Name: 胎児のマウスモデルにおける生物活性剤の気管内投与のための新しい手術アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶ 胎児マウスの気管内投与法。子宮切開と頸部切開で気管を可視化し、蛍光ビーズやウイルスベクターを直接注入することで、羊水内投与よりも効率的に胎児肺へ薬剤を送達できる新規手術アプローチです。

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MCとAVDPフランダースの科学技術によるイノベーションの促進のための研究所からの助成金（IWT-ブラーンデレン）でサポートされているポスドクです。 JTはUZルーベンから非常勤の臨床研究フェローシップ（KOOR）を保持します。 DVはKUルーベン、DBOF/10/062からの助成金によって支え博士研究員である。 MMDCはConselhoナシオナルデPesquisa電子Desenvolvimento（CNPq）とエラスムス·ムンドゥスからの助成金によって支え博士研究員である。研究助成金は、EC DIMI（LSHB-CT-2005から512146）によっておよびKUルーベンから in vivo分子イメージング研究グループ（IMIR） によって In、IWT-ブラーンデレンによって賄われていた。我々はrAAVベクター生産用プラスミドAAV6.2包装の彼らの親切なギフト用ジェームズM.ウィルソンによって設立UPennベクトルコアを承認したいと思います。

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

重要なステップ<ul><li>彼らは子犬の豊富な数（平均産仔数14.4±1.8、独自のデータ）を持っているので、我々が利用することを選んだマウス系統はNMRIマウスであり、よく介入を容認し、良い母親の特性を持っています。 </li><li>あなただけそうしないと再配置、胎児の頭ではなく肩を公開するように子宮壁と胎児膜を通して巾着を置くことは重要なステップであるトラウマを引き起こすことなく、ほとんど不可能である。 </li><li>あなたは気管と平行に走っている大きな血管を（頸静脈）を避けるように、後方に伸ばして胎児の頭の最適な位置が正確に気管の上の切開を行うことが不可欠である。 </li><li>視覚的に誤った注射を避けるために、手術用顕微鏡下に胎児の気管内に針の挿入に従うことが重要です。 </li><li>外傷を引き起こすことなく、子宮嚢に胎児の頭を交換すると、あなたのように非常に重要です子宮内や出生後の死亡率を増加させるでしょう胎児の頭部を負傷しないようにしたい。 </li><li>これは否定的に胎児の生存に影響を与えると同じように母はなく、初期のCO 2窒息で、唯一の帝王切開の時点で頸椎脱臼により殺される。...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> NMRIマウス</td><td> Janvier、ルGenestセント島、フランス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルレン</td><td> Isoba、インターベット/シェリング·プラウアニマルヘルス、ミルトンケインズ、イギリス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロレン6から0 </td><td>エチコン、グルートベイガールデン、ベルギー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビクリル5から0 </td><td>エチコン、グルートベイガールデン、ベルギー</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50μlのハミルトンガラスシリンジ、モデル1710.5 TLLX SYR </td><td>ハミルトン、リノ、ネバダ州、アメリカ合衆国</td><td> 5495から20 </td><td></td></tr><tr><td> 30G鋭い針</td><td>ハミルトン、リノ、ネバダ州、アメリカ合衆国</td><td> 7762から03 </td><td></td></tr><tr><td> 2パーセントキシロカイン</td><td>アストラゼネカ、ズーテルメール、オランダ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

