Name: Biofabricationとバイオエレクトロニック·インタフェースをブリッジする (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 38 s
Description: 学ぶバイオファブリケーション技術で、pH応答性多糖類とバイアス電極を用いて生体適合性薄膜を電気的に析出し、タンパク質や細胞で機能化する方法。ラボオンチップ応用における生体電子インターフェース構築に活用できます。

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我々は、基礎となる研究の部分的なサポートについては、この原稿のサポートのためにとONR、DTRA、およびNSFからDTRAからの資金調達を認める。

<ol><li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+generation+of+pH+gradients+in+microfluidic+devices+for+biofabrication+of+freestanding%2C+semi-permeable+chitosan+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes.</a> Lab Chip. 10, 59-65 (2010).</li>
<li>Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Activated+Ionic+Gelation+of+Common+Biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers.</a> Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).</li>
<li>Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+capture+on+patterned+surfaces+coated+with+amphiphilic+biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers.</a> Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+to+build+the+biology-device+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Biofabrication to build the biology-device interface.</a> Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).</li>
<li>Yang, X., Shi, X. -W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+Enzymatic+Reactions+for+the+Assembly+of+Proteins+at+Electrode+Addresses%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses.</a> Langmuir. 25, 338-344 (2008).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+quantitative+visualization+and+characterization+of+chitosan+electrodeposition+with+paired+sidewall+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes.</a> Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+anodic+electrodeposition+of+calcium+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate.</a> Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).</li>
<li>Wu, L. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+Selective+Deposition+of+a+Reactive+Polysaccharide+Layer+onto+a+Patterned+Template%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template.</a> Langmuir. 19, 519-524 (2003).</li>
<li>Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+of+antibodies+and+antigens+via+IgG-binding+domain+engineered+with+activatable+pentatyrosine+pro-tag.+Biotechnol%5BTitle%5D)+AND+%22bioeng%22%5BJournal%5D)">Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol.</a> bioeng. , 103-231 (2009).</li>
<li>Shi, X. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagentless+Protein+Assembly+Triggered+by+Localized+Electrical+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals.</a> Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).</li>
