Name: 遺伝的に定義された神経回路のトレースウイルス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 学ぶTVA受容体特異性を用いたトランスシナプティックウイルス法による中枢神経系の神経回路解析。このハイスループット技術はシナプス結合ニューロンのトレースと既知の微小回路の検証を可能にし、神経科学における神経回路網の理解を深める。

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我々は、技術支援のための組換えVSVの変種を救出の支援のためのショーン·ウィーラン、とDIDEMゴズとライアンChrenekを承認したいと思います。この作品はハワードヒューズ（CLC）、および＃NS068012-01（KTB）によってサポートされていました。

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

神経回路を研究するためにウイルスを使用すると、接続されたニューロンの分析の比較的ハイスループットな方法である。しかし、VSVとRABVビリオンの両方を生成することは簡単ではありません。 cDNAからウイルスを救出するために、上記のプロトコルが用意されていますが、それはまだ低確率イベントです。 N、P、およびLプラスミドのそれぞれのレベルは細かく調整する必要があり、多くの試練とは、ウイルス複製し救助を確保するために実行する必要があります。フルVSVのゲノムRNAを組み込んリボ粒子の形成は、低確率事象であるため、いくつかの試みがかかる場合があります。この手法は、最適化のための時間を必要とするかもしれない、しかし、一度それがウイルスを救出するがはるかに簡単ですが、最適化されています。 RGCの樹アーバー（ すなわち、 図 4A）、重複していないときに、個々のRGCからウイルス伝播の分析は、最善に行われます。ウイルス注入し、注入座標の量が最適な感染症のために調整することができます。また、t彼は注射の場所は、標識されたR...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;組織培養&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>ベビーハムスター腎臓 (BSRT7) 細胞</td><td>要望に応じて提供可能</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ワクシニアウイルス (vTF7-3)</td><td>要望に応じて提供可能</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pN, pP, pl プラスミド</td><td>要望に応じて提供可能</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T 細胞</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>60 mm TC処理済み培養ディッシュ</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 通気性キャップ付き矩形傾斜ネック細胞培養フラスコ</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>培地：DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES pH 7.4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS：ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2,000 トランスフェクション試薬</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ：5 ml ルアーロックシリンジ</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI：高活性線状PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;ウイルス遠心分離&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Corning 150 ml チューブトップ真空フィルターシステム、孔径 0.45 &amp;mu;m</td><td>Corning</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>薄壁、超高透明、38.5 ml、25 x 89 mm 超遠心機用チューブ</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>超遠心機</td><td>Beckman-Coulter</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>SW28 超遠心機用ローター</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;マウスへの注入&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>キャピラリーマイクロピペット</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>脳定位固定装置</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>UMP インジェクター</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>4チャンネルマイクロコントローラー</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>M.TXB ベンチモーター (C.EMX-1 ダイヤル制御、115 V)</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>H.10 ハンドピース (クイックチェンジ)</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>ステップドリル (0.5 mm)</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ&amp;#8211;電極ホルダー</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>1 ml シリンジ</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30ゲージ注入針</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>眼保護用軟膏</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ素</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;手術および解剖器具&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>標準ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>微細ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannasバネ式はさみ</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>メスハンドル</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>メス刃</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸</td><td>Robbins Instruments</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;解剖および抗体染色&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ドンキー血清</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>抗体</td><td>millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP抗体</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>ドンキー抗ニワトリ Dylight 488 抗体</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>ドンキー抗ニワトリ Alexa Fluor 647 抗体</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;組織のマウント&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Superfrost plus 顕微鏡スライドグラス</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス 22 x 22, 厚さ 0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>シリコンエラストマー</td><td>Rogers Corp</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>透明マニキュア</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold 退色防止試薬</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

