Name: Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: 学ぶバイオオルソゴナルクリックケミストリーを用いたアデノウイルス表面の化学選択的修飾法。蛍光プローブの結合とウイルス再設計技術を習得し、遺伝子治療やワクチン開発への応用可能性を理解できます。

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我々は、資金調達のためのNSF（CBET-0846259）を確認したいと思います。

<ol><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li>
<li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+%22Clickable%22+Amino+Acids+and+Sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li>
<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li>
<li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors%3A+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li>
<li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li>
<li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li>
<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unnatural+amino+acid+incorporation+onto+adenoviral+%28Ad%29+coat+proteins+facilitates+chemoselective+modification+and+retargeting+of+Ad+type+5+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors.</a> J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).</li>
<li>Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+Optimization+of+Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).</li>
<li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions%3A+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Strain-Promoted+%5B3+%2B+2%5D+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Covalent+Modification+of+Biomolecules+in+Living+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems.</a> J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li>
<li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li>
<li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

アジドのものも含めて化学選択とbioorthogonalクリック反応の開発は、研究の急速に進化している領域であり、その後、バイオコンジュゲーションアプリケーションの中から選択するこれらの反応の増加があります。我々は、我々自身の研究室とすべての試薬の商業的利用であるため、その有用性から選ばれた唯一つの方法を含めるには、このプロトコルの範囲が制限されています。 最初のそのようなルートで-ひずみ昇格アジド-アルキン環（SPAAC） -アルキンはcyclooctyneリング（ 図2a）内に含まれています。これは、最近開発されたメソッドは、酸素雰囲気下、銅触媒を必要とせずに行うことができる。9,10は最近まで、この方法の一つの欠点は、端末と比較して骨の折れる合成し、これらの緊張したアルキンの還元商業的に入手可能だったで使用されるアルキン銅（I）触媒によるアジド - アルキン環銅（CuAACは）しかし、これらのプローブのライブラリーは（試薬の表を参照）、現在市販されている。これらの理由から、我々は、このプロトコルの選択の方法としてSPAA...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> GFP遺伝子を含むアデノウイルス5型（Ad5） </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td>ヒト胎児腎臓（HEK 293）細胞</td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、高グルコース</td><td>インビトロジェン</td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地、無メチオニン、システインなし（DMEM-MET /-Cys）を、高グルコース</td><td>インビトロジェン</td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td>仔ウシ血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン100×ソリューション（ペン連鎖球菌） </td><td>インビトロジェン</td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0.5パーセントトリプシン-EDTA（10×） </td><td&gt;インビトロジェン</td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100 mmの細胞培養皿、組織培養処理したポリスチレン</td><td> BDファルコン</td><td> 353003 </td></tr><tr><td>細胞培養CO 2インキュベーター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血球計</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジフィルター（0.2μmのセルロースアセテート） </td><td> VWR </td><td> 28145-477（NA）、514から0061（ヨーロッパ） </td></tr><tr><td>アヴァンティJEの遠心</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 369001 </td></tr><tr><td>コニカルチューブ（50ミリリットル、滅菌） </td><td> BDファルコン</td><td> 352098 </td></tr><tr><td>チューブ、Thinwall、超クリア、13.2ミリリットル、14×89ミリメートル</td><td>ベックマン</td><td> 344059 </td></tr><tr><td> SW 41及びSW 60 Rを搭載した超遠心otor </td><td>ベックマン</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフBiopurセイフ - ロックチューブ、1.5ミリリットル</td><td>エッペンドルフ</td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td>遠心機5418 </td><td>エッペンドルフ</td><td> 5418 </td></tr><tr><td>遠心〜9月ゲルろ過スピンカラム</td><td>プリンストンセパレーション</td><td> CS-901 </td></tr><tr><td>滅菌した針、18ゲージ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>窒素グローブ袋（脱酸素CuAACが実行されることになっている場合） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>デュワーフラスコ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気泳動セル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光ゲルスキャナー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レディゲルのTris-HClゲル</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td>イエナバイオサイエンス</td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td>アセチル化N-azidoacetylgalactosamine（AC 4 GalNAz） </td><td>インビトロジェン</td><td> C33365 </td></tr><tr><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td>バソフェナントロリンジスルホン酸（BDA）ナトリウム塩</td><td> MPのバイオメディカル</td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリス塩基（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム（ナ2 HPO 4） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水（PBS） </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1MのHCl </td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-システイン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-メチオニン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS（​​ドデシル硫酸ナトリウム） </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化セシウム（CsCl密度） </td><td></td><td> ＆n個のBSPは、 </td></tr><tr><td>銅（I）ブロマイド（CuBr） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム（CaCl 2） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム（KCl） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム（MgCl 2の ） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl） </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> CuAAC *のアルキンプローブ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRAアルキン</td><td>インビトロジェン</td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> SPAAC *の緊張したアルキンプローブ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DIBOアルキン</td><td>インビトロジェン</td><td> C10410 </td></tr></tbody></table>クリックケミストリー試薬およびキットの*注目すべきベンダーは、Invitrogen社、イエナバイオサイエンス、ベリー·アソシエイツ、シグマアルドリッチ、グレンリサーチ、化学ツール]をクリックし、Baseclickが含まれています。アルキン色素と標的リガンドの様々なこれらのベンダーのカタログに記載されています。

bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

ウイルス粒子の修飾は、遺伝子治療、腫瘍溶解性アプリケーションやワクチン開発に影響を与えるために、その途方もない可能性のために注目かなりの量のを受けています。主に遺伝学ベースでウイルスの表面を、変更することに1,2,3現在のアプローチは、しばしば減衰に苦しむウイルス産生の、感染性と細胞の情報伝達。4,5化学選択クリックケミストリーを使用して、我々は、柔軟性の高いアクセスの両方を維持しながら、これらの問題を回避し簡単な代替アプローチを開発しました。1,2 このプロトコルの目的は、アデノウイルス5型粒子の表面を変更するbioorthogonalクリックケミストリーを用いての有効性を実証することである。それは、タンパク質に標的分子、染料または関心のある他の分子の化学選択的ライゲーションすることができ、この2段階のプロセスは、両方の治療1または分析的に、2,6を使用することができますアジタグで事前標識。このメソッドの3つの主要な利点は、（1）代謝標識は、ウイルスフィットネスに影響を及ぼすことなく、1,7に少し例を示していること、（2）エフェクターリガンドの広い配列を利用することができる、（3）それが著しく、高速で信頼性の高いです。アクセスしやすい。1,2,7 この手順の最初のステップでは、アデノウイルス粒子がazidohomoalanine（AHA、メチオニンサロゲート）や不自然な糖アジド（-N 3）の機能が含まれ、どちらもO-結合N-azidoacetylglucosamine（O-GlcNAz）、のいずれかをベアリング製造されグループ。アジドで修飾されたウイルス粒子の精製後、蛍光TAMRA部分を含むアルキンプローブは、あらかじめ標識したタンパク質または糖タンパク質の化学選択的な方法で連結されています。最後に、SDS-PAGE分析は、ウイルスキャプシドタンパク質上のプローブのライゲーション成功を実証するために実行されます。 AHAの取り込みは、すべてのウイルスキャプシドにラベルを付けることが示されているタンパク質（ヘキソン、ペントンおよび光ファイバ）、唯一の繊維の標識O-GlcNAz取り込み結果中。 この進化分野では、アジド - アルキンライゲーションのために複数のメソッドが正常に開発されてきた。しかし、我々は最も便利であることが判明した2つだけがここに実証されて - ひずみ昇格アジド - アルキン環（SPAAC）と銅触媒によるアジド - アルキン環（CuAAC）脱酸素雰囲気下で。

アデノウイルス粒子は、非天然アミノ酸類似体azidohomoalanineまたはアジド糖のいずれかを含むように設計されています<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz。それぞれのアジド基は、化学選択的にウイルスの表面改質の手段として &quot;クリック&quot;化学反応を介して連結されています。

Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾

ウイルス粒子の修飾は、遺伝子治療や腫瘍溶解性治療に多大な影響を与える大きな可能性を秘めているため、多大な注目を集めてきました。

本手順の全体的な目的は、クリックケミストリーを介してウイルス表面を再構築する柔軟な手法を実証することです。本手順の最初のステップでは、ヒト胚性腎細胞に5型アデノウイルスを感染させ、非天然アミノ酸であるホモアラニン、またはアセト糖であるN-アセトアセチルグルコサミンのいずれかの存在下でインキュベートします。2日後、アジド標識されたアデノウイルス粒子を回収し、精製します。次に、これらの粒子の表面に蛍光プローブを結合させるために、化学選択的なアジド・アルキン環化付加反応を用います。書面によるプロトコルで説明している通り、これは歪み促進型または銅触媒によるアジド・アルキン環化付加反応のいずれか2つの結合方法を用いて行われます。治療への応用において、これらの付着物はポリペプチド、ポリマー、または低分子化合物を含む場合があります。本実験では、蛍光プローブを用いて、カプシドタンパク質へのプローブのライゲーションをSDS-PAGEで実証します。特に治療、遺伝子導入、腫瘍治療、ワクチン技術の文脈において、ウイルスを遺伝子輸送担体として開発することに大きな関心が寄せられています。このような背景から、治療的な組織標的免疫刺激に適切な特性を得るためには、ウイルスと宿主のインターフェースを調整することが特に重要となります。宿主とウイルスのインターフェースを調整するにあたっては、他にも多くの要因が重要です。そこで、私たちは2段階のラベル化プロトコルを開発しました。最初のステップは、非天然アミノ酸または非天然糖の代謝的導入です。これによりアンカーポイントを設置でき、その後、非常に選択性の高い化学反応を用いてさらに精緻化することが可能です。これにより、ウイルスの感染能や全体的な適応度を著しく損なうことなく、実質的に任意の機能をウイルスに付加できます。これは克服すべき大きな障壁となります。フード内と実験器具を滅菌した後、37 °CのHEK増殖培地で維持されているHEK 293細胞の100 mm培養皿を11枚準備します。細胞培養が80〜90%コンフルエントになったら、ディッシュの1つから増殖培地を除去し、TDバッファーで1回洗浄します。1 mLのトリプシンEDTAで細胞を剥離させ、1分間インキュベートします。9 mLの増殖培地を加え、このディッシュで回収された細胞数をカウントします。ヘモサイトメーターを用いて、残りの10枚の培養皿それぞれで感染に必要なアデノウイルス粒子の数を算出します。成長培地をゆっくりと除去し、5 mLのTDバッファーで洗浄します。1 mLの感染バッファーを加え、この期間中に1時間インキュベートします。感染後、15分ごとにディッシュを左右に穏やかに揺らします。各ディッシュにHEK成長培地を9 mL慎重に加え、さらに18時間インキュベートします。システイン中のHA高濃度ストック溶液から。記載されたプロトコルに従ってHAラベル化培地を調製します。まず、これらのストック溶液を0.2 µmのシリンジフィルターでろ過してください。コントロール用のメチオニンストック溶液も同様に滅菌します。その後、培地を慎重に除去し、各培養皿を5 mLのTDバッファーで洗浄します。これを10 millilitersのHA標識培地と交換し、感染させた細胞をさらに6時間インキュベートします。これにより、メチオニン不在下かつazo homo alanine存在下でウイルスキャプシドタンパク質が翻訳されます。標識培地を注意深く10 millilitersの新鮮な増殖培地と交換し、さらに18時間インキュベートします。このステップを完了した後、ビデオのステップ3にある精製手順に進んでください。あるいは、非天然アミノ酸のa HAの代わりに、aziを含む糖を用いてaziタグを導入することも可能です。本プロトコルでは、UDPN Acetoacetyl Glucosamineの代謝前駆体である寄生虫関連のn acetoacetyl galactoを用い、このaceto sugar存在下で培養します。