Name: ゼブラフィッシュ胚の脳室の手動排水 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚の脳脊髄液手動排出法による神経発生メカニズム解析。この技術は脳室系の発生生物学研究とCSF組成分析に応用可能です。

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この作品は、国立精神衛生研究所、国立科学財団によってサポートされていました。博士ジェンGutzman博士アマンダ·ディッキンソン、多くの有用な議論や建設的な批判のための他のSive研究室のメンバーに、専門家の魚飼育用のオリビエ​​Paugoisのおかげで、特別です。

1。マイクロインジェクション針とセルトラムの準備<ol><li>製造元の指示に従って、ミネラルオイルをエッペンドルフCellTramオイルマイクロインジェクター装置を記入してください。 </li><li>サッター楽器ニードルプラーを使用してキャピラリーチューブを引いて、マイクロインジェクション針を準備します。 </li><li>エッペンドルフCellTramに接続マニピュレーターに針を取り付けます。 </li><li>慎重に針の先端を破る。均一なチップサイズについては、マイクロメーターを用いて測定したり、参照針と比較します。 </li><li>任意の気泡を避けるように注意して、長さに沿って油をプッシュするCellTramを使用して、油で針の長さを記入してください。 </li></ol> 2。胚の準備<ol><li> 1から200μlのピペットチップを用いて1％アガロースコーティングされた皿に穴を突く、アガロースプラグを取り外します。胚メディア（ウェスター25に従って製）で皿を埋める。 </li><li>実体顕微鏡下でピンセット、dechorionate胚を用いた。 </li><li> dechorionated胚を転送アガロースコートディッシュに。 </li><li>胚は（ウェスター25によれば作られる）移動を停止するまでの胚を麻酔し、アガロース皿にTricaine（0.1 mg / ml）を加える。 </li></ol> 3。 eCSFを排出<ol><li>オリエントアガロースとその後部両側脳の背側の可視化を可能にする、マイクロマニピュレータに最も近いの穴にしっぽを持つ胚。 </li><li> rhombomere 0/1のヒンジ·ポイントまたは後脳室（ 図1A）の最も広いポイントで針を置きます。 </li><li>後脳の脳室の慎重ピアス屋根板は、卵黄に脳の深さを通過しないように気をつけてください。 </li><li> CellTramを使用eCSFを排出し、マイクロインジェクションニードル内の流体を収集します。任意のセルを避けるように注意してください。 </li></ol> 4。組成分析のためeCSFの収集<ol><li> eCSFが針に収集された後、慎重にCellTramから吸引を停止します。 </li><li>モー針の下から皿をVEと慎重に所望のバッファを含むチューブに針を配置します。 </li><li> CellTramを使用して、油で溶液の汚染を避けるためにしようとするバッファへの針のeCSFを流出。 </li><li>あなたは、10,000×gでeCSF、スピンeCSFと共に吸引されていることを細胞を除去するためである。収集し、さらなる分析のために-80℃でeCSF（上清）とストア°Cまで準備汚染されていない。 </li></ol> 5。選択した因子の再導入<ol><li>流体は、その期間内に補充されるので、所望の時間間隔の間にeCSF毎回2時間を排出します。温排水の時点までの間に、針を除去し、28.5℃で胚を保存したり、希望する。 </li><li>試験因子と第二マイクロピペット針をロードします。 </li><li>微量注入器に取り付けられたマイクロマニピュレーターに針を置きます。 </li><li>油の中にドロップサイズを測定し、射出時間とpを調整することによって、1をNLに注入量を調節ressure。 </li><li>前述の26記載脳室に1月2日NLを注入します。 </li></ol>

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<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+formation+of+zebrafish+brain+ventricles+occurs+independently+of+circulation+and+requires+the+nagie+oko+and+snakehead%2Fatp1a1a.1+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products.</a> Development. 132, 2057-2067 (2005).</li>
<li>Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+classification+of+zebrafish+brain+morphology+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants.</a> Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