胎児のマウスモデルにおける生物活性剤の気管内投与のための新しい手術アプローチ

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

細胞、遺伝子または薬理学的薬剤の胎児期の肺送達は、遺伝的および後天性疾患の様々な新たな治療戦略のための基礎を提供することができます。配信遺伝子の長期発現のための要件と先天性または遺伝性異常とは別に、短期的な遺伝子発現または薬理学的介入は、治療効果を達成するの​​に十分である、いくつかの非継承周産期の状態は、このための潜在的な将来の適応と考えられているアプローチの一種。短期的な出生前治療の適用のための候補疾患は、新生児呼吸窮迫症候群の1,2または新生児肺3の高酸素けがの原因となることがサーファクタントプロテインBの一過性新生児の欠乏である可能性があります。永久的な治療の訂正のための候補疾患は嚢胞性線維症（CF）4、界面活性剤の不備5、α1-アンチトリプシン欠損症6の遺伝的変異体である。 &lt;Pクラス= &quot;jove_content&quot;は&gt;一般的には、出生前の遺伝子治療の重要な利点は、このように個々に取り返しのつかない損傷を防止すること、患者の臨床症状の前に、あるいは、開発の早い段階で治療的介入を開始する機能です。胎児へのより効率的な遺伝子や幹細胞の伝達を可能にでき成体の臓器に比べて、さらに、胎児の器官は、細胞増殖の増加率を持っています。さらに、 子宮内遺伝子送達で個体の免疫系が完全に成熟していないときに行われます。したがって、正しいバージョンと非機能的か、または存在しないタンパク質の異種細胞または補充の移植は最近、携帯電話や遺伝子治療7の両方でケースであることが証明された細胞、ベクトルまたは導入遺伝子産物に対する免疫感作を起こすべきではありません。 そこで本研究では、マウスを直接メートルの胎児気管をターゲットにする可能性を検討odel。この手順では、このようなウサギ、羊8、さらには臨床の現場9のような大きな動物モデルで使用されていますが、マウスモデルで前に実行されない日があります。例えば、CFなどの遺伝性疾患の胎児の遺伝子治療の可能性を検討する際に、マウスモデルでは、異なるためトランスジェニックマウス系統の広い空、十分に文書化された胚及び胎児の開発の最初のproof-of-conceptとしてあまり厳しく非常に便利です倫理的な規制、短い妊娠期間と大産仔数。 別のアクセスルートはイントラ羊水注入10-12、卵黄嚢の血管15,16または臍帯静脈17に（超音波ガイド下）肺内注射13,14及び静脈内投与を含む、げっ歯類の胎児の肺を標的に記載されている。我々の新規手術は直接できますマウス胎児気管に最適な薬剤を注入するために研究者を可能にする既存の技術18より気道へのより効率的な配信のため。

我々は、マウスの胎児への生物活性剤の気管内投与のための新規な外科的アプローチを開発しました。配達ルートは、一般的に使用される羊膜内の注射よりも胎児のマウス肺を標的にするより効率的です。この手順では、マウスモデルで説明されていない最新情報を持っています。

