Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾

本手順の全体的な目的は、クリックケミストリーを介してウイルス表面を再構築する柔軟な手法を実証することです。本手順の最初のステップでは、ヒト胚性腎細胞に5型アデノウイルスを感染させ、非天然アミノ酸であるホモアラニン、またはアセト糖であるN-アセトアセチルグルコサミンのいずれかの存在下でインキュベートします。2日後、アジド標識されたアデノウイルス粒子を回収し、精製します。

次に、これらの粒子の表面に蛍光プローブを結合させるために、化学選択的なアジド・アルキン環化付加反応を用います。書面によるプロトコルで説明している通り、これは歪み促進型または銅触媒によるアジド・アルキン環化付加反応のいずれか2つの結合方法を用いて行われます。

治療への応用において、これらの付着物はポリペプチド、ポリマー、または低分子化合物を含む場合があります。本実験では、蛍光プローブを用いて、カプシドタンパク質へのプローブのライゲーションをSDS-PAGEで実証します。特に治療、遺伝子導入、腫瘍治療、ワクチン技術の文脈において、ウイルスを遺伝子輸送担体として開発することに大きな関心が寄せられています。

このような背景から、治療的な組織標的免疫刺激に適切な特性を得るためには、ウイルスと宿主のインターフェースを調整することが特に重要となります。宿主とウイルスのインターフェースを調整するにあたっては、他にも多くの要因が重要です。そこで、私たちは2段階のラベル化プロトコルを開発しました。

最初のステップは、非天然アミノ酸または非天然糖の代謝的導入です。これによりアンカーポイントを設置でき、その後、非常に選択性の高い化学反応を用いてさらに精緻化することが可能です。これにより、ウイルスの感染能や全体的な適応度を著しく損なうことなく、実質的に任意の機能をウイルスに付加できます。これは克服すべき大きな障壁となります。フード内と実験器具を滅菌した後、37 °CのHEK増殖培地で維持されているHEK 293細胞の100 mm培養皿を11枚準備します。

細胞培養が80〜90%コンフルエントになったら、ディッシュの1つから増殖培地を除去し、TDバッファーで1回洗浄します。1 mLのトリプシンEDTAで細胞を剥離させ、1分間インキュベートします。9 mLの増殖培地を加え、このディッシュで回収された細胞数をカウントします。

ヘモサイトメーターを用いて、残りの10枚の培養皿それぞれで感染に必要なアデノウイルス粒子の数を算出します。成長培地をゆっくりと除去し、5 mLのTDバッファーで洗浄します。1 mLの感染バッファーを加え、この期間中に1時間インキュベートします。

感染後、15分ごとにディッシュを左右に穏やかに揺らします。各ディッシュにHEK成長培地を9 mL慎重に加え、さらに18時間インキュベートします。システイン中のHA高濃度ストック溶液から。

記載されたプロトコルに従ってHAラベル化培地を調製します。まず、これらのストック溶液を0.2 µmのシリンジフィルターでろ過してください。コントロール用のメチオニンストック溶液も同様に滅菌します。その後、培地を慎重に除去し、各培養皿を5 mLのTDバッファーで洗浄します。

これを10 millilitersのHA標識培地と交換し、感染させた細胞をさらに6時間インキュベートします。これにより、メチオニン不在下かつazo homo alanine存在下でウイルスキャプシドタンパク質が翻訳されます。標識培地を注意深く10 millilitersの新鮮な増殖培地と交換し、さらに18時間インキュベートします。

このステップを完了した後、ビデオのステップ3にある精製手順に進んでください。あるいは、非天然アミノ酸のa HAの代わりに、aziを含む糖を用いてaziタグを導入することも可能です。本プロトコルでは、UDPN Acetoacetyl Glucosamineの代謝前駆体である寄生虫関連のn acetoacetyl galactoを用い、このaceto sugar存在下で培養します。

糖鎖ラベル化を行うため、5型アデノウイルスではファイバー部分にのみアジド基を提示させます。まず、ビデオのステップ1を画面上の指示が出るまで進めてください。これは、書面によるプロトコルのステップ1.5に相当します。

