胚におけるプログラム細胞死を検出するためのLysoTrackerの使用は、胚性幹細胞を分化

次の手順の目的は、マウス胚と分化した幹細胞の2種類のサンプルのリソソームをlyo tracker色素で維持し、細胞死のパターンを検出する方法を実証することです。胚サンプルを調製するために、まず胚を外科的に単離し、皿に入れて分化した細胞を調製します。胚性幹細胞は、胚体を作るために使用されます。

これらの胚体は懸濁液中で培養され、チャンバースライド上で単層として成長します。胚はすべて単層を販売しており、OTトラッカーレッドでインキュベートでき、すすぎ、固定サンプルを撮影して、Liso Trackerを示す染色結果が得られ、定量化して調べることができます。染色は、胚や培養細胞のプログラム細胞死をアッセイするために使用できる簡単な手順です。

トンネル解析などの既存の手法と比較した場合、この手法の主な利点は、OTトラッカー色素が低分子であるため、厚い組織を迅速かつ容易にアッセイできることです。この方法は、マウス胚や分化培養におけるプログラム細胞死のパターンに関する洞察を得ることができますが、ニワトリ胚や分化成体幹細胞などの他の組織タイプにも適用できます。若い雌マウスをスタッドオスとペアにし、翌朝、交配が発生したことを示す膣栓を確認します。

膣栓が出現した日の正午は、実質的に0.5日です。関心のある胚の日にcotusを投稿し、承認されたプロトコルに従って女性を安楽死させ、ハンクのBSSで子宮を10センチメートルのシャーレに取り出し、血液を洗い流します。胚を分離し、子宮から取り出します。

余分な胚膜を取り除き、ハンクのBSSで少なくとも1回すすぎを行って、余分な組織と血液を取り除きます。解剖した胚を氷の上に置いて清掃します。その他。

5ミリリットルのLisoトラッカー胚染色液を調製します。これは、1つまたは2つの胚コレクションに十分な量です。溶液を穏やかに混合して色素を分散させ、次に胚を溶液に移し、摂氏37度で45分間インキュベートします。

インキュベーション後、ハンクのBSSで胚を4回、各洗浄で5分間穏やかにすすいでください。組織を傷つけないように、やさしくすすぎを行うことが重要です。繊細な胚がどこにあるかにゆっくりと細心の注意を払いながら、液体を取り除き、常に液体の一部を残してそれらを覆います。

次に、翌日、胚を4%パラホルムアルデヒドで一晩固定します。胚をハンクのBSSで10分間一度すすぎ、固定剤を取り除きます。次に、メタノールシリーズを介して組織を脱水し、バックグラウンド染色を排除します。

このステップにより、保存前のイメージング中のS/N比が向上します。必要に応じて、遺伝子解析のために各胚から組織サンプルを採取します。その後、ジェノタイピングの前に組織サンプルを再水和します。

胚を組織サンプルに一致するラベル付きの個々のチューブに分離します。現在では、単離した胚をマイナス20°Cのメタノールに無期限に保存することが可能になりました。光から保護されています。

まず、ハンギングドロップ法で胚体を調製します。3日後に20マイクロリットルの液滴あたり500細胞の開始密度で、胚体を10センチメートルの非接着性ペトリ皿上の懸濁培養に移します。それらを5日間培養し、5日後には2日ごとにメディアを交換します。

胚体をゼラチン化した8つのチャンバースライドに移し、各チャンバーに1つまたは2つの胚体を配置します。胚体をさらに10日間培養します。10日後に1日おきに培地を交換し、既存の培地を穏やかに吸引し、各チャンバーに300マイクロリットルのLyoトラッカー細胞染色溶液を加えます。

手動でメディアをピペットで取り出すように注意し、ピペットチップをチャンバーの隅に置きます。このように、誤ってガラス表面からすべてのボディを取り付けたまま、誤って取り外すことはありません。メディアを再度追加するときは、ピペットチップをチャンバーの隅に置き、メディアを非常にゆっくりと追加します。

チャンバーを摂氏37度で15分間インキュベートします。次に、すすぎごとにDPBSで5分間2回すすぎます。次に、細胞を4%パラアルデヒドに室温で15分間固定します。

