Name: 3次元樹脂鋳造およびマウスの門脈や肝内胆管系の結 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学ぶマウスの門脈や肝内胆管系の3次元樹脂鋳造法。カニューレーション、樹脂注入、組織透明化の手順で、血管構造の立体可視化と定量化を可能にし、血管生物学研究に応用できる。

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この作品は、分子医学におけるHHMI /バンダービルト大学の証明書プログラムを通じてハワードヒューズ医学研究所（HHMI）からTJWにSSHで接続するには、米国立衛生研究所（NIH）からの助成金（R01-DK078640）、（GRDOT56006779）によってサポートされていましたバンダービルト糖尿病研究·研修センター（P30〜DK020593）とコア·サービスを提供するバンダービルト消化器病研究センター（P30〜DK058404）。

1。カニューレを準備<ol><li>指先でPE10チューブの1インチの長いセクションを温めるとチューブが薄くなるように、それを伸ばす。 注意：カニューレを挿入する血管やダクトのサイズが必要なストレッチの度合いを決定します。カニューレを胆管キャストのためによく伸ばさなければなりませんが、適度に大きい門脈内に収まるように延伸することが必要になることがあります。 </li><li>ベベルチップを生成するために対角線で延伸チューブをカットします。 </li><li> 5から6インチのセグメントを作成するためにチューブのもう一方の端をカットします。 </li><li>チューブの非傾斜端に32ゲージ、½インチの皮下注射針を挿入します。 </li></ol> 2。 PBSでシリンジを準備<ol><li> PBSで3ミリリットル注射器を埋める。 </li><li>先に調製したPE10チューブを引っ張っ添付で注射針にシリンジをねじ込みます。 </li><li>フリックシリンジとプッシュシリンジプランジャPBSは針やチューブを埋めていることを保証し、シリンジ内に気泡がありません。 </li><li>粘土から出状シリンジホルダにPBSを用いてプリペアドシリンジを置きます。チューブがダクト内に挿入されながら、このホルダーは、注射器を安定に保つでしょう。 </li></ol> 3。他のセット·アップ<ol><li>小さ ​​な容器、 例えば 、24ウェルプレートのウェル1に触媒0.1gを計量する。 </li><li> 3ミリリットル注射器に1ミリリットル樹脂を引き出します。 注意：触媒と樹脂の相対量は、硬化時間を変更するように調整することができる。触媒05の量を減少させる一方、鋳造収縮を増加させ、あまり望ましくキャストにつながる。 注：樹脂を取り扱う際に、樹脂ヒュームの樹脂または吸入との接触を避けるための予防措置を取る。常に手袋を着用し、そのような化学ヒュームフードなど換気の良い場所で樹脂を含む手順を実行します。 </li><li>字として使用される約5インチの5.0絹縫合糸の部分を切り取ります。 </li></ol> 4。マウスを準備<ol&gt; <li>成体マウスを生け贄に捧げる。その裏にマウスを置き、腹腔を開く。 </li><li>スコーププラットフォームを解剖にマウスを置きます。肝臓への可視性とアクセス可能性を高めるためにマウスの下に垂直に15 mlコニカルチューブを置きます。 </li><li> PBSで綿棒を湿らせ、肝門脈または総胆管と一緒に肝臓の背部ビューを公開することから上方に離れて肝臓を反転するためにそれを使用。 </li><li>門脈キャストでは、室温でPBSで静脈をフラッシュすることによって血液凝固を防ぐことができます。 PBSで満たされた3 mlの注射器に針を取り付け、限りすることができますように、肝臓から肝門静脈に針を挿入します。そっと門脈を介してPBSを押してください。血液を排出するために総主静脈内にニックネームを作成します。血液の排水性を高める、マッサージ肝臓にぬれた綿棒を使用してください。このステップは、胆管にはお勧めしませんし、すべての血管系に必要でないかもしれません。 注：このステップはまたperfoすることができます代わりにPBSの4％パラホルムアルデヒドでrmed。 4％パラホルムアルデヒドの使用は、特に小さな血管構造の、より正確なキャストで血管の整合性と結果を高める可能性があります。 </li></ol> 5。肝外門脈または総胆管カニューレを挿入<ol><li>肝臓から約¼インチ、門脈や胆管の下に外科的縫合結紮を渡すように湾曲したピンセットを使用しています。 </li><li>緩い共通の結び目に糸を結びます。結び目を締めないでください。 </li><li>あなたはオープンエンドのシステムで作業している場合、それはシステムのもう一方の端に合字を結ぶ締めすると便利かもしれません。あなたは門脈から血液を排出するために総主静脈を開いている場合、門脈内の圧力を増加させ、中央の肝静脈への樹脂漏れを防止するために、その周りに合字を結ぶ。 </li><li>縫合糸の結び目の下約¼インチ、門脈や胆管に小さなカットをする春のはさみを使用しています。このCutは中途半端な門脈や胆管の直径を通じ以上のものを貫通するべきではありません。 </li><li>第5ピンセットを用いて、カットのサイトで門脈や胆管を保持し、胆管にチューブの傾斜端を挿入します。 </li><li>プリタイドリガチャー過ぎ、肝臓に向かってチューブの先端を押してください。 </li><li>カニューレを介してPBSを注入し、それは門脈や胆管に入っているかどうかを観察することで、カニュレーションの精度をテストします。 </li><li>代わりにカニューレを保持するために字を締めます。 </li></ol> 6。樹脂は門脈や​​肝内胆管をキャスト<ol><li>予め測定された0.1グラムの触媒に予め測定された1ミリリットル樹脂を加え、よく混ぜる。気泡を発生させることは避けてください。 </li><li> 3 mlの注射器に戻す樹脂触媒混合物を描画します。優しくシリンジをフリックし、気泡を追い出すことにより、任意の気泡を除去する。 注：小さな構造をキャストするために、それは目から非常に小さな気泡を除去するために真空チャンバーを使用すると便利かもしれませんeは樹脂とキャストの質を向上させる。この手順を実行するための時間を考慮するためには、樹脂の硬化を遅くするために、上記示唆から触媒/樹脂比を低下させることが必要である。 </li><li>慎重にカニューレに取り付けられた32ゲージの針を残して、樹脂含有注射器を含むPBS含有注射器を交換してください。 </li><li>抵抗が増加し、肝臓がいっぱいになるまでゆっくりと優しく門脈や胆管に樹脂を押してください。 </li><li>優しく肝臓をマッサージしても塗りつぶしを奨励するためにぬれた綿棒を使用してください。 </li><li>構造からカニューレを取り外し、速やかに樹脂漏れを防ぐために字を締め直してください。 </li><li>マウスは樹脂が硬化しながら20分間室温で平らにすることができ、その後、肝臓を削除します。 </li><li>どちらかの肝臓をクリアしたり、マセレーションを続行します。 </li></ol> 7。 その場で可視化するための明確な肝<ol><li> 4℃、ロッキングで一晩、4％パラホルムアルデヒド中で肝臓を修正しました。 </li><li>肝臓を洗うPBS中で少なくとも4時間、ロッキングのために。必要であればこの時点では、肝葉を分離することができる。 </li><li>室温で揺らし、少なくとも4時間ごとに50％メタノールにした後、100％メタノールで脱水する。 </li><li>ロッキング、少なくとも24時間ベンジルアルコールと安息香酸ベンジル（Babbの）の1:2溶液中で肝臓をクリアします。長い洗浄時間が必要になることがあります。肝臓は2-3日後には完全にクリアされない場合は、24時間、100％メタノールに戻って移動し、Babbのクリアを繰り返す。 </li><li> 上皮内イメージング用ガラスシャーレ内に沈めBabbの肝。 </li></ol> 8。肝臓組織を柔らかく<ol><li>マウスから肝臓を取り出して、水で50 mlコニカルチューブに入れた。完全に樹脂硬化で1時間待ちます。必要に応じて独立した肝葉。 </li><li>水を捨て、ガラスボトルに肝臓に移動します。 15パーセントのKOHに沈め。室温で一晩にしておきます。動かさないでください。 </li><li>慎重にKOHを捨て、蒸留水でキャストを洗う。注：キャストは、verです壊れやすいとyは、細心の注意を払って取り扱ってください。管から流体を追加または削除するときにキャストを中断することは避けてください。 </li><li>レジンキャストがきれいになったら、そっと格納するコンテナに転送して、乾燥させるキムワイプ上に横たわっていた。 </li></ol> 9。代表的な結果門脈や胆管の正常なキャストは、へそから肝臓周囲に伸びる徐々に小さく枝の連続的なネットワークが表示されます。 図1は、門脈がBabbのクリア。 図1Aは、全体の左肝葉のキャストとキャストの形状とサイズを示した後、その場で可視化としてキャスト。 