphosphatidylコリン、コレステロール、PEG-DMG - 脂質ナノ粒子（LNP） - Sarnaのは、イオン性脂質1,2 - dilinoleyl -4 - （ - ジメチルアミノエチル2）で用意されて前述のように自発的ベシクル形成の定式化プロシージャを使用して1。 </li></ol> 6。配合Sarnaのの膀胱内投与<ol><li>同所性膀胱腫瘍モデルを確立した後、マウスは脂質ナノ粒子（LNPs）（ 表1）で定式化膀胱内小活性化RNA（Sarnaの）で処理されています。 </li><li>一般的な麻酔薬が確立し、維持イソフルラン気化して、無菌眼科用潤滑剤が適用されています。 </li><li>仰臥位で動物を配置します。 </li><li>前述のように尿道カテーテルを実行します。 </li><li>尿道とカテーテルの周囲に4から0絹のネクタイを配置します。 </li><li>カテーテルからすべての尿を吸引除去し、空のシリンジとスタイレット針を用いて膀胱。 </li><li> 50μL（3 mg / kg）の総線量のために膀胱内にLNP-Sarnaのを注入します。同時に絹のネクタイで閉塞尿道を残して、カテーテルとスタイレット針を削除します。 </li><li>マウスは2時間閉塞尿道麻酔のままになります。 </li><li>膀胱LNP-Sarnaのによる治療は、腫瘍移植後4日目に開始されました。マウスは、14回、合計3日ごとに、連続的に処理した。 </li></ol> 7。代表的な結果 KU-7-luc2-GFP細胞に由来する膀胱腫瘍は、ルシフェラーゼの生物発光イメージング（ 図1AおよびC）と膀胱の超音波（ 図1BおよびD）で監視することができます。腫瘍は、しばしば細胞接種後3-5日以内に検出されています。我々は、マウスの90％以上の成功した膀胱腫瘍の移植を見つけました。膀胱dsRNAは治療が続いて起こるように、腫瘍の進行は、wiを監視することができますこれらのモダリティ番目。動物が犠牲にされた後、腫瘍の成長はまた、GFPの蛍光を用いて確認することができます。一般に、 図の1C及び1Dに視覚的に見られるように膀胱腫瘍の平均超音波の寸法との相関生物を意味する。動物を屠殺し、腫瘍はGFPによって確認された後、しかし、我々は、生物発光が超音波測定はよりも実行可能な腫瘍の存在とより密接に相関した。処置したマウスにおける残留瘢痕組織は、しばしば超音波による可視化であったが、ライブの腫瘍と区別することができませんでしたので、これはSarnaの（ようにコントロールするのではなく）で処理したマウスの間で特に明らかであった。 <img src="/files/ftp_upload/4207/4207fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：膀胱腫瘍の腫瘍増殖動態。 （A）生物発光イメージングは​​、それらの位置と成長を確認するために膀胱腫瘍内のルシフェラーゼ活性を測定します。 （B） 生体内膀胱ultrasoun でD 40MHzのプローブを使用すると、その寸法を正確に測定することができる腫瘍の画像を生成します。 （C）グラフは、生物発光と超音波の次元で腫瘍の漸進的増加を示す。 6匹の動物から- （標準偏差+ / - ）の測定値は平均値を表しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4207/4207fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

<ol><li>Semple, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+cationic+lipids+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rational design of cationic lipids for siRNA delivery.</a> Nature. 28, 172-176 (2010).</li>
<li>Li, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+dsRNAs+induce+transcriptional+activation+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).</li>
<li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+effect+of+dsRNA-induced+p21%28WAF1%2FCIP1%29+gene+activation+in+human+bladder+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells.</a> Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).</li>
<li>Chancellor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+results+of+myoblast+injection+into+the+urethra+and+bladder+wall%3A+a+possible+method+for+the+treatment+of+stress+urinary+incontinence+and+impaired+detrusor+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourology+and+urodynamics%22%5BJournal%5D)">Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility.</a> Neurourology and urodynamics. 19, 279-287 (2000).</li>
<li>Hadaschik, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+mouse+model+for+orthotopic+bladder+cancer+using+transurethral+tumour+inoculation+and+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+international%22%5BJournal%5D)">A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging.</a> BJU international. 100, 1377-1384 (2007).</li>
<li>Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Bladder+Wall+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Bladder Wall Injection.</a> J. Vis. Exp. (53), e2523(2011).</li>
<li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Model+of+Murine+Bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Model of Murine Bladder.</a> Cancer. J. Vis. Exp. (48), 2535(2011).</li>
<li>Dinney, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+metastatic+variants+from+human+transitional+cell+carcinoma+passaged+by+orthotopic+implantation+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+urology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice.</a> The Journal of urology. 154, 1532-1538 (1995).</li>
</ol>

LCLは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校が提出したとアルナイラム·ファーマシューティカルズにライセンスされていますSarnaのに関連した特許出願を保留中の名前の発明者である。