遺伝的に定義された神経回路のトレースウイルス

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

神経回路を研究するための古典的な方法は、かなり低いスループットです。特に経シナプスウイルス、仮性（PRV）と狂犬病ウイルス（RABV）、そして最近では、水疱性口内炎ウイルス（VSV）、回路を研究するために、ますます人気が高まっています。これらのより高いスループット方法は順行性または逆行どちらの方向でもニューロン間の送信、ウイルスを使用しています。 最近では、単シナプス逆行トレースのために修飾されたRABVが開発されました。 （ 図1A）。この方法では、糖タンパク質（G）遺伝子はウイルスゲノムから削除され、標的ニューロンでのみ補給。感染特異性はASLV-糖タンパク質と正常RABV-G1用RABV-G（/ RG）の細胞質ドメインの細胞外ドメインから成るキメラGを代入することによって達成される。このキメラGは具体的にTVAの受容体1を発現している細胞に感染します。をコードする遺伝子TVAはdきできます様々な方法で2月8日 elivered。 TVA発現ニューロンのRABV-Gの感染後、RABVはTVAの受容体との共同配信された、独自のGの性質によって逆方向に他の、シナプス接続されたニューロンに信号を送ることができます。この手法は、定義されたスターター細胞型へのすべての入力のサンプリングを提供し、定義された細胞型への入力の数が比較的多い（5-10％）2にラベルを付けます 。 我々は最近、経シナプストレーサー9としてVSVを使用するには、この手法を変更しました。 VSVのは、遺伝子発現の迅速性など、いくつかの利点があります。ここでは、詳細解像度を上げると超小型回路をプロービングするための有用なVSVを使用して、新しいウイルストレースシステムを。ウィッカーシャムらによるオリジナルの公表戦略。4 Whileとバイエルら TVA発現細胞に感染した当初は上に任意のニューロンと、そのプロジェクトの9許可の標識は、ここにVSVをテレビにのみ送信するように設計されました発現細胞（ 図1B）。ウイルスは最初TVA発現ニューロンのニューロンの下流の感染を可能にするためにRABV-Gでシューされています。細胞のこの第一の集団を感染させた後、リリースされたウイルスは、TVA-発現細胞に感染することができます。経シナプスウイルスの拡散がTVA発現細胞に限られているため、定義された種類の細胞からの接続の有無の存在は、高分解能で調べることができます。これらの実験の実験のフローチャートを図2に示します。ここでは、マウス網膜で方向選択性のあること、モデル回路を示しています。我々は、網膜神経節細胞に星形アマクリン細胞（SACの）（のRGC）の接続性を検証する。

シナプス接続されたニューロンをトレースする方法が記載されている。我々は、目的の細胞集団は遺伝的に定義された種類の細胞からシナプス入力を受け取るかどうかを調べるために上流の細胞のTVAの特異性を利用する。

神経回路を研究するための古典的な手法は、スループットがかなり低い。経シナプス性ウイルス、特に偽狂犬病ウイルス（PRV）や狂犬病ウイルスは...

