マイクロアレイを用いた植物細胞壁ポリマーの糖鎖プロファイリング

本手順の全体的な目的は、グリカンマイクロアレイを用いて、幅広い植物種または組織タイプにおける細胞壁ポリマー組成を比較することです。まず、目的の植物組織を採取します。ホモジナイズ後、アルコール不溶性残渣を調製します。

次に、CDTAおよび水酸化ナトリウムを用いて細胞壁グリカンを順次抽出します。その後、ロボットを用いて細胞壁グリカン抽出物をマイクロアレイにプリントします。細胞壁グリカンに対するモノクローナル抗体でマイクロアレイをプローブし、マイクロアレイ上のスポット信号を定量します。

最終的に、これらの結果を用いて、目的のサンプルセットにおける糖鎖エピトープの相対的な存在量を決定することができます。私たちは、複数の植物組織タイプにおける細胞壁糖鎖の出現状況を同時にグローバルに把握し、組成の違いを検出する必要があると考え、このマイクロアレイ法を開発しました。したがって、単糖分析などの従来の手法に対する本手法の主な利点は、マイクロアレイベースのプラットフォームであるため、数百のサンプルを同時にスクリーニングできる点にあります。これは、細胞壁組成をプロファイリングするための迅速かつ包括的な手法です。目的の各組織について、液体窒素を用いて生重量 100 milligrams の植物組織を3連サンプルで準備します。

サンプルを均質化して微粉末にし、細胞壁材料を調製するために、均質化したものを10 milliliterのプラスチック製コニカルチューブに移します。均質化したものを室温で10 millilitersの80%ethanolに再懸濁し、2分間激しくボルテックスします。サンプルを3,500 times Gで遠心分離し、上清を捨てます。

70% ethanolによる洗浄を、上清が透明になるまで少なくとも3回繰り返します。その後、100% acetoneで最終洗浄を行います。アルコール不溶性残渣をパレットに広げ、一晩風乾させて、微細で均質な粉末にします。アルコール不溶性残渣サンプルを0.4 millimeter squaredのメッシュで篩い分けます。

次に、混合用の3 mmのガラスビーズが入ったマイクロチューブに、アルコール不溶性残渣サンプルを10 mgずつ秤量して加えます。ペクチンおよびペクチン関連ポリマーを抽出するため、各サンプルに50 mMのCDTAを500 µL加え、チューブを短時間ボルテックスした後、Tissueizerを用いて8 Hzで3時間混合します。その後、サンプルを12,000 ×gで遠心分離します。

G.上清を慎重に取り除き、4°Cで保存する。ペレットを1 mLの脱イオン水で2回洗浄する。残った細胞壁ペレットから、チューブ内のすべての液体を取り除く。

0.1% 水化水素ナトリウムを含む 4 M 水酸化ナトリウム 500 µL を用いて、架橋グリカンの抽出を行います。前述の抽出手順に従い、架橋グリカンを含む上清を 4 °C で保存します。ペレットを脱イオン水で2回洗浄してください。

次に、500 µLのCainを用いて、セルロースなどの残留ポリマーを抽出します。遠心分離を行い、抽出された細胞壁ポリマーを含む上清を回収して、粒子状物質を除去します。その後、組織型および抽出法に基づいてサンプルを配置した専用のカスタムレイアウトに従い、各サンプル50 µLをポリプロピレン製384ウェルマイクロタイタープレートに分注します。

次に、細胞壁ポリマー試料を脱イオン水で希釈し、0倍、5倍、25倍の連続希釈液を調製します。マイクロアレイのピン高さ、回収量、ドウェルタイム、および洗浄ステップなどのパラメータを設定します。試料の蒸発を防ぐため、プリンティングチャンバーの湿度を60%に制御します。

印刷を開始します。ロボットはキャピラリーチャンネルピンを使用して、サンプルプレートから装置内のフラットプレートに貼付されたニトロセルロース膜上へ溶液をプリントします。アレイの各スポットには15 nanolitersの溶液が含まれ、3連（トリプリケート）でプリントされます。

同一のマイクロアレイをメンブレン上に隣接してプリントし、個別のアレイに切り分けます。非特異的結合を抑制するため、各マイクロアレイを5%スキムミルク溶液中で室温で2時間ブロッキングします。