次に、DPBSで固定剤を5分間のすすぎを2回で取り除きます。胚をマウントするには、胚を深いくぼみのスライドガラスまたは小さなペトリ皿感染シールドに入れます。DPBSを吸引して、顕微鏡用の細胞サンプルを調製します。

チャンバーをスライドから取り外し、約5分間風乾させます。フルーロを保護するためにホイルで覆います。次に、ダッピー付きベクターシールドなどの水性封入剤を加え、その上にカバースリップを載せます。

これでスライドが取り付けられ、イメージングの準備が整いました。ロッド、ドミン、またはテキサスレッドフィルターを装備した解剖顕微鏡または複合顕微鏡でサンプルを視覚化します。染色は通常非常に明るいため、マニュアルモードでは通常、長時間露光は必要ありません。

同じ露光条件下ですべてのサンプルのデジタル写真を撮ります。画像を定量化するには、Adobe Photoshopまたは同様のイメージングプログラムで画像を開きます。lyoトラッカーの染色量を決定するには、赤色のチャンネルを選択します。

ヒストグラム機能によって明らかになる画像全体のピクセル数に注意してください。次のしきい値は、赤い染色が白いピクセルで表されるような画像です。これにより、画像が白黒に変換されます。

しきい値レベルを選択し、セット内のすべての画像にこのレベルを使用します。色範囲ツールを使用して白いピクセルを選択し、ヒストグラム機能を使用して合計白いピクセル数を取得します。青色のチャンネルを使用して、フィールド内の原子核の数をカウントします。

画像に注釈を付けてカウントを記録し、値を記録し、それらを使用して細胞あたりの平均染色レベルを計算すると便利です。残りのすべての画像に対して同じしきい値設定でこの分析を繰り返します。サンプルとして、ソニックヘッジホッグ変異体胚を染色するためにlyoトラッカーを使用しました。

ly Oトラッカーは、全胚のミーンの奥深くにある小さくて拡散性の高い分子領域であるため、コタスプログラム細胞死またはPCGの10.5日後に染色されたため、ソニックヘッジホッグのヌルミュータント胚、特に四肢で大幅に増加しました。四肢のつぼみをホールマウントに高倍率で画像化し、全体的なパターンを評価しました。解剖された部分も振動するマイクロトーンで切片化されました。

矢印は、これらのスライスでOT Trackerと組み合わせて使用 されたクライオスタットトンネル染色で得られた切片のソニックヘッジホッグヌル遠位先端の染色の増加を示していますが、lyo Tracker とトンネル染色との間に厳密な 1 対 1 の相関関係はありませんが、PCD の一般的な領域は高倍率でかなり重なります。トンネルアッセイで陽性と染色された穿刺は見られますが、ライラダイだけで染色が確定するオトラダイ穿刺や、染色が重なった穿刺は観察できません。胚体培養の10日後、細胞はニューロン、筋肉細胞、心筋細胞など、さまざまな細胞タイプに分化しました。

分化したES細胞の正常な培養では、lyo trackerおよびtunnel assaysで検出されるPCDを受けた細胞がいくつかあります。次に、細胞を過酸化水素で処理して、酸化ストレス細胞死を誘導しました。低用量の過酸化水素は、無治療と比較して、lyoトラッカーとトンネル染色の両方を増加させました。

胚での結果と同様に、両方の染色が共通の細胞と固有の細胞を標識しました。高用量の過酸化水素は、細胞の縮小と、より広範なOTトラッカーとトンネル陽性をもたらしました。比較のために、血清飢餓状態を1時間後にオートファジーを誘導するために血清飢餓法を用いた。

OTトラッカーの染色が増加しました。しかし、トンネル陽性率は正常なレベルにとどまっていました。したがって、reerは簡単で有用ですが、サンプルを定量した後で、染色がアポトーシスまたはオートファジーを表しているかどうかを判断するために、追加のアッセイでフォローアップすることが重要です。

先に示した単純なPhotoshopの方法を使用して、過酸化水素の濃度を上げるとlysトラッカー染色のレベルが高くなることが結果として確認されました。細胞死の種類を確認するために、NX in fiveまたはlc three免疫染色などの他の方法を実施することができます。現在、Trecker greenは生細胞にしか機能しないため、固定が必要なサンプルにはReca redが最適な選択肢であることを忘れないでください。