<li>Shi, X. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroaddressing+of+Cell+Populations+by+Co-Deposition+with+Calcium+Alginate+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels.</a> Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).</li>
<li>de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+based+microcapsules+for+immunoisolation+of+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells.</a> Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).</li>
<li>Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chitin+and+chitosan+nanofibers+and+their+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications.</a> Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).</li>
<li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroaddressing+Functionalized+Polysaccharides+as+Model+Biofilms+for+Interrogating+Cell+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling.</a> Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).</li>
<li>Meyer, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan-coated+wires%3A+conferring+electrical+properties+to+chitosan+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers.</a> Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).</li>
<li>Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -C., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+biological+nanofactories+trigger+quorum+sensing+response+in+targeted+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria.</a> Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).</li>
<li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofabrication+with+chitosan%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biofabrication with chitosan.</a> Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).</li>
<li>Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiba+Benjamin%2C+D+%22Renewable+and+Sustainable+Polymers%22">Renewable and Sustainable Polymers</a>. 1063, American Chemical Society. 61-71 (2011).</li>
<li>Koev, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%3A+an+integrative+biomaterial+for+lab-on-a-chip+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices.</a> Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).</li>
<li>Luo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+assembly+of+a+metabolic+pathway+enzyme+in+a+pre-packaged+reusable+bioMEMS+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device.</a> Lab Chip. 8, 420-430 (2008).</li>
<li>Spinks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+%22dual+mode%22+actuation+in+chitosan%2Fpolyaniline%2Fcarbon+nanotube+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor+Actuat+B-Chem%22%5BJournal%5D)">A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers.</a> Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).</li>
