吸引脂肪から採取した脂肪由来間質細胞を使用したクリティカル·サイズの頭蓋冠欠損モデルの修復

この手順の全体的な目的は、マウスの生体内（in vivo）頭蓋骨欠損モデルを用いて骨分化を誘導するために、脂肪組織から多能性間葉系幹細胞を回収することです。まず、脂肪吸引処置後に得られる脂肪組織の血管間質画分から前駆細胞を単離します。次に、三次元的なバックボーンを調製し、そのスキャフォールド上に細胞を播種します。

最終ステップは、ラットモデルにクリティカルサイズの頭蓋欠損を作成し、そこにスキャフォールドと細胞を配置することです。最終的に、脂肪組織から単離した多能性間葉系幹細胞が、in vivo で骨再生能を有することが示されました。骨再生に利用可能な組織が不足しているため、この技術の応用範囲は臨床的に非常に広範です。

自家骨移植はゴールドスタンダードである一方、採取部位の不足や採取部位における合併症がこの選択肢の制限となっている。同種移植や外来材料も使用可能だが、コスト、統合性の低さ、および感染のリスクが制限要因となる。

骨組織工学のための前駆細胞の単離に、脂肪組織を利用できる可能性は非常に画期的です。本手順の実演は、私とlong anchor laboratoryのMichael Chungが行います。まず、選択的脂肪吸引術からヒト皮下脂肪組織を入手します。

脂肪吸引液における2つの層に注目してください。上澄み液には、処理された細胞物質の大部分が含まれています。下層は主に注入された生理食塩水です。

脂肪由来間葉系幹細胞はどちらの層からも回収可能ですが、上清からの収量の方がはるかに多くなります。ストローマ血管分画（SVF）を単離するには、脂肪吸引液を、2.5% Betadineを含む1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）と同量で十分に洗浄し、続いてBetadineを含まない1×PBSと同量で吸引洗浄します。その後、洗浄液を沈殿させます。

処理済みのヒト組織による汚染を防ぐため、プロセス全体を通して無菌操作を徹底してください。次に、各洗浄後に底層を吸引して廃棄します。その後、15 millilitersの脂肪組織を50 milliliterのFalconコニカルチューブに移します。そして、0.075%のフィルター済み溶液15 milliliterで脂肪組織を消化します。

Hank平衡塩溶液（HBSS）中で、タイプ2コラゲナーゼを加え、恒温水槽にて37°Cで60分間、絶えず撹拌しながら反応させます。その際、15分ごとにチューブ内の換気を必ず行ってください。その後、10%胎児牛血清（FBS）含有PBS 15 mLを加えて酵素活性を中和し、遠心分離を行います。これにより高密度のSVFペレットが得られ、このペレットは脂肪由来幹細胞と赤血球の混合物となります。

まず上層の脂肪層を除去し、次にペレットを乱さないように上清液を除去します。ペレットを10 millilitersの標準的な増殖培地で再懸濁します。その後、3本のチューブの中身を100 micronフィルターを通して1本の清潔な50 milliliterコニカルチューブにまとめ、遠心分離を行います。

ペレットを崩さないように上清を除去し、その後ペレットを再懸濁します。従来の増殖培地 5 mL を使用し、10 cm プレート 1 枚につき 50 mL コニカルチューブ 2 本、または 15 cm プレート 1 枚につき 5 mL コニカルチューブ 5 本に分配します。37 °C、21% oxygen、5% carbon dioxide の条件下で、一晩静置して一次培養を行います。

一晩インキュベートした後、プレートをPBSで洗浄し、付着しなかった赤血球の残渣を除去します。得られた細胞集団が脂肪由来間葉系幹細胞です。自然分化を防ぐため、細胞はサブコンフルエントな状態で維持してください。

37 °C、21% oxygen、および 5% carbon dioxideの条件下で培養します。増殖培地において、細胞は通常3〜4日ごとに通常の増殖培地で継代する必要があります。50% confluenceで播種した際、付属の原稿に従ってスキャフォールドを調製します。

細胞がサブコンフルエントの状態に達したら、PBSで2回洗浄し、トリプシン処理を行います。細胞数をカウントして定量します。播種にあたり、あらかじめカットした直径4 mmのスキャフォールドに1.5×10⁵個の細胞を播種する準備をしてください。

