Biofabricationとバイオエレクトロニック·インタフェースをブリッジする

本実験の全体的な目的は、生体高分子フィルムを電気的に堆積させ、タンパク質や細胞などの生物学的成分で機能化することです。電気堆積は、pH応答性多糖類溶液を用い、バイアスをかけた電極で局所的に発生するpH変化を利用して達成されます。カソードまたはアノードの堆積戦略を選択し、電極にバイアスをかけることでゾル-ゲル転移を誘発し、電極形状によって定義されたパターンを持つ薄膜を形成させます。

さらに、電極堆積プロセス全体を通じて、タンパク質や細胞などの生物学的成分を導入することが可能です。フィルムの生物学的機能化に関して、蛍光イメージングに基づき、生物学的成分がフィルム上に局在していることを示す結果が得られています。加えて、酵素活性の電気化学的検出およびレポーター細胞応答の使用により、これらの成分が機能的に動作し、周囲の環境と相互作用できることが実証されています。

バイオファブリケーションは、生物学とエレクトロニクスのインターフェースを構築するための斬新なツールボックスを提供します。その主な利点は、簡便であることと、生理的条件に近い状態で組み立てが可能であることにあると考えられます。生物学は、自己組織化や酵素的手段を通じてナノスケールでの作製に長けています。これらの能力を利用することで、他の組み立て技術で用いられる複雑で危険かつ時間のかかる合成方法を回避することができます。

共同研究チームは、キタン（kitan）が電極析出可能であることを確認した際、生物学的材料とメカニズムを用いてBioDデバイスインターフェースを構築するというアイデアを得ました。キタンはpH応答性のフィルム形成多糖類であり、デバイスによって印加された電気信号を認識して薄膜として析出することができます。キタンが電極析出可能であることが分かったことで、生化学および分子生物学のより幅広いツール群を利用してBioDデバイスインターフェースを構築できることに気づきました。

このような手法の応用は、電極上に機能的な生物学的コンポーネントを生存させたまま配置するための安価で簡便な方法を提供するため、ラボオンチップの設定にまで及びます。バイオファブリケート膜は繊細で損傷しやすいため、この手法の視覚的な実演が極めて重要です。したがって、膜の洗浄や撮影を行う際は、強い刺激を与えないよう注意する必要があります。

膜は乱れやすい可能性があります。しかし、利点として、膜を容易に除去できるため、電極を再利用することが可能です。本プロトコルを開始するには、ワニ口クリップを用いてパッチコード経由でカスタム製作した電極に電源を接続してください。

酸化インジウムスズ（ITO）コーティングガラススライドをアノード（作用電極）とし、白金箔をカソード（対極）として使用します。ITO表面を機能化させるため、ITO表面が対極と向かい合うように電極を配置してください。この際、ITO表面を溶液に浸すために垂直に配置するか、表面に溶液を保持できるように水平に配置します。次に、1%アルギン酸と0.5%炭酸カルシウムを蒸留水に混合し、オートクレーブで滅菌してアルギン酸堆積溶液を調製します。その後、Fluor spheresを混合し、ボルテックスで攪拌してアルギン酸を蛍光標識します。

これにより、得られたフィルムの蛍光イメージングが可能になります。オートクレーブ後、調製した堆積溶液に両電極を浸し、3 A/m²の一定電流密度を2分間印加します。電圧は2〜3 Vの範囲で変動します。2分後、電極を切り離し、堆積していない溶液を除去します。塩化ナトリウムでフィルムを軽くすすぎ、余分なアルギン酸を除去してください。

ゲルの強度を高めるため、フィルムを0.1 molar 塩化カルシウム中で短時間インキュベートします。その後、フィルムを任意の保存溶液中でインキュベートします。共析出を行う前に、蛍光顕微鏡を用いてフィルムのイメージングを行ってください。

このビデオに付属する書面プロトコルの指示に従い、シグナル送信細胞の培養物とシグナル受信細胞の培養物を増殖させます。次に、アルギン酸と炭酸カルシウムの堆積溶液を調製します。この溶液を各細胞培養物と1:1の比率で混合し、最終濃度が1%アルギン酸および0.5%炭酸カルシウムとなり、細胞が培養密度の約半分に希釈されるようにします。