本実験の全体的な目的は、中枢神経系における微小回路を解析するための新しい手法を開発することです。まず、TVA受容体を発現させることで、感染させるニューロン集団を定義します。次に、トランスシナプスウイルスをCNSに注入し、選択した一次ニューロンに感染させます。次に、ウイルスはTVA受容体を発現している接続ニューロンへのみ、経シナプス的に伝播します。これらのニューロンが接続されているかを確認するため、既知の接続マイクロ回路の標識検証に基づき、本手法がマイクロ回路の解析に利用可能であることを示す結果を得ます。電生理学や顕微鏡観察などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、神経回路を解析するためのハイスループットな手法であることです。この手法のアイデアは、Wickershamらによるモノシナプス制限的ウイルス追跡に関する最初の研究を読んだ際に得たものです。ウイルスをさらに工学的に設計することで、接続されたニューロンを斬新な方法で研究できると考えました。継代用の細胞を作成するために、VACCINIA T7システムを用いてCD NAからVSVを回収する方法の詳細については、記述プロトコルをご参照ください。まず、前日に播種したコンフルエンス80%のTV-H1細胞（10 cmプレート4枚）から培地を吸引し、5 mLのサプリメントなしDMEMに交換します。標準的な手順に従い、任意の糖タンパク質をコードするプラスミド5 µgを各プレートにトランスフェクションします。トランスフェクションから約6時間後、培地を10% FBS添加DMEMに交換し、糖タンパク質の発現と表面への蓄積を促すため、34 °C、5% CO₂に設定した組織培養インキュベーターでプレートを一晩インキュベートします。インキュベーション後、培地を吸引して除去し、10%FBS添加DMEM 5 mLに置換します。次に、MA rabies Gキメラ糖タンパク質を含むVSVを感染多重度（MOI）0.01〜0.1で各プレートに感染させ、34 °Cで一晩インキュベートします。24時間後、蛍光顕微鏡を用いて各プレートの感染レベルを確認します。50%以上の細胞が感染していた場合、培地を回収します。5 mLの新鮮な培地と交換し、回収した培地を-80°Cで凍結させます。その後、24時間おきに回収手順を3日間繰り返し、計4日間の回収を行います。最後の分画が-80°Cで完全に凍結した後、回収した培地の各分画を凍結させます。この時点で、回収した培地はすべて37°Cで保持されており、合計で80 mLの回収培地が得られているはずです。回収した培地を氷上で0.45 µmフィルターでろ過します。次に、36 millilitersのウイルスをBeckman遠心管に分注し、4 °Cで80,000 ×gで90分間超至高速遠心して上清を濃縮します。遠心後、10%漂白剤を入れたビーカーに回収し、アスピレーターを用いてチューブの側面から液体を除去してください。その際、ローターが適切にバランスされていることを確認してください。次に、ウイルスを含むチューブを4 °Cで120 RPMで1時間振盪させ、ウイルスペレットを可能な限り最小の容量（通常は30 µL程度）で再懸濁させます。ウイルスを再懸濁した後、2 9 3 T細胞を播種した24ウェルプレートに、10倍段階希釈系列（1から100万倍まで）でウイルスを感染させ、感染から約2日後にタイターを測定します。標準的な手順に従い、ウイルス感染細胞は蛍光によって検出可能です。これらの実験において、適切な細胞株を使用することが重要です。目的は、マッピングしたい細胞型にTVA受容体を発現させることです。これは、ウイルスを用いたTVA受容体の発現、あるいはトランスジェニックアレルを通じて達成できます。本実験では、6～10週齢のトリプル・トランスジェニックマウスを使用します。条件付きTVAアレルを発現するマウスを、chat-Creアレルを発現するマウスと交配させます。次に、これらのマウスを蛍光TD tomatoアレルを発現する系統と交配させます。最終的な遺伝子組換えマウスは、目的とするスターバーストオミクロン細胞を含む、Creを発現するすべての細胞においてTVAおよび条件付きTD tomatoアレルを発現します。そして、この発現は蛍光顕微鏡を用いて視覚化できます。マウス脳アトラスで目的領域の立体定位座標を確認し、マイクロインジェクターコントローラーの電源を入れてプランジャーと電極ホルダーを所定の位置に移動させ、立体定位装置を準備します。次に、ウイルスとのインターフェースを確保するためにニードルにミネラルオイルをバックフィルし、ニードル内に気泡がないことを確認しながらプランジャーにニードルを装着します。ウイルスを解凍し、氷上に置きます。マイクロインジェクターを吸引設定にし、ウイルスの入ったチューブをマイクロインジェクターのキャピラリーの下に移動させます。キャピラリーの先端をウイルス液中に浸し、実験に必要な量のウイルスを吸引します。術前にブプレノルフィンを投与した後、施設基準に従って動物に適切に麻酔を施します。足指を挟むピンチテストを行い、反射反応がないことを確認します。処置を開始する前に。麻酔をかけたマウスを、位置調整用の可動式スタンドに設置したヒーティングパッドの上に置きます。