<li>Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+assembly+of+genetically+modified+viral+nanotemplates+via+nucleic+acid+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization.</a> Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).</li>
<li>Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-cycling+and+H2O2+generation+by+fabricated+catecholic+films+in+the+absence+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes.</a> Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).</li>
<li>Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+transdermal+delivery+of+model+drug+compounds+by+MEMS+microneedle+array%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array.</a> Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).</li>
<li>Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microbial+biosensor+based+on+bacterial+cells+immobilized+on+chitosan+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix.</a> Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).</li>
<li>Selimoglu, S. M., Elibol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+as+an+immobilization+material+for+MAb+production+via+encapsulated+hybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells.</a> Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).</li>
<li>Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentle+cell+trapping+and+release+on+a+microfluidic+chip+by+in+situ+alginate+hydrogel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation.</a> Lab Chip. 5, 553-559 (2005).</li>
<li>Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-Film+Bioprocessing+and+Immunoanalysis+with+Electroaddressable+Stimuli-Responsive+Polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides.</a> Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).</li>
<li>Cheong, M., Zhitomirsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrodeposition+of+alginic+acid+and+composite+films%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface+A%22%5BJournal%5D)">Electrodeposition of alginic acid and composite films.</a> Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).</li>
<li>Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+induction+of+recombinant+proteins+by+minimally+rewiring+native+quorum+sensing+regulon+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli.</a> Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).</li>
</ol>

この記事への生産とフリーアクセスは、米国の国防脅威削減局が主催しています。

