Name: マウスにおける再発性ヘルペス性間質性角膜炎、人間のHSKを研究するためのモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学ぶマウスを用いた再発性ヘルペス性間質性角膜炎のモデル構築法。UVB照射によるウイルス再活性化と涙液採取によるウイルス脱落検出により、人間のHSK病態を模倣した疾患進行の評価が可能です。

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著者は、私たちにモデルを教えて助けるために博士ジェイPeposeに感謝したいと思います。この作品は、国民健康補助EY11885（PMS）の研究所、EY21247（PMS）と眼科に失明を防ぐための研究からの無制限の助成金によって支えられている。

動物のケアに注意してください：彼らは、抗炎症であり、したがってモデルをinvalidateするような鎮痛剤は、このモデルでは使用されません。 1。ウイルスの作製<ol><li>細胞のすべてを持っている丸みを帯びたアップまで3-4日間感染の多重度0.01（T-150フラスコ、約5×10 5プラーク形成単位）の開始希釈を用いてVero細胞（80％コンフルエント）に、HSV-1を育てると簡単にフラスコを押すことで外れている。 </li><li> ℃、15分間3500 rpmで4時ソーバル伝説RTに滅菌遠心管と遠心分離機にメディアを取り出します。メディア合計5mlで各50mlチューブから上清（1.3を参照）、再懸大型ペレットを除去した後。 2 30秒のバーストで1分間超音波洗浄します。 </li><li>上清を除去し、9,000 rpmで50ミリリットル滅菌オークリッジ管や遠心分離機に入れ、4℃で1時間°ベックマンJ2-21遠心分離機でC用。これは、小さなウイルスのペレットを製造することである。上清を捨てる。 </li><li> 1.2ウィットから超音波処理組み合わせるhを1.3からペレットと45秒のために再度超音波洗浄します。 4℃で5分間1,500 rpmでソーバル伝説RTで遠心℃、上清を保存します。これは-70℃で小分けして保存されているウイルスストック℃を構成する</li><li> Vero細胞で力価ウイルス。 10 -8希釈（それぞれ10倍希釈である）2つの独立した希釈セットから2倍へ私は通常板10 0。ウイルスの力価測定は12ウェル滅菌プレート上で行われる。 </li></ol> 2。マウスへの感染<ol><li>麻酔cocktail/20グラムのマウスの体重（ケタミン、HBSSで希釈し60 mg / kgの+キシラジン5 mg / kg）を0.1mlの各マウスを注入します。それは適切な用量が使用され、この薬剤の効果は非常に短命であるアール麻酔の安全な手段の一つであるため、このカクテルに使用されます。 </li><li>マウスは、角膜に穴がないことを確認するために、解剖顕微鏡を用いて、30ゲージの針で右眼の角膜麻酔スクラッチあるとき。 </li><li>各マウスRECE初感染時の損傷から角膜を保護するために、プールしたヒト血清（1:800の50％ウイルス中和のために有効な用量と抗HSV反応性シグマ、テメキュラ、カリフォルニア州）の1ミリリットルの腹腔内注射をived。 </li><li>耳のクリップのいずれかで、または耳パンチで数匹のマウスを。 </li><li>すべてのマウス番された後、20μlのピペッターを使用して、我々は10 6 PFU（5μl）を使用して各眼に感染します。我々は、片目だけ、通常は右眼に感染します。我々はまた、彼らは麻酔している間に潤いを保つために、他の目にHBSSの5μlを置く。 5 ulは手続きが未満10分間で行われ、動物がそれに応じて麻酔薬を投与されているので目の水和を維持するのに十分である。感染症は、ベロメディア1mlに水和させた滅菌綿棒でマウスを3日後に感染を拭き取りにより確認されている。その後、100μlを48ウェルプレート中で増殖させたVero細胞に添加される。これらのプレートは、細胞変性効果のために毎日監視している<html> （CPE）。 </li></ol> 3。レイテンシからのマウスの再活性化<ol><li>マウスは一次感染後少なくとも5週間麻酔する。それは、我々は1年以下の初感染にマウスを再活性化しているし、それに応答して有意な差は認められていないことに留意すべきである。 </li><li>一度麻酔それらはただ一つ目は、UV-B光にさらされるように302 nmのピーク波長でのUV-Bを発するTM20クロマト-VUトランスイルミネーターを配置されます。各マウスは250 mJのUV-B光cm 2にさらされている。 </li><li>再活性化は、まず1から7までのポストのUV-B照射の日に次に0日にベロメディアの1ミリリットルに配置（自発sheddersために制御するために、UV-B曝露前）とされている滅菌綿棒で目を拭き取りによって決定されます。 2.5で説明したようにスワブ材料）が評価されます。感染性ウイルスを持っているそれらのスワブのウイルスの量は、12ウェルプレートを用いた標準的なプラークアッセイによりtitteredされています。 </li></ol>ove_title &quot;&gt; 4。臨床評価<ol><li>マウスは、双眼実体顕微鏡を用いてマスクされた観察者によって臨床眼疾患のために評価されます。 </li><li>角膜混濁が0クリアストロマを示す0〜4のスケールで評価され、1が軽度の間質混濁、2を示す識別可能な虹彩の機能と適度な不透明度を示し、3は瞳孔の余白を除いて定義された虹彩の細部が失われた状態で密な不透明度を意味し、4を示しノー後部を望む総不透明。 </li><li>血管新生は、4つの等しい象限に角膜を分割し、これらの各象限における血管新生の程度を決定することによって、1から8までのスケールで評価されています。 </li><li>眼瞼炎は、次のように測定されていない：0、全く病変; 1、最小限のまぶたが腫れ、2、中等度の腫れや無愛想な眼漏、3、重度の腫れ、適度な眼周囲の脱毛、皮膚病変、および4、目をまぶしたシャットダウンを伴う重度の腫れ、厳しい眼周囲の脱毛、皮膚病変。 </li><li>脳炎もの含めるの証拠DEDは、バックフリルの髪、そして明らかな神経学的異常を覆いかぶさる。