まず、ATO糖ストック溶液100 µLをファルコンチューブにピペッティングし、メタノールを蒸発させて糖標識溶液を調製します。次に、HEK増殖培地100 mLを加えます。各ディッシュの細胞にこの糖標識培地を10 mLずつ加え、37 °Cで44時間インキュベートします。

精製のため、ステップ3に進みます。培養皿から感染細胞を含む培地を2本のコニカルチューブに移し、4°Cで2000 G、10分間遠心分離します。

上清を除去し、37°Cのウォーターバスと液体窒素を用いて、各ペレットを4 mLのTDバッファーで再懸濁します。凍結融解サイクルを3回繰り返し、感染細胞を溶解させます。各サイクルの間に、ボルテックスミキサーで懸濁液を混合してください。

融解懸濁液を2000 Gで10分間遠心分離して細胞残渣を沈殿させます。ステップ1の感染に使用したアデノウイルスにはGFP導入遺伝子が含まれており、この段階での蛍光活性により、ウイルスDNAの導入と発現が確認されます。1.25 g/mLから1.4 g/mLの塩化セシウム密度勾配を慎重に調製します。溶菌細胞上清を密度勾配の上にピペッティングし、15 °Cで126,000 Gにて1時間遠心分離します。

遠心分離後、遠心管内に厚い幅広のバンドが確認できるはずです。これがazi修飾ウイルスです。スターL針を用いて管の底部を穿刺し、内容物を一滴ずつ慎重に滴下させて、このウイルスを回収してください。

2つのライゲーション方法のバンドによって、ストレインが実証されました。ストレイン促進ルートは、より簡便な反応条件で進行しますが、ストレイン促進ライゲーションを行うための市販プローブの選択肢が限られているという欠点があります。ウイルス保存バッファー中のアジド修飾ウイルス50 µLに、Tamara BCN標識溶液0.25 µLを混合し、チューブの底をタッピングして混ぜ合わせ、ホイルで蓋をして室温で一晩回転混和させます。

中心下ゲルろ過を用いてクリックウイルスを精製します。スピンカラムをウイルス保存バッファーで平衡化します。脱酸素銅触媒シクロ付加反応はプローブの利用可能性が高まりますが、脱酸素雰囲気を維持するための専用装置が必要であるという欠点があります。

銅触媒ライゲーションを行うには、まず、すべての反応材料および溶液を窒素グローブバッグ内で6時間脱気します。その後、反応を開始させるため、グローブバッグ内で銅(I)触媒ストック溶液を調製します。この銅ストック溶液1 µLを、ウイルスプローブとキレート剤を含む50 µLの溶液に加えます。

グローブバッグ内で、ラベル化反応を一晩進行させます。ステップ4と同様に、ろ過による精製を行います。精製したクリック反応済みウイルスおよびライセートをサンプルバッファーに加え、10分間沸騰させます。

選択したウイルスおよびコントロールをウェルにロードし、電気泳動を行います。蛍光プローブを光から保護するため、タンクはアルミホイルで覆ったままにしてください。1時間後、蛍光ゲルスキャナーを用いてゲルをスキャンします。

無標識またはnon-I標識のウイルスは、HA標識を大幅に置換しないことに注意してください。高濃度のHAで産生されたウイルスは、HAの組み込み度が高いため、より強い蛍光標識を示します。また、糖標識ウイルスはファイバーカプシドタンパク質にのみaziタグを発現することに注意してください。細胞が80%Confluenceに達した時点から、azi標識による感染に2日間、標識ウイルスの回収および精製に5時間、クリック反応に一晩、そしてSDS page分析に2時間を要し、合計で3日半かかります。要約すると、2種類のazi標識法と2種類のazid alkinクリック化学反応が実証されました。

目的した用途に応じて、最適な手法または手法の組み合わせを決定してください。本プロトコルで使用する材料はすべて市販されていますが、HAアセト糖およびINEプローブを自前で合成する方が大幅にコスト効率が良く、ウイルス表面の修飾においてより高い柔軟性が得られることがわかりました。