我々は、転写活性化にp21のCIP1/WAF1（P21）のプロモーターを標的とLNP策定Sarnaの腫瘍の膀胱内治療に続いてマウス同所性異種移植膀胱腫瘍モデルの確立のためのプロトコルを提示します。2、3の結果、腫瘍ができる生物発光イメージングと膀胱の超音波で確認し、監視されます。同所性モデルは、より密接に内因性の膀胱癌を近似している尿や尿路上皮の環境を提供することにより、腹腔内、皮下、または静脈内モデルよりも優れている可能性があります。同所性マウス膀胱腫瘍の様々な両方の直接膀胱壁の注入だけでなく、膀胱内注入を使用して確立されています。腫瘍の4月8日膀胱内注入が、ここで示したように、より密接に粘膜上皮に表面的に開始し、より深く成長するヒト膀胱腫瘍を模倣し彼らは進歩として。 BLADに対応するために、硝酸銀を用いた我々の方法腫瘍取り込みのためのDERを、安価で技術的に簡単です。 Hadaschik ら 、マウスで膀胱腫瘍の膀胱内注入を説明し、信頼性の高い発光腫瘍の評価が報告されました。5</...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> KU-7-lucを-GFP細胞</td><td>キャリパー</td><td> 128091 </td><td></td></tr><tr><td>胸腺ヌードマウス（NU / NU） </td><td>シモンセン研究所</td><td> 6から7週齢</td><td> SIM：（NCR）NU / NU fisol </td></tr><tr><td>超音波装置</td><td> Visualsonics </td><td> VEVO 770 </td><td> RMV-704プローブ</td></tr><tr><td>生物発光ユニット</td><td>キャリパー</td><td> IVISスペクトラム</td><td></td></tr><tr><td>エクセルsafeletカテーテル</td><td>フィッシャー</td><td> 14-841-21 </td><td> 24G X¾ &quot; </td></tr><tr><td>硝酸銀</td><td>シグマ</td><td> S8157 </td><td></td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ</td><td>ハミルトンの共同mpany </td><td> 80301 </td><td></td></tr><tr><td> LNP-Sarnaの</td><td>アルナイラム医薬品</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1特異的試薬および装置。

同所性膀胱腫瘍モデルと膀胱内sarnaの治療の評価

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

私たちは、同所移植マウス膀胱腫瘍モデルでは膀胱内に配達小さな活性化RNA（Sarnaの）と膀胱癌を治療するための新たな手法を提案する。マウスモデルは、吸入全身麻酔下に尿道カテーテル法によって確立されます。化学熱傷は、その後膀胱グリコサミノグリカン層を破壊するために膀胱内の硝酸銀溶液を用いた膀胱粘膜に導入され、細胞が付着することを可能にします。滅菌水で数回洗浄後、ヒト膀胱癌KU-7-luc2-GFP細胞は2時間に住むために膀胱にカテーテルを通して注入されています。膀胱腫瘍のその後の成長は 、in vivo膀胱超音波および生物発光イメージングによって確認され、監視されています。腫瘍はその後脂質ナノ粒子（LNPs）に策定Sarnaので膀胱内に処理されます。腫瘍の成長は、超音波検査および生物発光で監視されています。この手順のすべてのステップは、添付のビデオで実証されています。

