2012年10月15日
解剖からの培養神経外植アフリカツメガエル蛍光融合タンパク質を発現する胚は成長円錐の細胞骨格ダイナミクスのイメージングを可能にします。
この手順の目的は、その後の高解像度画像解析のためにXenopus Lavis成長コーンを培養することです。これは、最初にメスのカエルにホルモンを注射して卵子の生成を刺激することによって達成されます。2番目のステップは、卵子を収集して受精させ、次にmRNAまたは他の目的の構築物を注入することです。
翌日、胚を解剖し、神経管を分離し、切断してカバースリップにメッキします。最後のステップは、成長する軸索と成長円錐を画像化することです。最終的には、高解像度蛍光顕微鏡を使用して、成長コーンのタンパク質局在の経時的な変化を示すことができます。
この手法を視覚的に示示することは、技術を直接観察せずに方法のセクションを読むことで神経管の解剖を学ぶのが難しい場合があるため、非常に重要です。12〜14時間前に400ユニットの絨毛性ゴナドトロピンを以前に注射したメスのカエルから卵を入手します。卵を1つのXマーク修飾リンガー溶液に集めます。
次に、前述のように採取したXをin vitroでミンチ精巣で施肥し、少なくとも20分後に0.1XMMRを添加します。培地を取り出し、胚をpH 7.8の1つのXMMRで2%システインで3〜5分間インキュベートして、胚ゼリーコートを除去します。次に、胚をビーカーに注ぎます。
次に、最終洗浄後に0.1 XMMRまたは0.1 x改変入生理食塩水で胚を3〜5回洗浄します。胚を0.1 XMMRで室温で注入するまで、または必要に応じて保管します。胚を摂氏14〜18度にして、注入前に発育を遅らせます。
以前に調製したキャップ付きRNAを最終濃度の50〜200ピコグラムバナナリットルに二重蒸留水で希釈し、マイクロインジェクションまで氷上に保存します。次に、スータープーラーまたは同様の器具を使用してホウケイ酸塩キャピラリーを引っ張って、注射針を準備します。次に、顕微鏡下で、鉗子を使用して針の先端を斜めに折ってクイルのような形状を生成し、希釈したRNA溶液の0.5〜1マイクロリットルで針を埋め戻します。
マイクロマニピュレーターに針を装着する ここでは、医療システムのPLI 100 PICOインジェクターを使用します。次に、受精した胚を1〜4細胞期に、0.1 XMMRに5%folを含むプラスチック皿に入れます。新しい各マイクロピペットの注入量を、ラジカルマイクロメーターまたはステージマイクロメーターを使用して校正します。
次に、各注入に必要な量の RNA を送達するように pico インジェクターを設定します。ここでは、1ナノリットルの注入量が使用されます。鉗子で胚を保持するか、必要に応じて保持プラットフォーム上の場所に配置し、動物のブラスターに必要な量を注入します。
胚全体のいくつかの場所に注射を分散させて、RNAの均一な分布を取得します。4細胞期の胚では各ブラスターで1〜2回の注射が行われますが、2細胞期の胚では2〜4回の注射が使用されます。注入後、注入した胚を0.1 XMMRを含むプラスチック皿に移し、ステージ20〜23まで成長させます。
所望の発育速度に応じて、胚を摂氏14〜22度の温度でインキュベートし、PBS中の1ミリリットルあたり10マイクログラムのラミニンで培養皿をコーティングPLL処理し、プレートを摂氏37度で1時間置く。インキュベーション時間が経過したら、最終洗浄後にラミニンコーティング表面が空気にさらされないように注意しながら、PBSでプレートを3回洗浄します。PBSを培地と交換します。
最後に、培養皿の底を0.1 XMMRで1%arosでコーティングし、硬化させることにより、3つのアグロスコーティング皿を準備します。硬化したら、注入したmRNAの発現におけるスタインバーグ培地の変動性を1皿に充填すると、解剖を行う前に胚に蛍光のモザイクが現れる可能性があります。胚の蛍光の存在をスクリーニングし、神経管内で蛍光融合タンパク質を発現する胚を同定します。
次に、ステージ20〜23の蛍光胚を、Steinberg's Mediaを含むアグロスコーティングプラスチック皿に移します。皿を解剖顕微鏡の下に置き、細かい鉗子を使用してビテリン膜を取り除きます。次に、1つの鉗子で胚を所定の位置に保持しながら、2番目の鉗子を使用して胚の側面を切開し、中空の内部を露出させます。
次に、両方の鉗子セットを使用して、胚の背側半分と腹側半分の間の組織に沿ってつまんで、胚を半分に切断し、神経管を含む背側部分を分離します。背側のX explanを、1ミリリットルあたり2ミリグラムのコラゲナーゼを含むマイクロ遠心チューブに入れ、スタインバーグ培地にコラゲナーゼを入れ、ローテーターに15〜20分間置きます。次に、背側の説明を新鮮なスタインバーグの培地で満たされたアグロコーティングされた皿に移します。
顕微鏡下で作業しながら、鉗子の先端を表皮とその下にある組織の間に滑り込ませ、表皮をゆっくりと引き戻すことにより、背側表皮と腹側ヌールから神経管を解剖します。次に、1つの鉗子を使用して組織を保持し、もう1つの鉗子を使用して神経管の周囲の組織を取り除きます。次に、解剖した神経管を新鮮な培養培地で満たされたアグロスコーティング皿に移します。
いくつかの神経管を採取したら、タングステン針または鉗子を研いで、各神経管を約20個に切断します。次に、ラミニンでコーティングされた培養皿にピースを盛り付け、ナスを均等に並べます。神経管をメッキした後、細胞の付着を妨げるため、皿を動かさないでください。
メッキされた神経管エクスプランを摂氏20〜22度でインキュベートします。XUS lavisニューロンを室温でプレーティングしてから12〜24時間後にイメージングニューロンとグロースコーンを培養する場合、細胞培養インキュベーターは必要ありません。RNAの発現が変動すると、成長錐体間の蛍光レベルに幅が生じる可能性があることに注意してください。
このDIC画像は、視野の左上隅にあるX説明から成長している軸索と神経突起を示しています。この画像と次の画像のスケール バーは 10 ミクロンを表しています。この高倍率の動画は、成長する軸索の先端にある成長円錐を示しています。
最後に、この蛍光顕微鏡動画は、成長コーンにおけるEB one GFPの発現を示しています。ここでは、イメージングの例として、プラスチップ融合タンパク質EB one GFPを提供します。この神経外植片法は、神経突起伸長中の成長円錐内での挙動を解明するために、任意の数のタンパク質に適用することができます。
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この記事では、解剖されたXenopus laevis胚からの神経移植片の培養手順について説明しています。この方法により、蛍光融合タンパク質を使用して成長円錐の細胞骨格ダイナミクスのイメージングが可能になります。
High-resolution imaging of cytoskeletal protein dynamics in Xenopus laevis neural explant cultures enables precise interrogation of axon guidance mechanisms at the single-cell level. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for neurodevelopmental and neuroregenerative therapeutic discovery. The method's scalability and adaptability to various protein constructs position it as a reusable platform for portfolio-wide hypothesis testing in neural systems.
This explant culture and imaging workflow bridges early discovery and lead identification by enabling quantitative, live-cell analysis of protein function in neural systems.