私たちの手順では、高分子膜の電着と官能、biofabrication我々は長期的なプロセスを示しています。細胞や生体分子の機能化を通して、私たちはお互いに、それらが上に組み立てられる電極のアドレスと相互作用することができる生物学的な表面を作成します。最初のステップは、電着は、電気信号​​に応答して、我々の研究では生体高分子、アルギン酸塩、キトサンのトリガ自己組織化を介して行われます。述べたように、以前のpH勾配は6,17フィルムの寸法と特性を詳細に制御を提供し、電流密度と成膜時間で制御することができる生成されます。我々は電流密度の多様性と堆積時間の組み合わせは表1に示した電極に使用することができることを発見した。他の電極の使用は可能ですが、プロシージャへの調整が必要であろう。膜形成の他の技術electrodeposiのプロセスと比較してるには、単純、迅速かつ反応試薬である。高価な装置と骨の折れる準備の豊富なレパートリーの必要はありません。重要なのは、プロセスでは、マイナーな実験的な偏差を耐えることができ、問題が発生した場合、簡単に上を開始することができます。 キトサンは、第一級アミンの含有量が高いことによって、それに付与される重要な機能的特性に起因する高い陰極のpH勾配に応答することができます。高いpH（〜6.3のそのpKaがより大きい）で、アミンが脱プロトン化とキトサンは膜形成が可能になり、不溶化されています。堆積後、フィルムが電極に接続されたままになります。しかし、能力は必要に応じてそれらを剥離するために存在します。フィルムは、溶液のpHがpKa値を下回らない限り、安定したままになります。酸性溶液は、アミンをプロトン化し、それが18を溶解するまで、後続の静電反発は、ゲルを膨潤させる。つまり、組立/分解プロセスでは、需要と同種で可逆的である蒸着膜と電極の再利用を除去するためのWS。好都合なことに、ゾル - ゲル転移が行われるのpHの範囲は、ほとんどの生物学的なコンポーネントが最適に機能しているに近いです。これは、アセンブリ6時の機能の保持のためのプロセスが理想的です。 アルギン酸膜の形成は、水の陽極電解と同様に炭酸カルシウム7の存在によって促進される。アノードではローカライズされた低pHは、リリースカルシウムカチオンにつながる炭酸カルシウムを溶解。これらのイオンは電極表面上に架橋ネットワークを形成し、アルギン酸塩でキレートされています。アルギン酸塩フィルムは、基礎となる電極の再利用を可能にし、フィルムを溶解するために使用することができるようにクエン酸やEDTAなどの他のキレート化合物からのカルシウムイオンの競合により、特に可逆的である。カルシウムイオンが容易に秒であるため、このように、アルギン酸塩フィルムは、生理学的条件にさらされたとき比較的脆いその構造を弱体化、フィルム剥離や再溶解を促進し、ゲルマトリックスからcavenged。この制限を克服するために、我々はゲルを強化するため、1 M CaCl 2でのフィルムのためのインキュベーションステップが含まれている。さらに、我々は映画の培養液（細胞培地など）は、500μM-3 mMの濃度でCaCl 2を補足することをお勧めします。 番目の主要な手順は、関連する生物学的成分と堆積膜の機能化である。これには二つの方法は、最初である電気化学的接合、卓越した空間的制御10のタンパク質の迅速、反応試薬アセンブリを可能にする戦略で達成することができます。しかし、このように官能は、Clの拡散によって制限されます-電極に膜を介してイオンだけでなく、HOClの拡散、溶液中に戻って生成された反応性中間体、アウト。渡すための電気化学的に活性な分子の能力膜を介して読みやすい電気信号15に化学的および生物学的シグナルの伝達を可能にします。我々は、共有AI-2酵素を取り付けることによって実証し、キトサンの酵素機能化のために第二の戦略​​としてチロシナーゼを介したカップリングを示している。チロシンタグ9を含む蛋白質で差別的役割を果たし、特定の試薬 ​​、チロシナーゼに依存-この戦略は、官能化プロセスが制御され、選択にすることができます。 我々は、チップ上に自然な経路を複製することによって、マルチアドレスシステムの有用性と生体適合性を示しています。まず、異なるアドレスで2つの細胞集団（すなわち、 &quot;送信者&quot;と &quot;受信機&quot;）を組織し、彼らはAI-2を提供し、蛍光応答を生成するために、隣接する電極間に相互作用することを示した。この概念はまた、チェンらによって実証されています。マイクロ流体チップ14インチまた、相互作用を模倣するのではなく、使用配信のためにAI-2を合成する酵素。このように、合成細胞内経路、AI-2の合成に、biofabrication介してレプリケートして、溶液中と同じように非常に機能した。 両方のケースでは、複数のアドレスのアセンブリは、それぞれの堆積溶液が電着が1つだけのアドレスで意図されているにもかかわらず、全体の電極アレイを導入する必要があるため、アドレスの間の非特異的結合を回避するための課題となっています。穏やかな、まだ徹底した洗浄では、非バイアス電極からの残液の大部分を削除することができます。マイクロチャネル内の流れの使用は、さらに非特異性を最小限に抑えることができます。特にキトサンとアルギン酸アドレスの隣接biofabricationために、我々は、アルギン酸塩を電着、最初のキトサン膜を堆積biofunctionalizationの手順でこれを後にし、この後をお勧めします。私たちはそうここに行っていないが、我々は、ミルのような不活性蛋白質（キトサンフィルムを阻止することを見出したK、BSAなど）が大幅にキトサンのアミノ表面に不要な分子の非特異的結合を減少させる。 我々は、細胞や生体分子の複雑な配置のための &quot;青写真&quot;として、多くの場合、バイオMEMSデバイスに見られるパターン化電極を、確立するユーティリティを発見した。バイオMEMSデバイスにキトサンを電着の用途はよく19ここで説明した例を越えて行くことができます。このようなマイクロおよび非平面20,15上と-キトサンは、様々なマイクロジオメトリ上に堆積することができます。フィルムはまた、他のポリマーとの様々な蛋白質、DNA、ナノ粒子、および新規のプロパティ21,22,23ためのレドックス活性分子を変更することができます。バイオMEMSデバイスでは、キトサンフィルムは、薬物送達、レドックスおよび小分子の検出、生体触媒、およびセルの研究20,23,24,25に使用されています。同様に、アルギン酸塩は、広く細胞封入マトリックスとして使用されているとの可逆的流体封じ込めのために検討されている細胞集団との膜免疫分析26,27,28。組織工学アプリケーション用の複合フィルムは、そのような整形外科用インプラント29ハイドロキシアパタイトと同様に、コンポーネントを使用して、アルギン酸電を用いて作製されています。 biofabricationの我々のデモでは、生体成分の間に、バイオ、電子インタフェースを介して相互作用の両方が等しく適用可能であることが示されているが、これはオンチップの信号伝送で洗練されたパフォーマンスを得るために相互作用のすべての品種を統合するための見通しを達するにもたらします。したがって、biofabricationフォローオンとしてしばしばコンシューマエレクトロニクスによって動機づけられて微細加工の急速な発展に直接に低減 &quot;最小特徴サイズ&quot;でデバイスの製造を容易にすることができる。つまり、次の次世代デバイスは、実際にはさらに小さい長さSCAにおける自然の絶妙な組み立ておよび認識機能を提供する不安定な生体成分が含まれる場合があります人工システムに比べてレ。我々は、分析機器、環境センサー、さらには生体適合性植込み型デバイスの短期的なアプリケーションを想定。