手動でゼブラフィッシュ脳室からeCSFを排出するために、この手法を使用するには、開発中にeCSFのための要件を決定するために有用であろう。また、この技術は、胚発生の過程でeCSFタンパク質プロファイルの説明をできるようになります。この時間の間に種々のタンパク質の同定は、CSFおよび脳の発達の間にその潜在的な役割の機能にさらに調査を可能にするでしょう。 amniotesで、eCSF（IGF2は、FGF2、レチノイン酸、およびアポリポタンパク質）で同定され、いくつかの要因は、神経上皮細胞の生存、増殖および神経新生13,17,20,23,27,28で実証的な役割を持っています。しかし、後でここに実証の時点より脈絡叢を形成した後に得られたeCSF、、に特徴づけられていない何百もの蛋白質があるように見える。さらに、我々の研究室や他の人が異常な脳室の大きさや脳の欠陥29-31、および5月HAVとゼブラフィッシュ突然変異体を同定したeCSF組成と機能の電子の異常。この方法は容易に変異または異なる環境条件下で推定異常eCSFを分離し、テストを行うことができます。 <p class="jove_cont...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>エッペンドルフCellTramオイル</td><td>エッペンドルフ</td><td> 516 000.025 </td></tr><tr><td>鉱油</td><td>シグマ</td><td> M8410 </td></tr><tr><td> Tricaine粉</td><td>シグマ</td><td> A5040 </td></tr><tr><td>毛細管</td><td> FHC社</td><td> 30-30-1 </td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ胚の脳室の手動排水

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

脳脊髄液（CSF）は脳室内に含まれるタンパク質に富む流体である。これは初期の脊椎動物の胚発生時に存在しており、生涯にわたって持続します。アダルトCSFは、脳を和らげる廃棄物を削除して、分泌される分子の1,2を運ぶと考えられている。成人と高齢胚では、CSFの大半は脈絡叢、脳の脳室3から5に隣接して位置する高度に血管分泌領域のシリーズが作られています。ゼブラフィッシュでは、脈絡叢が完全に144時間後に受精（HPF）6が形成されている。これに先立ち、マウスを含むゼブラフィッシュや他の両方の脊椎動物の胚では、胚CSF（eCSF）かなりの量が存在しています。ひよこのこれらのデータと研究は神経上皮は、開発の早い段階で分泌され、前脈絡叢開発7〜eCSFの主要な源であることが示唆された。 eCSFは約3倍以上のタンパク質トンが含まれていますそれが発展8,9時に重要な役割を持っている可能性が示唆された漢成人CSF、。ニワトリとマウスでの研究はeCSF、流体圧力、またはこれらの組み合わせで分泌された因子は、神経上皮10月20日における神経発生、遺伝子発現、細胞増殖、細胞生存のために重要であることを実証している。ヒト、ラット、マウス、ニワトリeCSFのプロテオーム解析は、CSFの機能のために必要があるかもしれない多くのタンパク質を同定した。これらは、細胞外マトリックス成 ​​分、アポリポタンパク質、タンパク質を浸透圧調節、細胞死と増殖の21から24に関与するタンパク質を含む。しかし、eCSFの複雑な機能は不明な点が多い。 その結果、私たちはeCSFコンポーネントの識別のために、開発中のeCSF要件の分析が可能になり、ゼブラフィッシュの脳室からeCSFを除去するための方法を開発しました。もっとeCSFは他の脊椎動物システムワットから収集することができますがi番目の大きい胚、eCSFは、ゼブラフィッシュの開発の初期段階から収集され、異常な脳室の容積や形態につながる遺伝的または環境条件の下ですることができます。 eCSFの取り外しおよびコレクションは質量分析、eCSF機能の調査、およびアッセイに心室にselect into要因の再導入、それらの機能を可能にします。したがって、初期のゼブラフィッシュ胚のアクセシビリティは開発中eCSF機能の詳細な分析を可能にする。