動物が麻酔下にある間の角膜の乾燥を防ぐため、眼軟膏を塗布します。次に、耳棒を外耳道にゆっくりと挿入し、マウスを脳定位固定装置に固定します。頭部が実体顕微鏡のベースと平行であり、側方に動かないことを確認します。次に、バイトバーを調整して頭部の固定を補助します。切開部位の被毛を除去します。次に、この領域をエタノールで3回洗浄し、続いてヨードで3回洗浄します。鋏で皮膚に正中切開を加え、頭蓋骨を露出させた後、自作の外科用鉤で皮膚を押し戻します。その後、bgmaを用いてマイクロキャピラリーを固定し、ダイヤルを操作してマイクロインジェクターを外側遺伝子核の座標まで移動させます。LGNの位置を特定したら、注入部位の上の頭蓋骨に小さな穴を開けます。毛細管を穴の上に配置し、脳表面の直背側までゆっくりと下げます。ここが背腹座標のゼロ点となります。マイクロキャピラリーは、マウスの硬膜を貫通させるのに十分な鋭さである必要があります。そのため、ゆっくりと2.75 mmの深さまで降ろし、約100 µL/minの速度で必要な量のウイルスを注入します。ウイルスの注入部位からの拡散を促し、またウイルスが針を伝って逆流するのを防ぐため、針を約7分間脳内に留めておきます。その後、2分間かけて非常にゆっくりと、注入部位から針を抜き、脳外へ取り出します。最後に、手術部位を縫合し、動物が麻酔から回復するまで観察します。ブプレノルフィンを12時間ごとに2日間投与します。一般的に、VSVの経シナプス伝播は注射後約24時間で観察されます。ただし、待機時間を長くすることで、より広範囲に伝播します。二酸化炭素吸入によりマウスを安楽死させた後、眼球を摘出して4% formaldehydeに入れ、眼球が完全に浸った状態で1時間インキュベートします。その後、眼球をPBSを含むペトリ皿に移します。55番ピンセットを用いて角膜を速やかに除去し、網膜を他の組織から緩めて切り出します。ホールマウント解析を行います。網膜をガラススライド上で切り、平らに広げます。ガラススライドカバーの端にシリコンスペーサーを配置し、ゴールド封入剤を用いて固定した後、網膜切片の解析のために厚さゼロのガラスカバーガラスでカバーします。網膜が完全に浸るまで、PBSで調製した30% sucrose溶液に浸します。次に、網膜をOCTと30% sucrose溶液を1:1の割合で混合した液に3時間浸します。最後に、網膜を急速凍結し、切片作成まで-80°Cで保存します。この画像は、vsv A/rgによるTVA 800細胞および2 9 3 T細胞の感染性を実証するタイムコース実験を示しています。上段のパネルは、感染から6時間後、1日後、および2日後のTVA 800細胞を示しています。下段のパネルは、同じ時点における2 9 3 T細胞を示しています。ウイルスはTVA発現細胞間では数時間で広がりますが、TVA受容体を発現していない2 9 3 T細胞における広がりは、起こってはいるものの、はるかに緩やかです。スケールバーは100 micronsを表しています。この画像は、TVAを発現していないマウスの網膜神経節細胞における代表的な感染を示しています。動物のLGNにvsv A slash RGウイルスを注入しました。R-A-B-V-Gで擬似型化し、注入の2日後に組織を採取した。ここではまばらな感染が見られ、黄色い矢印で網膜神経節細胞が示されている。この画像では、より高密度の感染が示されている。これは、ここに見られるように、ウイルスの高いTI（感染価）と高品質な注入によって達成できます。小樹状神経節細胞、タイプ1メラノプシン神経節細胞、方向選択性神経節細胞（DS GCs）、およびオンオフDS GCsを含む、形態に基づく異なる種類の網膜神経節細胞を特定することが可能です。ここでは、TVA発現マウスからの以下の画像に示されている通り、スケールバーは50 micronsを表しています。on-off DS GCからStarburst omicsへのVSVA/RGの伝播は、予想通りのパターンを示しています。白い矢印頭で示され、緑色に塗りつぶされたon-off DS GCは、黄色い矢印頭で示される複数のStarburst omicsにウイルスを伝播させています。ここで、DS GCではないすべての緑色細胞がCreeレポーターと共染色されており、それらがTVAを発現しているStarburst omicsであることがわかります。緑色の塗りつぶしがある白い矢印で示されるDS GCと、黄色の矢印で示されるStarburst オミクロンは、網膜内網状層（IPL）の適切なチャット層を層別化しており、ウイルスが伝達される細胞にはonおよびoffの両方が含まれます。Starburst オミクロン。この図の数字はIPLの層を示しています。一度習得すれば、適切に実施することで全実験を1〜2日で完了させることができます。VSVの速度はこの手順における大きな利点の一つです。ウイルスによる回路追跡の検証およびシナプス接続の特性を分析するために、Channel Redやオプシンベースの回路マッピングなどの他の手法を用いることができます。このビデオを視聴することで、ウイルスの培養から生体内（in vivo）への注入、そして蛍光標識されたニューロンの解析に至るまで、ウイルス回路追跡に含まれるほとんどの異なるステップについて十分に理解できるはずです。