細胞、遺伝子、または薬理学的薬剤の胎児期における肺への送達は、さまざまな遺伝性および...に対する新しい治療戦略の基盤となる可能性があります。

本実験の目的は、選択した薬剤をマウス胎児の気管に直接注入できるようにすることであり、これにより既存の技術よりも効率的に気道へ送達することが可能になります。これは、子宮切開によって胎児の頭部を体外に露出させ、胎児の気管にアプローチすることで達成されます。次に、頚部を垂直に切開して気管を視認し、視覚的なガイドの下で針を挿入します。次に、選択した物質を胎児の気道に効率的に届けるために、蛍光ビーズまたはウイルスベクターを気管内に注入します。処置した肺の組織切片を顕微鏡で解析すると、最も一般的に用いられている羊膜腔内投与ルートと比較して、気管内注入の方が蛍光分子やウイルスベクターを胎児の気道に効率的に届けることができることが示されています。胎児への羊膜腔内注入などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、注入した物質が羊水によって希釈されるのを避けられることです。これにより、胎児マウスの肺に存在する粒子の量的な効果を最大化します。一般的に、この技術に慣れていない方は、完璧な気管内注入を行うことは非常に困難であると感じるでしょう。これは、胎児の気管が極めて脆弱であり、そのため非常に簡単に穿孔してしまうためです。このように行うと、気管内への注入となり、胎児の肺を標的とすることができません。しかし、常にそうであるように、練習こそが上達への道です。気管内または肺内注入の準備として、妊娠中のMRIマウスを用意してください。手術時点での妊娠期間は18日とし、手術の前後に確認してください。マウスは、通常の室温および昼夜サイクル条件下で、水と飼料を自由に摂取できるフィルター付きケージで飼育します。イソフルランでマウスを麻酔した後、体温を維持するために37 °Cに設定したヒートパッドの上に置き、足指つまみ法（toe pinch）で麻酔深度を確認します。腹部をポビドンヨードで消毒し、正中切開を行って妊娠子宮を露出させ、2つの子宮角を体外に導出して妊娠嚢の数を数えます。胎児の頭部を外部に露出させるための最適な位置に基づき、各角に1匹ずつの胎児を処置します。胎児を子宮内に固定するため、肩から子宮壁および胎児頭部を露出させる領域の胎児膜にかけて、直径約1 cmの6-0プロリンによる巾着縫合を行います。次に、鋭利な先端を持つ小型の鋏を用い、巾着縫合の内側の子宮壁に約0.8 cmの切開を加えます。次に、子宮切開部から胎児の頭部と頸部をそっと押し出します。その後、巾着縫合糸をゆっくりと引き、頸部の周囲をしっかりと縫い合わせ、2本のマイクロ蚊鉗子を使用します。位置を固定するために、5-0 Polyactinを使用します。実体顕微鏡下で、胎児の頭部を過伸展状態に保持するため、2本のピンセットに装着した9-0縫合糸を上顎周辺の口内に配置します。鋭的におよび鈍的に剥離して気管を視認し、頸部を垂直に切開して、気管に到達するまで下層組織をさらに剥離します。30ゲージの鋭針を装着した50 µLのハミルトンガラスシリンジを用いて、物質を合計30 µL注入します。針を抜いた際に注入液の逆流が最小限であれば、注入が適切に行われたことを意味します。頭部を子宮内に戻すには、鼻先に軽く圧力をかけます。まず頸部が子宮に戻り、続いて頭部が戻ります。最後に、鼻部についてです。パースストリング（巾着縫合）の内側の切開部に、生理食塩水を入れた針を挿入します。パースストリングを締め付けて子宮切開部を閉鎖し、羊水過少を防止するため、羊膜腔内に合計約500 µLの生理食塩水を注入します。子宮を腹腔内に戻した後、5-0 Vicrylを用いて2層にわたる連続縫合を行います。母マウスの腹壁を閉鎖する際、術後の疼痛緩和のため、切開部位に0.2% Xylocaineを浸潤させます。胎児への羊膜腔内投与またはIA投与を行う場合は、マウスが完全に回復するまでヒートパッドの上に置いてください。妊娠マウスを麻酔後、ポビドンヨードで腹部を消毒し、正中切開を行います。妊娠子宮を露出させるため、2本の子宮角を体外に導出し、妊娠嚢の数を数えます。30ゲージの鋭利な針を装着した50 µLのハミルトンガラスシリンジを使用し、胎児に接触しないよう、胎児の口に近い位置から嚢内に針を挿入し、羊水中に30 µLの溶液を注入します。すべての胎児への注入が完了した後、子宮を腹腔内に戻し、5-0 Vicryl縫合糸を用いて腹壁と皮膚を縫合します。胎児への処置から36時間後、母体をつ止後、帝王切開により胎児を摘出し、心拍の有無、皮膚のピンク色、および自発的な動きを確認して生存能を評価します。呼吸と酸素摂取を促進するため、仔を酸素供給源の近くに配置します。次に、仔マウスの尾の付け根にマーキングを行います。中国墨を用いて、手術を施した胎児を安楽死させ、肺を解剖して、注入していない対照群の肺と比較して肺内に可視的な染料が存在するかを肉眼的に評価することで、注入が成功したかを確認できます。その後、生存基準を満たす残りの仔マウスをカバーで覆います。生後1日の幼仔がいる養親の糞尿を含む敷材を準備し、幼仔を養親の巣に一緒に配置します。養親の巣にいる幼仔の総数が10匹を超えないようにしてください。その後、ケージを静かで妨害のない環境に12時間置き、養親による育成の生存率を評価して、最適な容量を決定します。100 nanometerの赤色蛍光分子を10、20、および30 µLの量で注入することを経験的に選択しました。ここに、核染色を施した固定肺切片の共焦点画像を示します。胎児手術時に、注入液の過剰を示す逆流が検出されたのは30 µLの注入後のみでしたが、ここに示す相対蛍光強度の測定による定量化の結果、30 µLの注入で肺実質において最も高い蛍光信号が得られました。この注入により、IAルートと比較して、胎児の肺への蛍光スフェアの送達量が有意に高くなりました。IT（経気管）およびIA（経肺）投与を行った動物のいずれにおいても、胃腸管が陽性となりました。処理した胎児の他の組織および陰性対照動物では、赤色蛍光は観察されませんでした。注入後のウイルス導入効率を評価するため、生後1週目に、ニワトリβ-アクチンプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼを発現するENCコーティングRAAVベクターを用いてITおよびIA投与を行いました。IT群の総光子束は、IA群および陰性対照群よりも有意に高い値を示しました。IT注入が正しく行われたか否かを判別するため、磁気共鳴画像法（MRI）と生物発光イメージング（BLI）を組み合わせて実施し、ここに示すように、表面のBLI信号とMRIによる深部解剖学的構造の可視化を統合したオーバーレイ画像を取得しました。生後1週時点で、BLイメージングにより頸部および胸部領域から発せられる信号が確認されました。MRIとBLIの共登録により、正しく注射が行われた場合は肺領域に、誤った注射が行われた場合は頸部および腹部にルシフェラーゼ遺伝子の発現が認められました。ex gal染色による組織学的解析により、in vivoでの共登録が確認されました。一連の手順を習得すれば、母動物の切開から閉鎖まで、心腔内注射の全工程を30分以内に完了させることができます。手術時間を短縮することで、胎児の生存率が高まり、出生後に研究可能な動物数を増やすことができます。

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このビデオでは、実験薬を左右の遠位肺に選択的に投与する気管支内アプローチについて説明しています。注目のプロトコルでは、ブレオマイシンをマウスに気管支内投与して、肺線維症のより良いモデルを取得します。...