細胞壁グリカンおよびエピトープに特異的なモノクローナル抗体を添加し、2時間インキュベートする。次に、非特異的結合を除去するため、マイクロアレイをPBSで5分間、3回洗浄する。その後、PBSで5分間の洗浄を3回行い、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）標識二次抗体を用いてマイクロアレイを2時間プローブする。

発色性または化学発光性基質を用いてマイクロアレイを現像します。高解像度デスクトップスキャナーを使用して、個々のマイクロアレイをスキャンします。画像はネガの16 bit TIFFファイルとして保存してください。

自動グリッドツールを備えたexplore画像処理ソフトウェアを用いて、各スポットの積分強度を算出します。次に、各マイクロアレイのグリッドデータをテキストファイルとしてエクスポートします。解析のため、データファイルをExcelスプレッドシートに手動でインポートします。

印刷の繰り返し回数および希釈系列におけるスポットの積分強度を平均し、各サンプルの平均スポット強度値を算出します。異なるサンプル間の相対的な平均スポット強度を、Excelの条件付き書式またはオンラインのヒートマップ作成ツールを用いてヒートマップとしてプロットします。抗体種ごとのバックグラウンド信号および偽陽性を除去するツールを使用し、データを100に補正して5%のカットオフ値を適用します。

包括的なマイクロアレイポリマープロファイリングを用いて、Nicotianaの6種類の組織（葯、花糸、花粉、子房、花弁、花柱）における多糖類の相対的な存在量を測定しました。多くの花組織が用いられており、マイクロアレイはペクチン多糖類のエピトープに特異的なモノクローナル抗体JIM5でプローブされました。なお、JIM5エピトープは、すべての花組織のCDTA抽出物において検出されます。

しかしながら、それは花粉で最も高く、柱頭組織で最も低くなります。興味深いことに、JIM fiveエピトープは花粉の水酸化ナトリウム抽出物でも検出されましたが、他の組織では検出されませんでした。定量的な情報は、子房組織のマイクロアレイ上で内部標準として処理された、さまざまな精製多糖類の標準曲線を作成することによって得られます。

各サンプルにはJIM 5エピトープを含むhoogが約157 µg含まれており、これは全細胞壁残渣の約1.5%に相当した。一方、花粉組織にはJIM 5エピトープを含むhoog Roninが625 µg含まれており、全細胞壁残渣の約6.25%に相当した。全組織における15種類の糖鎖エピトープの相対的な存在量をヒートマップとしてまとめている。カラーバーの強度は、各サンプルの補正済み平均スポット強度に比例している。

これらのデータを図示することで、異なる花組織間における糖鎖エピトープの出現頻度の差を迅速に解釈することが可能になります。これらの結果は、個々の糖鎖エピトープがさまざまな花の種類の間で特異的に分布していることを示しています。例えば、LM 13エピトープは、他の組織と比較して、葯のフィラメントおよびSE L組織において最も豊富に存在しています。

このパターンは、MAB LM6によって優先的に検出される短鎖エピトープのパターンとは著しい対照をなしています。架橋糖鎖もまた、多くの花において特有の出現パターンを示します。例えば、LM10エピトープは他の組織に比べて柱頭組織に豊富に存在しますが、子房組織には存在しません。

LM 15 xog グリカンエピトープは、他の組織と比較して花弁および葯糸で最も高く、一方でヘテロマンナンは葯糸で最も高くなります。このビデオを視聴することで、広範な植物種および組織型において、細胞壁グリカンを抽出および相対量を決定する方法について十分に理解できるはずです。マイクロアレイを用いたこの手法は、一度習得すれば3日間で完了させることができます。

本手順に従い、各工程においてサンプルおよびレプリケートを一貫して扱うことが重要です。さらに詳細な検討を行うには、酢酸硝酸法などの他の分析手法を用いることができます。例えば、CDTAおよび水酸化ナトリウムを用いてペクチンおよびコンシルベランを連続的に抽出した後に、どれだけの絶対セルロース量が残存しているかといった疑問を検討する場合などが挙げられます。

この手法は植物細胞生物学の分野で幅広く応用可能であり、ArabidopsisやFisca、Nutellaなどのモデル植物に加え、綿、小麦、ユーカリ、タバコなどの糖鎖の出現状況を迅速に比較することができます。