<table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネントの名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>パワーサプライ</td><td>ケースレー</td><td>ソースメータ2400 </td></tr><tr><td> 3電極ポテンショスタット</td><td> CHインスツルメンツ</td><td>ポテンシオスタット/ガルバノスタット600D </td></tr><tr><td>フレキシブルコネクタ付きRE-5B Ag / AgCl参照電極</td><td>バシ</td><td> MF-2052 </td></tr><tr><td>ゴールドコーティングされたシリコンウェハ、500umのSi、12nmのCrを、120nMのAu、絶縁用のSiO 2 </td><td>カスタム製作</td><td></td></tr><tr><td>インジウムスズ酸化物被覆ガラススライド、長方形、8から12オーム抵抗する</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 578274 </td></tr><tr><td>プラチナシート/箔（0.002） </td><td> SurepureのChemetals </td><td> 1897 </td></tr><tr><td>スリムライン2 &quot;アリゲーター·クリップ</td><td>ラジオシャック</td><td> 270から346 </td></tr> &lt;TR&gt; <td>マルチスタッキングバナナプラグパッチコード</td><td> TSElectronic </td><td> B-36から02 B-24から02 </td></tr><tr><td> SYLGARD 184シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td> NC9020938 フィッシャーから</td></tr><tr><td> Fluorescecenceの実体顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> MVX10 MacroView </td></tr><tr><td> cellSens標準</td><td>オリンポス</td><td>バージョン1.3 </td></tr></tbody></table> 表1電と蛍光可視化装置。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>キトサン、中分子量</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 448877 </td></tr><tr><td>塩酸、ARISTAR。 ACS、NF、FCCグレード</td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム、ソリューション。 10.00N </td><td>VWR </td><td> VW3247 </td></tr><tr><td>アルギン酸、ナトリウム塩</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 180947 </td></tr><tr><td> Multifex-MMは、沈殿 炭酸カルシウム、70nmの粒子</td><td>特殊 ミネラル株式会社</td><td> 100-3630-3 </td></tr></tbody></table> 表2。キトサンとアルギン酸塩溶液試薬。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td> JTベーカー</td><td> 0504 </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム、認定 結晶ACS </td><td>フィッシャー 科学的な</td><td> S271 </td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム、無水</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P9791 </td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基、無水</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P3786 </td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td> P4417 </td></tr></tbody></table> 表3その他のソリューションコンポーネントとバッファ試薬。