気管支内送達:実験薬を選択的にマウスの肺に投与する技術

出典: Venuprasad、K.、 et al。気道炎症を研究するためのマウスモデルにおけるイン フルエンザ菌 の気管内投与。 J. Vis. 経験。...

マウスモデルにおける気管内細菌送達の実施

このビデオは、妊娠中のマウスのマウス胎児の経子宮気管閉塞手順を示しています。このモデルは、閉塞した気管が肺の発達に与える影響を研究するために使用できます。...

マウスモデルにおける経子宮胎児気管閉塞のモデリング:妊娠中のマウス内の胎児気管の結紮のための外科的処置

私たちは、2.0ミリメートルの鏡と耳鏡を使用して直接喉頭鏡検査を介したマウスでは、気管内挿管のための、シンプルな信頼性が高く、比較的安価な方法を開発した。この技術は、非外傷性であり、慢性の実験において反復測定のために使用することができる。私たちは、優れた気管切開または以前に非外科的手法を報告したために見つける。...

マウスの気管内挿管<em&gt;経由</emオトスコープの使用&gt;直接喉頭鏡検査

ヒトにおける肺疾患の状態を模倣するモデルの使用は、特定の疾患の病態および/または病因を研究するため、および治療的介入を開発するために重要である。ここで直接マウス肺への外因性材料を提供することができ、非侵襲的気管内挿管法が提示されている。...

マウス肺の病理生理学を研究するための非侵襲的気管内挿管

この記事では、挿管を経由して、マウスの気管に直接ブレオマイシンを投与するための迅速かつ簡単な方法を提示します。この方法の主な利点は、習得が容易で、それは非常に再現可能であることであり、特殊な装置または長い回復時間を必要としません。...

マウスの気管の迅速な挿管のための改善された方法

マウスにおける実験剤の気管内(IT)投与は、しばしば遠位肺への非対称的な送達をもたらす。 本報告では、生きているマウスの各肺を非手術的にカニューレする直接気管支内(IB)アプローチについて述べた。...

マウス肺内の選択的剤沈着を改善するための直接気管支内投与

新生児げっ歯類の気管に直接薬物を点滴するこの技術は、局所投与された薬物または生物学的製剤が新生児肺疾患に及ぼす影響を研究する上で重要である。さらに、この方法は、動物モデルにおける肺損傷を誘発するためにも使用され得る。...

肺疾患を治療するための新生児げっ歯類における薬物の気管内点滴のための低侵襲方法

先天性横隔膜ヘルニアおよび胎児気管閉塞の様々な動物モデルは、倫理的問題、コスト、外科的困難、大きさ、生存率、および遺伝的ツールの入手可能性に関する長所と短所を提示する。このモデルは気管閉塞および上昇した発光圧力が肺の発達に及ぼす影響を調べるための新しいツールを提供する。...

マウスにおける胎児の気管咬合モデル

ここでは、非侵襲的中咽頭気管内挿管 を介した 気管内リポ多糖(LPS)送達のプロトコルを提案します。この方法は、動物の外科的処置の外傷を最小限に抑え、LPSを気管、次に肺に正確に送達します。...

マウスにおける非侵襲的気管内リポ多糖点滴

このプロトコルは、マウスを最適に配置し、カメラベースの耳鏡を経経口的に挿入することで、声門の視覚化、組織の外傷を最小限に抑えた迅速な挿管、および肺への一貫した液体の送達を可能にする方法を示しています。...

マウス肺への液体送達の方法論の改善:消費者向け耳鏡を使用した挿管

学ぶ 胎児マウスの気管内投与法。子宮切開と頸部切開で気管を可視化し、蛍光ビーズやウイルスベクターを直接注入することで、羊水内投与よりも効率的に胎児肺へ薬剤を送達できる新規手術アプローチです。

胎児のマウスモデルにおける生物活性剤の気管内投与のための新しい手術アプローチ

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