96ウェルプレートの1ウェルに個別のスキャフォールドを配置し、細胞を通常増殖培地で再懸濁します。このときの濃度は約1.5 × 10⁵ cells / 20 µLとします。この溶液20 µLをスキャフォールドに直接ピペッティングして細胞を播種し、細胞培養インキュベーター内に30分間置きます。

30分後、200 µLの培地を加え、細胞をスキャフォールド上で一晩インキュベートします。手術前に、播種時のような細胞のスキャフォールドへの接着を確認する必要はありません。十分な数の細胞を播種すれば、その大部分がスキャフォールドに接着します。

生後60日の成体CD-1ヌードマウスを麻酔した後、手術部位をベタジンとアルコールで3回滅菌し、マウスの眼球に潤滑剤を塗布します。次に、マウスの頭皮に正中矢状切開を加え、右側頭頂骨を露出させます。鈍的な掻爬により、右側頭頂骨から骨膜を除去します。

次に、右側の縫合線に関連しない頭頂骨に、直径4 mmの片側全層欠損を作成します。マウスの頭蓋骨の厚さは移植前で0.3 mm未満であるため、ダイヤモンドコーティングされたタインドリルビットを使用し、下層の硬膜を傷つけないよう細心の注意を払ってください。培地由来の成長因子の移行を防ぐため、スキャフォールドを滅菌PBSで洗浄します。

欠損部にスキャフォールドを配置します。最後に、皮膚を縫合し、確立された術後プロトコルに従って動物を観察します。マウスにmicro CTを行い、microviewソフトウェアを用いて3D再構成画像を取得します。

Adobe Photoshopを使用して、画像の高さを標準的なサイズに調整します。通常、頭蓋骨再生の測定は2週間ごとに行います。長期的な経過観察のためのスキャン中、マウスは麻酔状態で保持され、最終的に安楽死させます。

組織学的解析では、マジックワンド機能を用いて頭蓋欠損部のピクセル数を測定します。その後のCTスキャンにより、欠損部の治癒率を決定します。頭蓋欠損部の面積を測定してピクセル数を算出し、それを元の欠損部のピクセル数で除します。欠損範囲に沿って複数の切片を作成し、アニリンブルーやピンナローズなどの組織学的染色を用いて骨形成を確認します。

Adobe Photoshopを使用して、頭蓋骨欠損部以外のすべての領域を切り取り、マジックツールを用いて欠損領域における新生骨形成のピクセル数を算出し、これを対照群または他の変数と比較します。ここに、脂肪由来間葉系幹細胞（ASC）の単離から、その増殖、分化、そしてin vitroおよびin vivoでの利用に至るまでの、脂肪吸引物の採取と応用の概要を示します。最下段には、ヒドロキシアパタイトスキャホールドを介してASCを適用した際の、臨界サイズ頭蓋骨欠損のin vivo治癒を示すマイクロCT画像が表示されています。

上段に示されているコントロールには、スキャフォールドなしおよび欠損が含まれます。中段は、細胞を含まないスキャフォールドを配置した欠損を示しています。ここに示されているLSはmicro CTによる骨治癒の定量化であり、A SC群で治癒が有意に促進されていることがわかります。

これは、andalによるA SC群の骨形成の促進を示す組織像です。青色はalのAROM染色を示しています。青色の部分において、osteoidはpen aromで濃い青色に染色されています。

ここに示す黄色に染色された類骨は、GFPで標識し、スキャフォールドに播種して2週間後に採取したヒトASCです。欠損部位における再生へのヒト細胞の寄与を示すため、GFP標識抗体を用いて染色を行いました。また、2週間後の欠損部位においてヒト細胞が優勢であることを示す、ヒト核抗原の免疫組織化学染色結果をここに示します。

習熟すれば、脂肪組織の処理は4時間以内に完了でき、手術手順はマウス1匹あたり約10分で終えることができます。頭頂骨は円形であるのに対し、ドリルは平らであるため、4 mmの欠損部の全周を確実に穿孔させるよう注意することが重要です。脳の硬膜を損傷させないよう、ゆっくりと慎重に作業してください。

このビデオを視聴することで、脂肪組織から前駆細胞を単離する方法について十分に理解することができます。これらの細胞をスキャフォールドに播種し、マウスに移植します。