糖鎖ラベル化を行うため、5型アデノウイルスではファイバー部分にのみアジド基を提示させます。まず、ビデオのステップ1を画面上の指示が出るまで進めてください。これは、書面によるプロトコルのステップ1.5に相当します。まず、ATO糖ストック溶液100 µLをファルコンチューブにピペッティングし、メタノールを蒸発させて糖標識溶液を調製します。次に、HEK増殖培地100 mLを加えます。各ディッシュの細胞にこの糖標識培地を10 mLずつ加え、37 °Cで44時間インキュベートします。精製のため、ステップ3に進みます。培養皿から感染細胞を含む培地を2本のコニカルチューブに移し、4°Cで2000 G、10分間遠心分離します。上清を除去し、37°Cのウォーターバスと液体窒素を用いて、各ペレットを4 mLのTDバッファーで再懸濁します。凍結融解サイクルを3回繰り返し、感染細胞を溶解させます。各サイクルの間に、ボルテックスミキサーで懸濁液を混合してください。融解懸濁液を2000 Gで10分間遠心分離して細胞残渣を沈殿させます。ステップ1の感染に使用したアデノウイルスにはGFP導入遺伝子が含まれており、この段階での蛍光活性により、ウイルスDNAの導入と発現が確認されます。1.25 g/mLから1.4 g/mLの塩化セシウム密度勾配を慎重に調製します。溶菌細胞上清を密度勾配の上にピペッティングし、15 °Cで126,000 Gにて1時間遠心分離します。遠心分離後、遠心管内に厚い幅広のバンドが確認できるはずです。これがazi修飾ウイルスです。スターL針を用いて管の底部を穿刺し、内容物を一滴ずつ慎重に滴下させて、このウイルスを回収してください。2つのライゲーション方法のバンドによって、ストレインが実証されました。ストレイン促進ルートは、より簡便な反応条件で進行しますが、ストレイン促進ライゲーションを行うための市販プローブの選択肢が限られているという欠点があります。ウイルス保存バッファー中のアジド修飾ウイルス50 µLに、Tamara BCN標識溶液0.25 µLを混合し、チューブの底をタッピングして混ぜ合わせ、ホイルで蓋をして室温で一晩回転混和させます。中心下ゲルろ過を用いてクリックウイルスを精製します。スピンカラムをウイルス保存バッファーで平衡化します。脱酸素銅触媒シクロ付加反応はプローブの利用可能性が高まりますが、脱酸素雰囲気を維持するための専用装置が必要であるという欠点があります。銅触媒ライゲーションを行うには、まず、すべての反応材料および溶液を窒素グローブバッグ内で6時間脱気します。その後、反応を開始させるため、グローブバッグ内で銅(I)触媒ストック溶液を調製します。この銅ストック溶液1 µLを、ウイルスプローブとキレート剤を含む50 µLの溶液に加えます。グローブバッグ内で、ラベル化反応を一晩進行させます。ステップ4と同様に、ろ過による精製を行います。精製したクリック反応済みウイルスおよびライセートをサンプルバッファーに加え、10分間沸騰させます。選択したウイルスおよびコントロールをウェルにロードし、電気泳動を行います。蛍光プローブを光から保護するため、タンクはアルミホイルで覆ったままにしてください。1時間後、蛍光ゲルスキャナーを用いてゲルをスキャンします。無標識またはnon-I標識のウイルスは、HA標識を大幅に置換しないことに注意してください。高濃度のHAで産生されたウイルスは、HAの組み込み度が高いため、より強い蛍光標識を示します。また、糖標識ウイルスはファイバーカプシドタンパク質にのみaziタグを発現することに注意してください。細胞が80%Confluenceに達した時点から、azi標識による感染に2日間、標識ウイルスの回収および精製に5時間、クリック反応に一晩、そしてSDS page分析に2時間を要し、合計で3日半かかります。要約すると、2種類のazi標識法と2種類のazid alkinクリック化学反応が実証されました。目的した用途に応じて、最適な手法または手法の組み合わせを決定してください。本プロトコルで使用する材料はすべて市販されていますが、HAアセト糖およびINEプローブを自前で合成する方が大幅にコスト効率が良く、ウイルス表面の修飾においてより高い柔軟性が得られることがわかりました。

