からの神経外植文化アフリカツメガエル

本手順の目的は、その後の高解像度画像解析のために、アフリカツメガエル（Xenopus Lavis）の成長円錐を培養することです。まず、雌のカエルにホルモンを注射して卵の産生を促進させます。次に、卵を採取して受精させ、その後、mRNAやその他の目的の構築物を注入します。

翌日、胚を解剖して神経管を単離し、細切してカバーガラス上に播種します。最終ステップは、伸長する軸索と成長円錐をイメージングすることです。最終的に、高解像度蛍光顕微鏡を用いることで、成長円錐におけるタンパク質局在の経時的な変化を示すことができます。

神経管の解剖は、手法の記載を読んだだけでは習得することが難しく、実際に手技を観察することが不可欠であるため、本手法の視覚的な実演が重要となります。12〜14時間前に400 unitsの絨毛性ゴナドトロピンを注入した雌ガエルから卵を得ます。卵を1X modified ringer solutionに回収してください。

その後、既報の手法に従い、回収したXを精巣組織片を用いてin vitroで受精させ、少なくとも20分後に0.1 XMMRを添加します。培地を除去し、胚をpH 7.8の1 XMMR中の2% cysteineで3〜5分間インキュベートして、胚のジェリーコートを除去します。その後、胚をビーカーに移します。

次に、最後の洗浄後、胚を0.1 XMMRまたは0.1倍希釈の改良浴塩水で3〜5回洗浄します。注入を行うまで、または必要に応じて、胚を室温の0.1 XMMRに保持します。注入前に発生を遅らせたい場合は、胚を14〜18 °Cに置きます。

あらかじめ調製したキャップ付きRNAを、二回蒸留水を用いて最終濃度50〜200 pg/mLに希釈し、マイクロインジェクションまで氷上で保存します。次に、スータープラーまたは同様の装置を用いてホウケイ酸ガラスキャピラリーを引き、注入用針を調製します。その後、顕微鏡下でピンセットを使用して針先を斜めに切り、ペン先のような形状にした後、0.5〜1 µLの希釈RNA溶液を針に充填します。

ニードルをマイクロマニピュレーターに取り付けます。ここでは、A medical system社のPLI 100 PICOインジェクターを使用しています。次に、1〜4細胞期の受精胚を、0.1 XMMRで希釈した5% folを含むプラスチックディッシュに入れます。新しいマイクロピペットを使用する際は、その都度、ラジカルまたはステージマイクロメーターを用いて注入量を校正してください。

次に、1回の注入あたりに注入したいRNA量をピコインジェクターに設定します。ここでは、注入量を1 nanoliterに設定しています。胚をピンセットで保持するか、またはホールドプラットフォームに固定し、動物極に所定の量を注入します。

RNAを均一に分布させるため、胚の数か所に分散して注入します。4細胞期の胚では各胚割細胞に1〜2回、2細胞期の胚では2〜4回の注入を行います。注入後、注入済みの胚を0.1 XMMRを含むプラスチックディッシュに移し、ステージ20から23まで発生させます。

希望する発生速度に応じて、胚を14から22°Cの温度でインキュベートします。PLL処理した培養皿を10 µg/mLのラミニンを含むPBSでコーティングし、プレートを37°Cで1時間置きます。インキュベーション時間が経過したら、プレートをPBSで3回洗浄します。この際、最後の洗浄後にラミニンコーティング面が空気に触れないように注意してください。PBSを培地に交換します。

最後に、培養皿の底部に0.1 XMMRで希釈した1% agaroseをコーティングし、凝固させて、agaroコーティング皿を3枚準備します。凝固後、1枚の皿にSteinberg溶液を満たします。注入したmRNAの発現のばらつきにより、解剖前に胚に蛍光のモザイクが見られる場合があります。胚に蛍光があるかを確認し、神経管に蛍光融合タンパク質を発現している胚を特定します。

次に、ステージ20から23の蛍光胚を、Steinberg's Mediaを含むアガロースコーティング済みのプラスチックディッシュに移します。ディッシュを解剖顕微鏡下に置き、微小ピンセットを用いて卵膜を除去します。その後、一方のピンセットで胚を固定しながら、もう一方のピンセットで胚の側面に切開を加え、中空の内部を露出させます。

次に、2組のピンセットを使用して、胚の背側半分と腹側半分の間の組織を挟み込み、胚を半分に切断して、神経管を含む背側部分を分離します。この背側外植片を、2 mg/mLのコラゲナーゼを含むSteinberg溶液が入ったマイクロ遠心チューブに入れ、ローテーターで15〜20分間回転させます。その後、背側外植片を新鮮なSteinberg溶液を満たしたアガロースコート皿に移します。

顕微鏡下で、ピンセットの先を表皮と下層組織の間に滑り込ませ、表皮をゆっくりと引き剥がすことで、背側表皮および腹側ノアから神経管を切り出します。次に、一方のピンセットで組織を固定し、もう一方のピンセットで神経管周囲の組織を取り除きます。その後、切り出した神経管を新鮮な培養液を満たしたアガロースコート皿に移します。

数本の神経管を回収した後、タングステン針またはピンセットを研ぎ、各神経管を約20個に切断します。次に、これらの断片をラミニンコートした培養皿に播種し、各断片が列状に均等に広がるように配置します。神経管を播種した後は、細胞の接着を妨げるため、皿を動かさないようにしてください。

プレートに播種した神経管外植え物を20〜22°Cでインキュベートします。Xenopus laevisのニューロンの培養において、播種から12〜24時間後のニューロンおよび成長円錐を室温で観察する場合、細胞培養インキュベーターは必要ありません。RNAの発現量にばらつきがあるため、成長円錐間で蛍光強度に差が生じる可能性があることに留意してください。

このDIC画像は、視野の左上隅にあるX explanから成長している軸索とニューライトを示しています。この画像および以降の画像におけるスケールバーは10 micronsを表しています。この高倍率の動画は、成長しつつある軸索の先端にある成長円錐を示しています。

最後に、この蛍光顕微鏡動画では、成長円錐におけるEB1-GFPの発現を示します。ここでは、プラス端融合タンパク質であるEB1-GFPのイメージング例を提示していますが、この神経外植体法は、神経突起伸展時の成長円錐内における挙動を解明するために、任意のタンパク質に適用することが可能です。