排水脳室の例を図1B-Cに示されている。彼らはeCSF（C対図1B）を欠いているように脳室は折りたたまれています。背側の画像に見られるように（ 図1B-C、および図2A-D）後脳の神経上皮は、その特徴的な形態を保持しないと堅牢なヒンジ点に起因する可能性が高いeCSFの欠如にもかかわらず、開いていると思われる。しかし、横方向のビュー（ 図2A&#39;-D &#39;）の後脳の心室が腹崩れ薄いフレキシブル屋根板上皮の存在と一致し、排出されたことを実証している。野生型の胚では、eCSF連続的に製造し、脳は2-3時間後（ 図2）水切りを心室補充されています。従って、CSFは、継続的に関心のある時間にわたって枯渇する必要があります。 24 HPFでの流体の除去はグロス形態や開発、もはや当たり以上eCSFの除去が妨げられることはありませんが<html>開発のIODは全身の発展に悪影響を与え...

我々は、脳脊髄液（CSF）を収集し、ゼブラフィッシュ胚の脳室系内のCSFを欠いてシステムを作成する方法を提案する。これは、胚の脳の発達中に脳脊髄液の組成とその要件の精査が可能になります。

脳脊髄液（CSF）は、脳室内に含まれるタンパク質に富んだ液体である。これは脊椎動物の初期胚発生時に存在し、...

本手順の全体的な目的は、胚の脳室系内から脳脊髄液（CSF）を除去した系を構築することです。まず、ゼブラフィッシュの脳室から胚脳脊髄液（ECSF）を手動で排出させることでこれを達成します。次に、成分のさらなる分析のためにECSFを回収します。その後、ドレインした脳室に潜在的な因子を再導入します。最後に、ECSFの効果的な除去および因子の再導入が脳の発達に及ぼす影響を分析します。最終的に、細胞分裂、細胞死、神経新生などの脳発達の側面をモニタリングすることで、ゼブラフィッシュECSFの機能を明らかにすることができます。さらに、質量分析法を用いることでECSFの含有量を決定することができます。この手法を用いることにより、発生過程における胚脳脊髄液の機能を研究することが可能になります。また、この手法を他の系に適用することで、水頭症など、CSFの組成や量に変化をもたらす疾患への理解をさらに深めることができます。まず、メーカーの指示に従ってオイルインジェクター装置にミネラルオイルを満たします。マイクロインジェクション針を引いた後、オイルインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーターに針を装着します。均一なサイズにするため、針の先端を慎重に壊します。マイクロメーターで測定するか、リファレンスニードルと比較します。オイルインジェクターを用いてオイルを注入し、ニードルの長さに沿ってオイルを押し込みます。200 µL ピペットチップを使用して、1% agros コーティング済みのディッシュに穴を開け、agros プラグを取り除きます。実体顕微鏡下で、ディッシュに胚培養液を満たします。ピンセットを使用して胚を脱殻し、アガロースコートしたディッシュに移動させます。ディッシュにトリカインを加えてECSFを排出させ、胚を麻酔します。胚を、尾側がアガロスの穴に入り、後側がマイクロマニピュレーターに最も近い向きに配置し、脳の背側が見えるようにします。針を、Therom OMERE zero slash oneヒンジポイント、または後脳室の最も幅の広い位置に合わせます。次に、脳の深部を通り越して卵黄まで到達しないよう注意しながら、後脳室の屋根板を慎重に穿刺します。オイルインジェクター装置を用いてECSFを吸引し、マイクロインジェクション針に回収します。細胞が混入しないよう注意してください。ECSFを針に回収したら、オイルインジェクターの吸引を慎重に停止させます。排水時間の測定ポイント間の所定の時間間隔において、2時間ごとに補充したECSFを排出します。針を取り外し、胚を28.5 °Cまたは所定の温度で保存します。これにより、さらなる解析のためのECSFを回収します。まず、ディッシュを針の下から外し、目的のバッファーが入ったチューブに注意深く針を挿入します。オイルインジェクターを使用して、針

manual-drainage-of-the-zebrafish-embryonic-brain-ventricles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、我々は共焦点顕微鏡による単一細胞の解像度でのライブゼブラフィッシュの胚で開発脊椎動物の脳を分析するためにする方法を示しています。これは、我々は、単一セルのゼブラフィッシュの胚を注入し、その後、脳の発達をマウントし、イメージする方法が含まれています。...