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社/ソース </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> アスペルギルスニジェールからのグルコースオキシダーゼ</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G2133 </td></tr><tr><td>キノコからのチロシナーゼ</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> T3824 </td></tr><tr><td> LBブロス、ミラー（粒状） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP9723-2 </td></tr><tr><td> &quot;AI2-シンターゼ&quot;（HGLPT） </td><td>ラボ株式16 </td><td></td></tr><tr><td> W3110野生型細胞</td><td>ラボ株式30 </td><td></td></tr><tr><td> MDAI2 + pCT6-LSRR - AMP R + PET- <eM&gt; DsRedを- 館 r細胞</td><td>ラボ株式30 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光粒子：1μmの直径、EX / EM：515分の505 </td><td>インビトロジェン</td><td> F8765 </td></tr><tr><td> 5 - （および6） - カルボキシ6Gスクシンイミジルエステル、EX / EM：560分の525 </td><td>インビトロジェン</td><td> C-6157 </td></tr><tr><td> DyLight抗体ラベリングキット、405 </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> PI-53020 </td></tr></tbody></table> 表4。酵素、細胞、および他の官能試薬。

biofabricationとバイオエレクトロニック·インタフェースをブリッジする

Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

低コスト、優れた感度、移植性、および高いスループットによる研究と医学の両方を変革するためのラボオンチップ技術の約束の進歩。生物学的微小電気機械システム（バイオMEMS）の上に生体成分の混入は、これらの目標を達成するための大きな可能性を示している。微細加工、電子チップは、マイクロメートルスケールでの機能に加えて、センシングおよびアクチュエーションのための電気的接続を可能にします。機能的な生物学的なコンポーネントは、システムの測定対象化合物、酵素の機能、および全細胞機能の特異的検出のための能力を与える。標準的な微細加工プロセスとバイオ分析技術が正常に、それぞれのコンピュータと生物学的な産業における数十年にわたって利用されている。ラボオンチップ環境でそれらの組み合わせとのインタフェースは、しかし、など新たな課題をもたらします。電極と生物学的compon間のインタフェースを構築できる技術のための呼び出しがあります穏やかで、作製したパターンが容易であるENT。 Biofabricationは、ここで説明され、有効になっているオンチップ機能に汎用性を備えた生体成分のその、簡単に組み立てるの取り込みのために偉大な約束を示しているそのようなアプローチである。 Biofabricationは、ボトムアップの階層的なアセンブリに生物学的物質および生物学的メカニズム（自己組織化、酵素のアセンブリ）を使用します。私たちのラボは多くのフォーマット1,2,3にこれらの概念を実証しているが、ここでは、シグナル·ベースの相互作用の複数のアプリケーションに続いて電着に基づいて、組立工程を示しています。組立工程は、電極及びそのようなDNA、酵素、または4,5 -生きている細胞などの生体成分とのその後の官能基に生体適合性の刺激応答性高分子膜の電着で構成されています。電着は、電解からバイアス電極の表面で作成されたpH勾配を利用しています、水6,7の。キトサンおよびアルギン酸塩は、8課した電気信号に応答して、ハイドロゲルフィルムに自己集合するようにトリガーすることができる刺激応答性の生物学的ポリマーである。これらのハイドロゲルの厚さは、pH勾配が電極から延びるする程度によって決定されます。これは、様々な電流密度と堆積時間6,7を使用して変更できます。このプロトコルは、キトサンフィルムは共有結合酵素的または電気化学的方法9,10のいずれかを介してフィルム上に存在する豊富な第一級アミン基に生体成分を付加することによって堆積し、官能化され方法について説明します。アルギン酸塩フィルムと生細胞のそれらの捕捉も11を対処されることになります。最後に、biofabricationのユーティリティは、化学 - 電気、細胞から細胞へ、また酵素の細胞信号伝送を含む信号ベースの相互作用の例を通じて実証されています。 両方の電と官能基は、試薬を必要とせずに近い生理的条件下で行うため、過酷な条件から不安定な生体成分を割くことができます。さらに、キトサン、アルギン酸塩の両方が長い生物学的に関連の目的で12,13のために使用されている。全体として、biofabrication、単にベンチ上で実行することができます急速な技術は、電極上に機能的な生体成分のミクロンスケールのパターンを作成するために使用することができ、ラボ·オン·チップのさまざまなアプリケーションに使用することができます。

細胞やタンパク質と機能化することができる生体適合性フィルムを作成するためのバイアス電極の存在下で刺激応答性多糖類の沈着：この資料では、biofabricationアプローチを説明しています。我々は、ラボ·オン·チップ·アプリケーション用の対話biofunctionalizedサーフェスを作成するためのフィルムだけでなく、その基本的な用途を生成するためのベンチトップ型の戦略を示しています。

Biofabricationとバイオエレクトロニック·インタフェースをブリッジする

ラボオンチップ技術の進歩は、低コスト化、感度の向上、ポータブル化、そして...を通じて、研究と医療の両方に革命をもたらすと期待されています。