ポリジメチルシランのウェルで囲まれた2本のITO電極がパターン形成されており、白金対極を備えたガラススライドを使用します。一方のITO電極と白金電極を電源に接続します。前述と同様に、受容細胞を含む堆積溶液に電極を浸します。

電源を、電析が行われる単一電極によって定義される表面積に基づき、電流密度 3 A/m² の定電流に設定します。細胞をアルギン酸マトリックス中に共電析させるため、2分間電流を印加します。前述と同様にフィルムを塩化ナトリウムで洗浄し、対極の接続を隣接するITO電極に切り替えます。

堆積手順を繰り返しますが、今回は送信細胞を含む溶液を導入します。共堆積させた細胞とカルシウムアルギネートを含む2電極チップを、リン酸緩衝生理食塩水中で37°Cにて一晩インキュベートします。

10% LB培地および1 mM 塩化カルシウムを添加します。インキュベーション後、蛍光顕微鏡を用いてチップを撮影し、キトサン電極の電析を開始します。電源を電極に接続します。

アリゲータークリップを接続します。金コーティングされたシリコンチップをカソードとし、白金箔をアノードとして使用します。前回と同様に、対極を堆積させるように金電極表面を配置します。

Kato sand flakesを水に混ぜ、2 molar 塩化水素をゆっくりと加えて多糖類を溶解させ、Kato sand溶液を調製します。本文で参照されている手順に従い、Kato sand溶液を蛍光標識することで、蛍光顕微鏡により電極に堆積した膜をイメージングすることが可能です。次に、電極をKato sand溶液に入れ、堆積させたい領域を完全に浸します。

作用電極の表面積に基づき、4 A/m²の電流密度で算出した一定電流を2分間印加します。この例では、4 mm²の金電極に16 µAの電流を印加します。電圧は2〜3 Vの範囲内で変動します。その後、電極を脱イオン水で洗浄して過剰なキトサンを除去してください。続いて、蛍光顕微鏡を用いてフィルムの撮像を行います。キトサンおよびグルコースオキシダーゼの溶液から、4 A/m²の電流密度でパターン化電極上に共電着させます。

キトサン電極電着の手順に従い、グルコースオキシダーゼを封入したカイザン膜を作製します。処理した電極を作動電極として3電極系に接続し、対極に白金線、参照電極に塩化銀電極を用い、これらの電極を塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液に浸します。電着後、クロノポテンショメトリーを用いて60秒間一定電圧を印加し、タンパク質をカイザン膜に電気化学的に結合させます。

チップをリン酸緩衝液に入れ、オービタルシェーカーで10分間洗浄して、未反応の塩化ナトリウムおよび未結合のグルコースオキシダーゼを除去します。3電極系を再度接続し、5 mMのグルコース溶液に浸します。その後、電位を正方向に0.7 Vまで掃引するように、サイクリックボルタンメトリーの所望のパラメータを設定します。

電極をグルコース溶液から取り出し、リン酸緩衝液で洗浄します。次に、磁気攪拌機の上に置いた、8 mLのリン酸緩衝液を含む10 mLビーカーに電極を設置します。GOX修飾チップを0.6 Vに設定し、作用電極として使用します。

希望のパラメータを設定した後、ベースラインの記録を収集します。バッファーにグルコース分注液を加え、1回につきグルコース濃度を4 millimolarずつ上昇させます。本実験では、80 millimolarのグルコース分注液を400 µLずつバッファーに添加します。得られた電流出力を各グルコース濃度と相関させます。タンパク質の機能化を行うための標準曲線を作成するには、A-P-D-M-S内に封入された、金電極とITO電極が隣接してパターン形成されたガラススライドを使用してください。

既報の通り、金電極にカソード電位を印加し、チゼンを電析させます。皮膜を洗浄後、チロシナーゼを添加した青色蛍光標識 auto inducer two synthase 溶液を加えます。その後、室温で1時間インキュベートします。

前と同様にフィルムをPBSで洗浄し、受容細胞を含むアルギネート電析溶液に浸したITO電極に陽極電位を印加します。その後、「アルギネート中への細胞集団の共電析」で概説した手順に従い、酵素的に伝達信号を生成させます。フィルムを洗浄した後、5 µMのSAHおよびPBSに10% LB培地と1 mMの溶液を添加します。