図1Bは同じキャストの拡大図を示し、実証を示してい肝周囲で最小の門脈枝への樹脂の浸透。 図2は、KOHミリアンペアを遂げている門脈キャストを示していますceration。 図2Aは、全体の左肝葉と図2Bは末梢小型の枝のクローズアップであることを示している。 この手法はまた、正常肝内胆管に適用され、Babbの清算とKOHマセラシオン手法1,2,7の両方を使用して公開されています。 一般的な問題がいっぱいに不完全含む、周囲のシステムまたは組織への樹脂と、オーバーフローで泡。 図3に門脈からの不完全な充填（ 図3A）、気泡（ 図3A）、樹脂のオーバーフローを認識する方法を示してい中心静脈（ 図3B）。 すべての画像はライカMZ-16のFAステレオスコープを使用していて、RETIGA 4000RカメラをQImaging取られる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4272/4272fig1.jpg" /> 図1。肝左葉の門脈のレジンキャストをBabbのクリアされた。 A.レジンキャストは門部から肝周囲に伸びる階層的な分岐構造を示しています。レジンキャストは、青みがかった肝葉内に黄色で表示されます。 B.は近くアップ樹脂塗りが肝周囲に小さな枝に及ぶことを示しています。樹脂はクリア肝臓を通して白っぽいです。スケールバーは= 1ミリメートル。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4272/4272fig2.jpg" /> 図2肝臓の組織浸軟樹脂キャストは葉の門脈を残しました。全肝葉のA.レジンキャストは、さまざまなサイズの多くの枝を示しています。 Bのクローズアップは、肝臓の周囲に小さな枝を示しています。小さな枝の外観をフェザリングする正弦スペースの充填樹脂を表し、又は樹脂キャストに表示されない可能性はありますが、存在しなければ明らかに枝の密度が増加します。樹脂の色は白です。スケールバーは= 1ミリメートル。 図3樹脂キャストの一般的な問題。 A.左葉の門脈の不完全な充填は、肝臓周囲に拡張するために失敗し、一部またはすべてのキャストに分岐によって明らかである。このキャストはまた、連続鋳造（矢印）でブレークなど目に見える気泡が表示されます。いくつかの場所で門脈と中心静脈枝の近さのために、Bを、門脈樹脂は、多くの場合、中心静脈を入力して記入します。二つの異なる肺門枝（矢印）と異なるパターンと重複している2つの分岐構造がある場合にこれを認識することができます。技術的なエラーと真の形態学的変化とを区別するには2つの方法で行うことができます。まず、鋳造組織は、2次元解析、または他の方法に基づいて予想される構造に比較されるべきである。第二に、それはいくつかが複製を実行することが重要であり、可能な場合は、構造体を定量UREと異なる実験群と対照群間で統計学的に有意と内の形態学的変化がある場合には、再現性を決定するとするために統計分析を実行します。

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<li>Hossler, F. E., Douglas, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Corrosion+Casting%3A+Review+of+Advantages+and+Limitations+in+the+Application+of+Some+Simple+Quantitative+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Vascular Corrosion Casting: Review of Advantages and Limitations in the Application of Some Simple Quantitative Methods.</a> Microsc. Microanal. 7, 253-264 (2001).</li>