本実験の全体的な目的は、生体高分子フィルムを電気的に堆積させ、タンパク質や細胞などの生物学的成分で機能化することです。電気堆積は、pH応答性多糖類溶液を用い、バイアスをかけた電極で局所的に発生するpH変化を利用して達成されます。カソードまたはアノードの堆積戦略を選択し、電極にバイアスをかけることでゾル-ゲル転移を誘発し、電極形状によって定義されたパターンを持つ薄膜を形成させます。さらに、電極堆積プロセス全体を通じて、タンパク質や細胞などの生物学的成分を導入することが可能です。フィルムの生物学的機能化に関して、蛍光イメージングに基づき、生物学的成分がフィルム上に局在していることを示す結果が得られています。加えて、酵素活性の電気化学的検出およびレポーター細胞応答の使用により、これらの成分が機能的に動作し、周囲の環境と相互作用できることが実証されています。バイオファブリケーションは、生物学とエレクトロニクスのインターフェースを構築するための斬新なツールボックスを提供します。その主な利点は、簡便であることと、生理的条件に近い状態で組み立てが可能であることにあると考えられます。生物学は、自己組織化や酵素的手段を通じてナノスケールでの作製に長けています。これらの能力を利用することで、他の組み立て技術で用いられる複雑で危険かつ時間のかかる合成方法を回避することができます。共同研究チームは、キタン（kitan）が電極析出可能であることを確認した際、生物学的材料とメカニズムを用いてBioDデバイスインターフェースを構築するというアイデアを得ました。キタンはpH応答性のフィルム形成多糖類であり、デバイスによって印加された電気信号を認識して薄膜として析出することができます。キタンが電極析出可能であることが分かったことで、生化学および分子生物学のより幅広いツール群を利用してBioDデバイスインターフェースを構築できることに気づきました。このような手法の応用は、電極上に機能的な生物学的コンポーネントを生存させたまま配置するための安価で簡便な方法を提供するため、ラボオンチップの設定にまで及びます。バイオファブリケート膜は繊細で損傷しやすいため、この手法の視覚的な実演が極めて重要です。したがって、膜の洗浄や撮影を行う際は、強い刺激を与えないよう注意する必要があります。膜は乱れやすい可能性があります。しかし、利点として、膜を容易に除去できるため、電極を再利用することが可能です。本プロトコルを開始するには、ワニ口クリップを用いてパッチコード経由でカスタム製作した電極に電源を接続してください。酸化インジウムスズ（ITO）コーティングガラススライドをアノード（作用電極）とし、白金箔をカソード（対極）として使用します。ITO表面を機能化させるため、ITO表面が対極と向かい合うように電極を配置してください。この際、ITO表面を溶液に浸すために垂直に配置するか、表面に溶液を保持できるように水平に配置します。次に、1%アルギン酸と0.5%炭酸カルシウムを蒸留水に混合し、オートクレーブで滅菌してアルギン酸堆積溶液を調製します。その後、Fluor spheresを混合し、ボルテックスで攪拌してアルギン酸を蛍光標識します。これにより、得られたフィルムの蛍光イメージングが可能になります。オートクレーブ後、調製した堆積溶液に両電極を浸し、3 A/m²の一定電流密度を2分間印加します。電圧は2〜3 Vの範囲で変動します。2分後、電極を切り離し、堆積していない溶液を除去します。塩化ナトリウムでフィルムを軽くすすぎ、余分なアルギン酸を除去してください。ゲルの強度を高めるため、フィルムを0.1 molar 塩化カルシウム中で短時間インキュベートします。その後、フィルムを任意の保存溶液中でインキュベートします。共析出を行う前に、蛍光顕微鏡を用いてフィルムのイメージングを行ってください。このビデオに付属する書面プロトコルの指示に従い、シグナル送信細胞の培養物とシグナル受信細胞の培養物を増殖させます。次に、アルギン酸と炭酸カルシウムの堆積溶液を調製します。この溶液を各細胞培養物と1:1の比率で混合し、最終濃度が1%アルギン酸および0.5%炭酸カルシウムとなり、細胞が培養密度の約半分に希釈されるようにします。ポリジメチルシランのウェルで囲まれた2本のITO電極がパターン形成されており、白金対極を備えたガラススライドを使用します。一方のITO電極と白金電極を電源に接続します。前述と同様に、受容細胞を含む堆積溶液に電極を浸します。電源を、電析が行われる単一電極によって定義される表面積に基づき、電流密度 3 A/m² の定電流に設定します。細胞をアルギン酸マトリックス中に共電析させるため、2分間電流を印加します。前述と同様にフィルムを塩化ナトリウムで洗浄し、対極の接続を隣接するITO電極に切り替えます。堆積手順を繰り返しますが、今回は送信細胞を含む溶液を導入します。共堆積させた細胞とカルシウムアルギネートを含む2電極チップを、リン酸緩衝生理食塩水中で37°Cにて一晩インキュベートします。10% LB培地および1 mM 塩化カルシウムを添加します。インキュベーション後、蛍光顕微鏡を用いてチップを撮影し、キトサン電極の電析を開始します。電源を電極に接続します。アリゲータークリップを接続します。金コーティングされたシリコンチップをカソードとし、白金箔をアノードとして使用します。前回と同様に、対極を堆積させるように金電極表面を配置します。Kato sand flakesを水に混ぜ、2 molar 塩化水素をゆっくりと加えて多糖類を溶解させ、Kato sand溶液を調製します。本文で参照されている手順に従い、Kato sand溶液を蛍光標識することで、蛍光顕微鏡により電極に堆積した膜をイメージングすることが可能です。次に、電極をKato sand溶液に入れ、堆積させたい領域を完全に浸します。作用電極の表面積に基づき、4 A/m²の電流密度で算出した一定電流を2分間印加します。この例では、4 mm²の金電極に16 µAの電流を印加します。電圧は2〜3 Vの範囲内で変動します。その後、電極を脱イオン水で洗浄して過剰なキトサンを除去してください。続いて、蛍光顕微鏡を用いてフィルムの撮像を行います。キトサンおよびグルコースオキシダーゼの溶液から、4 A/m²の電流密度でパターン化電極上に共電着させます。キトサン電極電着の手順に従い、グルコースオキシダーゼを封入したカイザン膜を作製します。処理した電極を作動電極として3電極系に接続し、対極に白金線、参照電極に塩化銀電極を用い、これらの電極を塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液に浸します。電着後、クロノポテンショメトリーを用いて60秒間一定電圧を印加し、タンパク質をカイザン膜に電気化学的に結合させます。チップをリン酸緩衝液に入れ、オービタルシェーカーで10分間洗浄して、未反応の塩化ナトリウムおよび未結合のグルコースオキシダーゼを除去します。3電極系を再度接続し、5 mMのグルコース溶液に浸します。