塩化カルシウムで電極を覆い、溶液の蒸発を防いで37°Cで一晩インキュベートします。これにより、赤色蛍光タンパク質DS redを生成させることでレシーバー細胞の応答が可能になります。隣接する電極は、フィルターを調整して、inducer two synthaseの青色蛍光と、電気信号によって誘導されたレシーバー細胞が発現する赤色蛍光をキャプチャすることで、蛍光顕微鏡で観察できます。電気刺激により電極表面付近に局所的な微小環境を作り出すことができ、これらの刺激によって、アルギン酸やザンタンなどの多糖類の自己組織化を誘発し、電極表面にハイドロゲル膜として堆積させることができます。

このゾル-ゲル転移は電極表面で起こるため、得られるフィルムは電極パターンに一致した形状で電気的にアドレス指定されます。アルギン酸を用いることで、独自の細胞集団を別々のアドレスに共堆積させることが可能です。送信側と受信側の細胞集団が相互作用することで、それらが電極アドレスに基づいていることが確認されます。

オートインデューサー2分子は送信細胞から拡散し、受信細胞に取り込まれることで、DS red蛍光タンパク質の発現が誘導されます。ここでは、受信細胞が配置されている電極でのみ赤色蛍光が観察されます。対照的に、バイオセンシング酵素であるグルコースオキシダーゼは、酵素反応によって過酸化水素を生成し、それを電気化学的に酸化させて出力電流を得ることで、グルコースの検出を可能にします。

このようにして、化学信号を電気信号へと変換することができます。このグラフは、Geo Xを化学的に結合させた膜が、Geo Xを含まない膜とは対照的に、グルコースの存在下で強いアンチ信号を生成することを示しています。これらの結果は、Geo Xが堆積させたzam膜上に組み立て可能であり、かつ触媒活性を保持していることを示しています。さらに、グルコース濃度の増加に応じて、オティック電流の段階的な増加が認められます。

提示されている標準曲線は、添加したグルコース量に応じて、段階的な増加がほぼ線形に進行したことを示しています。これらの結果は、ここに描写されているように、酵素がRazzaフィルムへの接合後もその感度を保持していることを示しています。I two synthaseにはPenta tyrosineタグが含まれています。Tyrosinaseがチロシンタグに作用して、残基のフェノール基をo quinoneに酸化し、それがKazanのアミンに共有結合します。TyrosinaseによるI two synthaseのアセンブリを通じたKazanフィルムの機能化の証拠は、金上のKazaフィルムを示すこの蛍光画像で観察されます。ここでは、機能化されたI two synthaseが青色で蛍光標識されています。I two synthaseは、送信細胞と同様に基質SAHからI twoを生成するため、SAH存在下で共用された受信細胞に近接していると、受信細胞にdsを発現させることで蛍光応答を引き起こします。

受容細胞の赤色蛍光は、aiの拡散によるアドレス間の相互作用を改めて実証しており、さらにtizenに固定化された10種類の酵素が、共有結合後も活性を保持していることを示しています。このビデオを視聴することで、多糖類フィルムの電気堆積方法と、さまざまな手法を用いたそれらの機能化方法について十分に理解することができたはずです。我々は、これらの機能化ステップの汎用性を実証しました。これにより、今後の試験において多種多様な生物学的コンポーネントを扱うことが可能になります。

この手法を習得すれば、わずか数分で、生物学的成分を精密にグラフトできる明確なフィルムパターンを作成することが可能です。これにより、指定した電極上に生物学的にパターン化された活性表面を非常に容易に、かつ組織的に生成でき、同時に複雑な生物学的相互作用を実現させることができます。この手順に従い、電極アレイの設計と生物学的成分の選択に創意工夫を凝らすことで、意図した設計上の相互作用を達成することが可能です。

バイオファブリケーションツールが、それぞれが私たちの生活に革命をもたらしてきたバイオテクノロジーとマイクロエレクトロニクスという2つの異なる分野を橋渡しすることが期待されます。これら2つの分野を融合させることで、社会が直面している極めて深刻な問題に対する新たな解決策を創出できると考えています。例えば、バイオファブリケーションによって、ポイントオブケアや疾患の診断、そして生物学的・化学的脅威の検知のための、簡便で汎用性の高い新しいセンシング手法が提供されることを想定しています。

遠い将来の例を挙げれば、次世代のさらに先の動脈ステントは、動脈の開通性を維持するだけでなく、代謝プロファイルのモニタリングも可能になるかもしれません。