超音波検査および生物発光イメージングによる膀胱内に配達Sarnaのとモニタリング腫瘍成長の抗腫瘍効果を評価するために同所性膀胱腫瘍モデルを確立します。

同所性膀胱腫瘍モデルと膀胱内Sarnaの治療の評価

我々は、正位異種移植マウス膀胱モデルを用い、膀胱内投与による小型活性化RNA（saRNA）で膀胱癌を治療する新規手法を提示します。

免疫不全マウスにおいて、膀胱の同所性腫瘍モデルを確立する方法を提示します。これらの腫瘍に対し、血管内投与による小型二本鎖RNAによる治療を行い、膀胱超音波検査とバイオルミネッセンスイメージングの両方を用いて腫瘍をモニタリングします。気化したイソフルランで全身麻酔を導入し、滅菌眼軟膏を塗布します。次にマウスを仰臥位に固定し、ノーズコーンを用いてイソフルランで麻酔を維持します。続いて、マウスにカテーテルを挿入します。ここでは、針（スタイレット）を抜いた24Gの静脈留置カテーテルを使用します。カテーテル挿入は、プロトコルの中で最も困難で予測不可能なステップとなることがよくあります。KYゼリーによる十分な潤滑と正しい手技が、カテーテル挿入を成功させる鍵となります。ここでは、マウスの外陰部の領域を示しています。尿道は外陰 folds の直下に位置しています。潤滑剤を塗布した後、カテーテル鉗子を用いて外陰部と尿道を優しく把持し、固定します。最初は尿道に挿入するために急な 45 degree の角度を用いますが、一度尿道に入ると、膀胱までスムーズに通過させるため、より浅い角度に調整します。ここではこの手順を示します。繰り返しになりますが、尿道をまっすぐにするために骨盤に軽く圧力をかけることが有効な場合が多いです。ただし、抵抗があるときに強く押しすぎないよう注意してください。尿道や膀胱に穿孔を引き起こす可能性があります。ここでカテーテル内に見られる尿により、膀胱腔内に位置していることが確認できます。次に、スタイレット針を用いてカテーテル内の尿を除去し、カテーテルを留置します。カテーテルの先端が膀胱壁に接せず膀胱腔内に留まるよう、カテーテルの約5 mmが尿道外に見えている状態にします。カテーテルを深く挿入しすぎると、先端が膀胱壁に埋まり、注入ができなくなる可能性があります。以降のすべての注入について、スタイレット針に装着したシリンジをカテーテル経由で挿入します。これにより、カテーテル内の死腔が排除され、正確な量での注入が可能になるとともに、膀胱壁に熱傷を負わせる原因となる繰り返しのカテーテル挿入が不要になります。0.5 Mの硝酸銀を10 µL注入し、10秒間静置します。硝酸銀は膀胱内の残尿と反応して白色沈殿を形成することがあります。この沈殿物および残った溶液をカテーテルから除去します。次に、滅菌水 100 µL で膀胱内を4回洗浄し、その都度カテーテルルーメンから液体を除去します。この最初の洗浄後でも、カテーテル内には白い沈殿物がまだ見られますが、洗浄を繰り返すごとに液体はより透明になります。4-0シルク糸を用いて尿道を結紮し、これでがん細胞を注入する準備が整いました。細胞をスタイレット針に取り付けたシリンジに充填し、膀胱内に注入します。カテーテルを抜去し、マウスを麻酔下に置いた状態で、尿道を結紮したまま2時間保持します。あらかじめ設定した間隔で、腫瘍の進行をモニタリングします。in vivo 生物発光イメージングを用いて、まずマウスの腹腔内にルシフェラーゼと基質を注入します。気化イソフルランで全身麻酔をかけた後、マウスをIVIS装置の中で仰臥位に固定します。生物発光は、1秒あたりのフォトン数として測定されます。マウスの膀胱内にKU7細胞が存在していることは容易に確認でき、生物発光強度の経時的な変化を追跡することが可能です。また、膀胱腫瘍の存在と進行は超音波イメージングによってもモニタリングできます。気化イソフルランで全身麻酔を導入した後、滅菌眼軟膏を塗布します。マウスを超音波診断装置のテーブルの上に仰臥位で配置します。ノーズコーンを用いてイソフルランにより麻酔を維持します。超音波プローブの操作中に身体が過度に動くのを防ぐため、マウスの後肢をテーブルに固定することができます。これが完了したら、動物の骨盤正中部に超音波用ジェルを塗布します。ジェルを塗布した後、40 MHzプローブを保持装置に固定し、動物の体にゆっくりと降ろします。膀胱は、正中にある円形の低エコー構造として容易に確認できます。麻酔前に動物に著しい刺激がなかった場合、通常はすでに膀胱が拡張しているため、膀胱拡張のためにマウスにカテーテルを挿入する必要はないことが分かりました。この状態で、横断像と縦断像の両方を取得できます。膀胱腔内の腫瘍は容易に確認できます。腫瘍が確認された場合、腫瘍径を測定するために画像を保存できます。膀胱腫瘍の形成後、脂質ナノ粒子に製剤化した小型二本鎖RNAをマウスの膀胱内に投与します。全身麻酔をかけ、再度眼軟膏を塗布します。次にマウスを仰臥位に固定し、尿道カテーテル挿入を行います。既報の通り、4-0シルク糸を用いてカテーテル周囲の尿道を結紮します。通常、ここでは示すように2回結びを行います。スタイレット針に装着した空のシリンジを用いて、膀胱内を完全に吸引します。その後、小分子二本鎖RNA 50 µLを、総投与量 3 mg/kgとなるように膀胱内に注入します。最後に、針とカテーテルを抜去します。マウスは尿道を閉塞させた状態で、計2時間麻酔下に置かれます。このビデオを視聴することで、バイオルミネッセンスイメージングと超音波を用いて腫瘍をモニタリングし、膀胱内投与による小型RNAで腫瘍を治療する、マウス膀胱癌の正位移植モデル作成法について十分に理解できるはずです。この手法、特にカテーテル挿入にはいくつかの細かな注意点があり、習熟が必要ですが、全体としては容易に再現可能なプロトコルです。マウスへの膀胱腫瘍の移植は順調に進んでおり、小型RNAによる治療効果は非常に有望です。しかし、このプロトコルの最も画期的な点は、今回はマウスに小型RNAを投与しましたが、同様の手法を用いて、膀胱がんに対するあらゆる膀胱内注入療法の試験が行えることです。

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