その後、電位を正方向に0.7 Vまで掃引するように、サイクリックボルタンメトリーの所望のパラメータを設定します。電極をグルコース溶液から取り出し、リン酸緩衝液で洗浄します。次に、磁気攪拌機の上に置いた、8 mLのリン酸緩衝液を含む10 mLビーカーに電極を設置します。GOX修飾チップを0.6 Vに設定し、作用電極として使用します。希望のパラメータを設定した後、ベースラインの記録を収集します。バッファーにグルコース分注液を加え、1回につきグルコース濃度を4 millimolarずつ上昇させます。本実験では、80 millimolarのグルコース分注液を400 µLずつバッファーに添加します。得られた電流出力を各グルコース濃度と相関させます。タンパク質の機能化を行うための標準曲線を作成するには、A-P-D-M-S内に封入された、金電極とITO電極が隣接してパターン形成されたガラススライドを使用してください。既報の通り、金電極にカソード電位を印加し、チゼンを電析させます。皮膜を洗浄後、チロシナーゼを添加した青色蛍光標識 auto inducer two synthase 溶液を加えます。その後、室温で1時間インキュベートします。前と同様にフィルムをPBSで洗浄し、受容細胞を含むアルギネート電析溶液に浸したITO電極に陽極電位を印加します。その後、「アルギネート中への細胞集団の共電析」で概説した手順に従い、酵素的に伝達信号を生成させます。フィルムを洗浄した後、5 µMのSAHおよびPBSに10% LB培地と1 mMの溶液を添加します。塩化カルシウムで電極を覆い、溶液の蒸発を防いで37°Cで一晩インキュベートします。これにより、赤色蛍光タンパク質DS redを生成させることでレシーバー細胞の応答が可能になります。隣接する電極は、フィルターを調整して、inducer two synthaseの青色蛍光と、電気信号によって誘導されたレシーバー細胞が発現する赤色蛍光をキャプチャすることで、蛍光顕微鏡で観察できます。電気刺激により電極表面付近に局所的な微小環境を作り出すことができ、これらの刺激によって、アルギン酸やザンタンなどの多糖類の自己組織化を誘発し、電極表面にハイドロゲル膜として堆積させることができます。このゾル-ゲル転移は電極表面で起こるため、得られるフィルムは電極パターンに一致した形状で電気的にアドレス指定されます。アルギン酸を用いることで、独自の細胞集団を別々のアドレスに共堆積させることが可能です。送信側と受信側の細胞集団が相互作用することで、それらが電極アドレスに基づいていることが確認されます。オートインデューサー2分子は送信細胞から拡散し、受信細胞に取り込まれることで、DS red蛍光タンパク質の発現が誘導されます。ここでは、受信細胞が配置されている電極でのみ赤色蛍光が観察されます。対照的に、バイオセンシング酵素であるグルコースオキシダーゼは、酵素反応によって過酸化水素を生成し、それを電気化学的に酸化させて出力電流を得ることで、グルコースの検出を可能にします。このようにして、化学信号を電気信号へと変換することができます。このグラフは、Geo Xを化学的に結合させた膜が、Geo Xを含まない膜とは対照的に、グルコースの存在下で強いアンチ信号を生成することを示しています。これらの結果は、Geo Xが堆積させたzam膜上に組み立て可能であり、かつ触媒活性を保持していることを示しています。さらに、グルコース濃度の増加に応じて、オティック電流の段階的な増加が認められます。提示されている標準曲線は、添加したグルコース量に応じて、段階的な増加がほぼ線形に進行したことを示しています。これらの結果は、ここに描写されているように、酵素がRazzaフィルムへの接合後もその感度を保持していることを示しています。I two synthaseにはPenta tyrosineタグが含まれています。Tyrosinaseがチロシンタグに作用して、残基のフェノール基をo quinoneに酸化し、それがKazanのアミンに共有結合します。TyrosinaseによるI two synthaseのアセンブリを通じたKazanフィルムの機能化の証拠は、金上のKazaフィルムを示すこの蛍光画像で観察されます。ここでは、機能化されたI two synthaseが青色で蛍光標識されています。I two synthaseは、送信細胞と同様に基質SAHからI twoを生成するため、SAH存在下で共用された受信細胞に近接していると、受信細胞にdsを発現させることで蛍光応答を引き起こします。受容細胞の赤色蛍光は、aiの拡散によるアドレス間の相互作用を改めて実証しており、さらにtizenに固定化された10種類の酵素が、共有結合後も活性を保持していることを示しています。このビデオを視聴することで、多糖類フィルムの電気堆積方法と、さまざまな手法を用いたそれらの機能化方法について十分に理解することができたはずです。我々は、これらの機能化ステップの汎用性を実証しました。これにより、今後の試験において多種多様な生物学的コンポーネントを扱うことが可能になります。この手法を習得すれば、わずか数分で、生物学的成分を精密にグラフトできる明確なフィルムパターンを作成することが可能です。これにより、指定した電極上に生物学的にパターン化された活性表面を非常に容易に、かつ組織的に生成でき、同時に複雑な生物学的相互作用を実現させることができます。この手順に従い、電極アレイの設計と生物学的成分の選択に創意工夫を凝らすことで、意図した設計上の相互作用を達成することが可能です。バイオファブリケーションツールが、それぞれが私たちの生活に革命をもたらしてきたバイオテクノロジーとマイクロエレクトロニクスという2つの異なる分野を橋渡しすることが期待されます。これら2つの分野を融合させることで、社会が直面している極めて深刻な問題に対する新たな解決策を創出できると考えています。例えば、バイオファブリケーションによって、ポイントオブケアや疾患の診断、そして生物学的・化学的脅威の検知のための、簡便で汎用性の高い新しいセンシング手法が提供されることを想定しています。遠い将来の例を挙げれば、次世代のさらに先の動脈ステントは、動脈の開通性を維持するだけでなく、代謝プロファイルのモニタリングも可能になるかもしれません。

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