彼らは脳炎の重要な兆候を表示するときに、マウスを安楽死させています。 </li></ol> 5。代表的な結果上述した再発モデルは最初Shimeld らによって発表された1-3。彼らはテストの結果、私たちの研究室では、年4月15日の上に多くの原稿を公開するために、このモデルの修正版を使用してきました。モデルは、再発性HSV-1の10疾患におけるサイトカインインターフェロン-γの果たす役割を定義するために使用された。 図3に示すように、よりIFNγの表示悪化角膜疾患を欠損したマウスは、野生型マウスに14をしました。それはまた、いくつかの異なるワクチン構築6,10,11の治療的価値を定義するために首尾よく使用されていました。 1ケースでテストワクチンが予防的にうまくいきましたが、6治療的に有効であることが判明しなかったことに注意してください。しかし、複製能力のないウイルスワクチンを試験したとき、それは予防的に唯一の効果はありませんでしたが、治療的にも10,11非常に有効であった、参考文献10の図5を参照してください。さらに最近では、我々は性差が再発HSKを受けたマウスで検出可能であったかどうかを判断するために、このモデルを使用している。 図1が示すように 、雄のC57BL / 6マウス雌のC57BL / 6マウスの場合よりも有意に低い角膜混濁を表示します。同様に、角膜血管新生を評価したところ、雄マウスでは有意に少ない雌マウス（ 図2）したより角膜の新しい血管の成長を示した。我々は現在、この表現型は、マウスの他の株で同様の分析を行うことにより、特定の菌株であるかどうかをテストしています。我々はまた、違いはテストステロンやエストロゲンの存在の欠如によるものであるかどうかを判断します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4276/4276fig1.jpg" /> 図1のUV-B誘発再活性化後に雄と雌のC57BL / 6マウス系統における角膜疾患。潜伏感染マウスは35日間角膜混濁についてモニターしたUV-Bを照射し、マウスで復活させるように誘導した。これらの研究のために使用したマウスの数は以下の通りであった：男性は、n = 15、女性は、n = 15。結果は平均値±SEMを示す。 *かなり大きいウイルス誘発性の疾患は、14から35日間のために雌のC57BL / 6マウス（P = 0.001から0.01）であった。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4276/4276fig2.jpg" /> 図2 UV-Bの再活性化によって誘導される、以下の雄と雌のC57BL / 6マウス系統における角膜疾患。潜伏感染マウスは35日間角膜血管新生のために監視されたUV-Bを照射し、マウスで復活させるように誘導した。これらの研究のために使用したマウスの数は以下の通りであった：男性は、n= 15;女性は、n = 15。結果は平均値±SEMを示す。 *かなり大きいウイルス誘発性の疾患は、14から28日間のために雌のC57BL / 6マウス（P = 0.001から0.01）であった。

<ol><li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+model+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).</li>
<li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+latent+infection+and+induction+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).</li>
<li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+immunization+protects+the+mouse+eye+from+damage+after+herpes+simplex+virus+infection+by+limiting+spread+of+virus+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system.</a> J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).</li>
<li>Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+murine+model+of+recurrent+herpes+simplex+viral+keratitis+induced+by+ultraviolet+B+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).</li>
<li>Keadle, T. L., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+ameliorates+corneal+disease+in+a+mouse+model+of+recurrent+herpetic+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Path%22%5BJournal%5D)">IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis.</a> Microbial Path. 38, 13-21 (2005).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+a+recombinant+glycoprotein+D+subunit+vaccine+on+the+development+of+primary+and+recurrent+ocular+infection+with+herpes+simplex+virus+type+1+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inf.+Dis%22%5BJournal%5D)">Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice.</a> J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+cytokines+IL-1+and+TNF-a+are+required+for+recurrent+herpetic+keratitis+in+NIH+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).</li>