viral-tracing-of-genetically-defined-neural-circuitry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、トレーサーを提供するための実用的なガイドを提供...

マルチカラーで神経回路の地形を明らかにし

コレラ毒素とビオチン化デキストランアミン二重標識が続く仮性狂犬病ウイルスとペリフェラルターゲットからトレース経シナプス

二元的な遺伝的戦略を利用して、Creを介した組換え後に相補的な経シナプストレーサーを発現するマウスの神経回路トレースのための詳細なプロトコルを提供します。細胞特異的トレーサー産生は遺伝的にコードされているため、私たちの実験的アプローチは、マウス胚の脳発生中の神経回路の形成と成熟を単一細胞分解能で研究するのに適しています。...

マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス

ここでは、神経幹細胞および/またはそれらに隣接する上衣細胞の長期的な遺伝子改変のためのレンチウイルス粒子の使用に基づく手順を、成体の心室-心室下神経原性ニッチにおける長期的な遺伝子組み換えのために説明すると、神経幹細胞に対する細胞の自律的および非自律的な、ニッチ依存性の影響を別々に分析することができます。...

神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

我々は、in vitroでの調製物を用いて脳核に順行性または逆行性トレーサー注射を介して、神経細胞とそのプロセスを標識する技術が記載されています。我々 は 、nラベリング精度を高めるために、蛍光標識されたマウスの変異体および基本光学機器を利用して、トレーサーエレクトロ体 ​​外 I既存の方法を変更しました。...

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

このプロトコルは、選択的ニューロン集団の大規模な再構成を説明し、蛍光マーカーを発現する修正された狂犬病ウイルス、および独立した、公平なクラスタとラベルされた次の逆行性感染症は、それが明確なニューロンのサブクラス間の形態学的評価指標の包括的な特性評価を可能に分析します。...

大規模な再建と選択的集団のニューロンを分類するために形態学的指標に基づいて独立、不偏クラスタリング

神経前駆体のインビトロレンチウイルス工学、野生型脳への共同移植、および「テスト」および「コントロール」誘導体の対対モルモメトリック評価に基づいて、この方法は、新生児の生体内遺伝子制御における正確なモデリングを可能にするシンプルで手頃な方法でニューロン形態。...

生化神経建築研究における工学的神経前駆体の脳内移植

このプロトコルは、脳内のAAVベースのウイルスシステムとFLEXシナプシン駆動GFPレポーターを使用して、生体内で直接再プログラムされたインターニューロンを生成することを目的としており、生体内での細胞同定とさらなる分析を可能にします。...

ウイルスベクターの脳内注射によるインビボグリア細胞のインターニューロンへの直接リプログラミング

現在のプロトコルは、海馬への腹側テグメンタル領域(VTA)グルタミン酸突起をトレースするための簡単な方法を示しています。VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激をCA1記録と組み合わせて、VTAグルタミン酸末端が生体内での推定ピラミッド発火率を調節する方法を示した。...

海馬の腹側テグメンタル領域グルタミン酸末端のインビボ解剖学的および機能的なトレース

ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。...

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

学ぶTVA受容体特異性を用いたトランスシナプティックウイルス法による中枢神経系の神経回路解析。このハイスループット技術はシナプス結合ニューロンのトレースと既知の微小回路の検証を可能にし、神経科学における神経回路網の理解を深める。

遺伝的に定義された神経回路のトレースウイルス

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