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<li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+Artery+and+Portal+Vein+Remodeling+in+Rat+Liver%3A+Vascular+Response+to+Selective+Cholangiocyte+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hepatic Artery and Portal Vein Remodeling in Rat Liver: Vascular Response to Selective Cholangiocyte Proliferation.</a> The American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々は、肝臓の門脈および肝内胆管系はキャストすることができますが、この技術は若​​干の適応と他のほとんどすべての乳管や血管系にどのように適用できるかの具体例を記載している。前の仕事は10,11子ガモマウス1,2,7-9を含む複数種、、、ウサギ12,13、犬14、豚15、および鼻腺14を含む多くの器官における本手法の有効性を実証してきました心臓16、12,13膀胱、肝臓1,2,7,8。これらのキャストは異なる発達段階5、または遺伝や環境の変化や影響1-4の構造上の効果で同じ構造、同じ組織内の複数のシステム（例えば、門脈、胆管）を比較するために使用することができ、6,7。種や臓器全体にこの技術の幅広いアプリケーションは、sのための非常に貴重なツールを注型用樹脂を作る血管および腺管構造の形態をtudyingと大幅動物疾患モデルで、私たちのこれらの構造の正常な機能の知識だけでなく、それらがどのように影響され...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> PE10ポリエチレンチューブ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 1417012P </td><td></td></tr><tr><td> 5から0外科黒編組シルク</td><td> Roboz外科</td><td> SUT-15-1 </td><td></td></tr><tr><td> Steriject 32 G×13 mmの針</td><td>エアタイト</td><td> TSK3213 </td><td></td></tr><tr><td>春のはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15000から08 </td><td></td></tr><tr><td> 5番鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 91150から20 </td><td></td></tr><tr><td> Mercox IIキット</td><td>ラッド研究</td><td> 21247 </td><td></td></tr><tr><td>ベンジルアルコール</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 1816年から1804年</td><td> OBabbのクリアリングのために必要nly </td></tr><tr><td>安息香酸ベンジル</td><td> MPバイオメディカル、LLC </td><td> 154839 </td><td>唯一Babbのクリアリングのために必要</td></tr><tr><td>リン酸緩衝食塩水（PBS） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>粘土</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スケール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>研究所はさみ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15mlのキャップポリプロピレンチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4％paraformaldahyde </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15％水酸化カリウム（KOH） </td><td></td><td></td><td>唯一のマセラシオンのために必要</td></tr><tr><td>かみそりの刃</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100％メタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3ミリリットルルアーロックシリンジ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