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

神経管形成後に、神経上皮は収縮し、真空管が胚の脳室を形成するために胚性脳脊髄液（eCSF）でいっぱいにしながら折る。我々は、よりよい生きている胎児の神経上皮の形状とは対照的に、流体の満たされた空間を視覚化するために、この心室注入技術を開発した。...

ゼブラフィッシュの脳室注入

我々は、ゼブラフィッシュ胚の脳の透磁率のためのライブ全体の動物定量的な測定について説明します。技術は神経管管腔内に異なる分子量の脳脊髄液や分子を保持する能力を分析し、心室の彼らの動きを定量化します。この方法では、開発や病気時の上皮透過性と成熟の違いを判別するのに役立ちます。...

ゼブラフィッシュ胚性神経上皮の透水性に関するアッセイ

このビデオでは、成魚のゼブラフィッシュの脳を微視する技術について説明しています。この方法は、さらに研究できる全脳由来のニューオロスフェアを取得するのに役立ちます。...

ゼブラフィッシュの脳解剖:魚の神経生物学の技術

このビデオは、一次ニューロスフェアの生成と分化を示しています。ゼブラフィッシュの神経幹細胞は、成長因子の存在下で、自己複製能力を持つ浮遊神経球に増殖し、その後、グリア細胞やニューロンに分化します。...

ゼブラフィッシュ神経幹細胞からの初代ニューロスフェアの生成と分化

出典:Schramm, P. et al.頭蓋骨および皮膚の除去による覚醒したゼブラフィッシュの幼虫および幼魚の完全活性脳組織のin vivoイメージング。J. Vis. Exp. (2021)このビデオは、プルキンエ細胞の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ幼生の小脳ニューロンのin...

ゼブラフィッシュ幼生の脳のin vivoイメージングによる小脳ニューロンの可視化

幼虫ゼブラフィッシュにおける脳血管の開発の撮像が記載されている。 3Dイメージングを容易にし、化学的処理を用いて脳血管発達を改変するための技術も提供される。...

イメージングおよび胚ゼブラフィッシュにおける脳血管構造物の3次元再構成

このような増殖、パターニング、分化、および軸索ガイダンスとして発生プロセスを容易にゼブラフィッシュ脊髄でモデル化することができる。この記事では、これらのイベントの可視化を最適化した、ゼブラフィッシュ胚の取付け手順を説明します。...

解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

ここでは、全脳から、または終脳、tectalまたは成人のゼブラフィッシュの脳の小脳領域のいずれかに由来する神経球アッセイを使用して、大人の神経新生を調べるために、再現性のある方法を提供します。さらに、我々はゼブラフィッシュの神経球における遺伝子発現を操作するための手順を説明します。...

大人のゼブラフィッシュ脳由来神経球の単離および培養

この原稿は、ゼブラフィッシュの胚および幼生の脊髄神経細胞からの電気生理学的記録のための方法を説明します。準備は、 その場で神経細胞を維持し、多くの場合、最小の切開を必要とします。これらのメソッドは、最初の電気的興奮の買収からの早期の幼虫の段階を経て、脊髄神経細胞の様々な電気生理学的研究が可能になります。...

ゼブラフィッシュ<em&gt;その場での</em&gt;脊髄脊髄感覚運動ニューロンからの電気生理学的記録のための準備

インビボイメージングは、神経系の発達の根底にある細胞メカニズムを調査するために使用できる強力なツールです。ここでは、開発中のゼブラフィッシュ神経系の中で、多色Brainbow標識細胞をリアルタイムに可視化するために、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いる手法について説明する。...

Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

学ぶゼブラフィッシュ胚の脳脊髄液手動排出法による神経発生メカニズム解析。この技術は脳室系の発生生物学研究とCSF組成分析に応用可能です。

ゼブラフィッシュ胚の脳室の手動排水

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