chemoselective-modification-viral-surfaces-via-bioorthogonal-click

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々のGPCRの様​​々な標的位置に非天然アミノ酸p-アジド-L-フェニルアラニンを遺伝的に符号化し、異なる用途におけるアジド基の汎用性を示している。これらは、GPCRのリガンド結合ポケットに残基を同定するために目標と光架橋技術、およびペプチドエピトープタグまたは蛍光プローブでのGPCRの部位特異的バイオ直交修飾を含む。...

遺伝的にコードされた分子プローブは、Gタンパク質共役受容体を研究する

我々は、順次、オンチップバイオ直交環化学と抗体抗原取り込みを使用して、低分子の急速な可逆固定化および表面プラズモン共鳴（SPR）の研究のための官能化ナノ粒子集合体のための手法を提案する。...

可逆小分子またはバイオセンサー応用のためのマルチコンポーネント構造を固定化するために、マイクロ流体オンチップキャプチャ - 環化反応

この方法は、リフトバレー熱ウイルス（RVFV）MP-12株による感染の後、宿主細胞転写の変化を測定するためにクリックケミストリーの使用を記載している。結果は、蛍光顕微鏡を介して、定性的に可視化またはフローサイトメトリーを介して定量的に得ることができる。この方法は、他のウイルスとの使用に適合可能である。...

宿主細胞のRNA合成でウイルス感染の効果を測定するためにクリックケミストリーを用いた

ここでは、アジド含有アミノ酸を遺伝的に取り込み、続いてアジドを分子プローブとカップリングすることにより、抗体フラグメントに化学プローブを部位特異的に導入するプロトコールを提示します。これは、ひずみ促進型アジド-アルキン環化付加(SPAAC)によるものです。...

ひずみ促進アジド - アルキン環付加することにより、効率的で部位特異的抗体ラベリング

我々 は、theranostic ナノ粒子 (HEVNP) として肝炎 E のウイルスのカプシド蛋白を設計しました。HEVNP 自己粘膜配信で安定した正二十面体のケージにアセンブルします。ここでは、表面に露出したシステインは、とりわけ腫瘍細胞を結合する配位子の合成を共役残基の変異を対象とした腫瘍に対する HEVNPs...

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

安易な蛍光アッセイであるアミノ アミノアシル tRNA-合成酵素/tRNA ペア哺乳類細胞で発現したタンパク質に非正規のアミノ酸 (ncAAs) を組み込むことの効率を評価する. します。サイトと bioorthogonal GPCR の生きているセルのラベルを連結する光橋マッピングを含む ncAAs の G タンパク質共役受容体 (Gpcr)...

光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

蛍光 dibromomaleimide と Qβ VLP のジスルフィドを匹敵する手順を紹介します。Dibromomaleimide と Qβ との共役反応 dibromomaleimide 機能分子の合成と精製 Qβ...

Dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロン ウイルス様粒子を抱合誘導を作る

ここで説明したプロトコル具体的に単純な化学によって選定されたサイトでアデノ ウイルスのカプシドを変更することも可能。 にします。シールド アデノ ウイルス粒子のベクトルし、ターゲット遺伝子の転送ベクトルを生成することができます、ベクトル...

シールドとターゲットの遺伝物質と化学キャプシドのアデノ ウイルスを用いた遺伝子導入ベクターの変更を組み合わせる

クリック可能な部分を持つモジュラーケージ化合物の光化学的特性の合成および測定のためのプロトコルが提示される。...

クリック可能なケージ化合物の設計、合成、光化学的特性

脂肪アシル化の研究は、細胞タンパク質相互作用および疾患において重要な意味を有する。ここでは、脂肪アシル化タンパク質のクリックケミストリー検出を改善するための修正プロトコルを示しており、これは様々な細胞タイプに適用し、パルスチェイスおよび質量分析を含む他のアッセイと組み合わせることができる。...

クリックケミストリーを用いた脂肪酸アシル化タンパク質の検出のためのアルキニル脂肪酸類似体の最適化された組み込み

ここでは、代謝オリゴ糖工学、クリックケミストリー、および増殖顕微鏡法を組み合わせたシンプルなプロトコールを提案し、日常的な顕微鏡装置を使用して細胞内シアル化...

Click Chemistry and Expansion Microscopyによる細胞内シアル化の可視化

学ぶバイオオルソゴナルクリックケミストリーを用いたアデノウイルス表面の化学選択的修飾法。蛍光プローブの結合とウイルス再設計技術を習得し、遺伝子治療やワクチン開発への応用可能性を理解できます。

Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾

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