3次元樹脂鋳造およびマウスの門脈や肝内胆管系の結

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

臓器、血管および腺管構造の正しいアーキテクチャーは、適切な生理的機能のために不可欠であり、これらの構造体の形成と維持には、高度に制御されたプロセスである。これらの複雑な3次元構造の解析が大幅にセクションまたは染料注入試験のいずれかで2次元検査に依存してきた。これらの技術は、しかし、彼らは明らかにすることを意図している乳管や血管構造の完全かつ定量的な表現を提供することができません。あるいは、3次元プラスチック樹脂キャストの性質は、システムの永続的なスナップショットを作成し、3次元構造とネットワークを可視化し、定量化するための新規かつ広く有用な技術である。 樹脂鋳造システムの重要な利点は、血管やダクトの無傷と接続、または通信し、構造を決定する機能です。血管とDUCの構造TALネットワークは臓器の機能に不可欠であり、この手法にはいくつかの方法で、血管や管網の研究を支援する可能性を秘めています。レジンキャストは、管腔構造の正常な形態と機能アーキテクチャを分析発達形態形成の変化を識別し、正常と病気の状態間の組織構造の形態学的差異を明らかにするために使用することができる。前の仕事は、たとえば、勉強する注型用樹脂を利用している、構造1,2の2次元解析に反映されませんでしたマウスの肝内胆管系内のアーキテクチャと機能の欠陥、アルツハイマー病マウスモデル3の脳血管系の変化、門脈圧亢進性と肝硬変マウス4、未熟と大人の肺の間のラットのリンパ成熟の発達のステップ5、薬害への応答におけるラット肝臓、膵臓、腎臓の即時微小変化で門脈の異常6。 ここでは、門脈と肝内胆管に特に焦点を当て、マウスの血管や管網の3次元レジンキャストを生成する方法を提示します。これらのキャストは、組織をクリアしたり、マセレーションにより可視化することができますし、分析することができます。この手法は、実質的に任意の血管や管システムに適用することができ、3次元の乳管や血管構造の開発、機能、保守、または傷害に問い合わせるどんな研究に直接適用できるであろう。

マウスの肝門脈や肝内胆管の3次元構造を可視化し、定量化する方法が記載されている。このレジンキャスト技術は、他の管または血管系に適用し、可能にすることができます<em&gt;その場で</em&gt;システムの完全な通信アーキテクチャの可視化や定量化。

臓器において、血管および管状構造の正しい構築は、適切な生理学的機能に不可欠であり、その形成および...

本手順の総合的な目的は、血管または管状組織の3次元キャストを作成することです。まず、門脈などの標的構造を準備してカニュレーションを行い、カニュラを固定します。次に、樹脂を調製して門脈に注入し、硬化させます。その後、肝臓を取り出し、組織を固定または浸軟させます。最後に、肝臓を透明化し、キャスト構造を可視化します。これにより、最終的な結果を得ることができます。これは、視覚的解析またはmicro CTによる定量化を通じて、血管または管構造の構築上の変化を示すものです。この手法は肝臓の構築に関する知見を提供できるだけでなく、脳、肺、膵臓、腎臓を含むあらゆる臓器の血管系または管系にも適用可能です。カニューレを準備するために、PE 10チューブの1インチのセクションを指先で温め、ゆっくりと引っ張って細くします。伸ばしたチューブを斜めにカットします。ベベルチップ（斜端）を作るために、チューブのもう一方の端をカットし、5〜6インチのセグメントを作成します。32ゲージ、長さ1/2インチの皮下注射針をチュービングの斜面のない端に挿入します。3 mL シリンジにまず PBS を満たして準備し、チュービングが付いた針をねじ込みます。シリンジを軽く叩き、プランジャーを押して、シリンジ内に気泡がないこと、および針の中まで PBS が満たされていることを確認してください。触媒0.1 gを小型容器に量り取ります。次に、3 mLシリンジに樹脂1 mLを吸い取ります。最後に、結紮に使用する5インチのシルクサチャーを切断して用意します。成マウスを安楽死させた後、仰向けに寝かせ、腹腔を開きます。マウスを解剖顕微鏡のステージ上に置き、肝臓への視認性とアクセス性を高めるため、15 milliliter のコニカルチューブをマウスの直下に垂直に配置します。綿棒を PBS で湿らせ、それを用いて肝臓を上方へ押し上げるようにして、肝臓の背面および肝門脈または総胆管を露出させます。門脈キャストを作成する場合、室温のPBSで静脈を洗浄して血液の凝固を防ぎます。PBSを満たした3 mLシリンジに針を取り付け、肝臓からできるだけ離れた位置にある肝外門脈に挿入します。次に、PBSを門脈にゆっくりと注入します。その後、必要に応じて血液の排出を促進するために前主静脈に切り込みを入れて血液を排出させ、濡らした綿棒を用いて肝臓をマッサージします。開放系で操作を行う場合は、系の反対側を結紮して締め付けると有用な場合があります。門脈内の圧力を高め、中心肝静脈へのレジン漏出を防ぐために、総基静脈を切開して門脈からの血液を排出し、そこに結紮線を結びます。湾曲鉗子を用いて、肝臓から約1/4インチ離れた位置で、いずれかの構造物の下に外科用縫合糸を通します。縫合糸を緩い共通結節で結び、締め付けないようにします。次に、スプリング鋏を用いて、結紮結節から約1/4インチ下の門脈または胆管に小さな切開を加えます。この切開は、いずれの構造物の直径の半分を超えない深さにとどめてください。その後、5番ピンセットで切開部位の門脈または胆管を保持し、チューブの斜め端を挿入します。チューブの先端を、結紮した糸を通り越して肝臓側へ押し込みます。カニューレからPBSを注入し、門脈または胆管に入っているかを確認して、挿管の正確性をテストします。結紮糸を締め、カニューレを固定します。あらかじめ計量した1 mLの樹脂を、あらかじめ計量した0.1 gの触媒に加え、気泡が入らないように十分に混ぜ合わせます。樹脂と触媒の混合液を3 mLシリンジに吸い込みます。シリンジを軽く弾いて気泡を浮かせ、押し出して除去します。PBS入りのシリンジを、32ゲージの針をカニューレに装着したまま、樹脂入りのシリンジに慎重に交換します。抵抗が増し、肝臓が満たされるまで、樹脂を門脈または胆管にゆっくりと優しく注入します。これにより、均一な充填を促進します。濡らした綿棒で肝臓を優しくマッサージし、カニューレを抜いた後、樹脂の漏れを防ぐために結紮線を速やかに締め直します。樹脂が硬化するまで、室温でマウスを20分間平らに寝かせたままにし、その後、肝臓を取り出して内部の可視化のために透過処理を行います。4%パラホルムアルデヒド溶液中で4°Cにて一晩固定し、翌日に溶液を捨ててPBSを加えます。肝臓をPBSで少なくとも4時間洗浄します。必要に応じて、この時点で肝葉を分離させても構いません。組織を50% methanolで、次いで100% methanolで、それぞれ少なくとも4時間脱水します。室温でロッキングミキサーにより振とうします。安息香酸ベンジルと安息香酸ベンジルベンゾエートの1:2溶液を用いて、さらに少なくとも24時間肝臓を透明化します。in situでのイメージングを行う場合は、洗浄回数を調整する必要がある場合があります。組織を浸軟させる別の方法として、ガラス製ペトリ皿に入れ、肝臓をBABBに浸します。動物から肝臓を取り出した後、水を入れた50 milliliterコニカルチューブに入れます。樹脂が完全に硬化するまで1時間待ちます。水を捨て、肝臓をガラス瓶に移します。15%水酸化カリウム溶液に浸し、室温で一晩静置します。水酸化カリウム溶液を捨て、鋳型を蒸留水で洗浄します。チューブに液体を注入または排出する際は、キャストを壊さないように注意してください。樹脂キャストがきれいになったら、キムワイプの上にそっと置いて乾燥させ、その後、保存容器に移します。この図は、BABB透明化後にin situで可視化した門脈キャストを示しています。ここでは、左肝葉全体のキャストと、そのキャストの形状およびサイズを示しています。これは同じキャストの拡大図であり、肝臓末梢の最小の門脈枝まで樹脂が浸透していることを示しています。ここでは、門脈キャストに水酸化カリウムによる浸漬法を施したもので、左葉全体がここに示されており、末梢の細い分枝の拡大図がここに示されています。よくある問題として、充填不足、樹脂内の気泡、および周囲の系や組織への漏出が挙げられます。この図では、充填不足、気泡、および門脈から中心静脈への樹脂の漏出をどのように認識するかを示しています。樹脂の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、本手順を実施する際は、常に手袋を着用し、換気の良い場所で作業するなど、十分な予防策を講じることを忘れないでください。

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