<li>Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+cytokine+expression+in+a+murine+model+recurrent+herpetic+stromal+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Immunol.+Inflam%22%5BJournal%5D)">Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis.</a> Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).</li>
<li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+and+CD8%2B+cells+are+key+participants+in+the+development+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Path%22%5BJournal%5D)">CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> Microbial Path. 32, 255-262 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+immunization+with+a+virion+host+shutoff-defective%2C+replication-incompetent+herpes+simplex+virus+type+1+strain+limits+recurrent+herpetic+ocular+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection.</a> J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+vaccination+with+vhs%28-%29+herpes+simplex+virus+reduces+the+severity+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).</li>
<li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+aminoguanidine+on+primary+and+recurrent+ocular+herpes+simplex+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection.</a> Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).</li>
<li>Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL3+protects+mice+from+corneal+pathology+during+recurrent+HSV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection.</a> Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).</li>
<li>Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+gamma+is+not+required+for+recurrent+herpetic+stromal+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis.</a> Virology. 380, 46-51 (2008).</li>
<li>Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Interferon-gamma+by+an+adenovirus+vector+blocks+herpes+simplex+virus+Type+1+reactivation+in+vitro+and+in+vivo+independent+of+RNase+L+and+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways.</a> J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ヘルペス性間質性角膜炎の再発モデル（HSK）は、ここで説明すると、研究者は、人間の病気の間に観察されているものとより一貫性のあるモデルで人間のHSK試験を勉強することができます。したがって、このモデルの強みは、病気は原発性疾患時の刺激によってすでに免疫システムのコンテキストで発生することがあります。これらのマウスはすでに、HSV-1に対する免疫応答を持っているので、その免疫応答を再アクティブ化の要因はもともとそれを生成したものとはおそらく異なっています。原発性および再発HSK 6,8,10-13,15の違いを評価するときに、したがって、主HSKのを防ぐために治療的介入は常に我々は様々な出版物に示された再発HSK試験の改善につながることはありません。先に示したように、人間のHSKのを防ぐために、ワクチンを開発する際に、このような場合、特定のです。ほとんどのワクチンは、プライマリHSK試験の開発を防ぐことができますが、非常に少数はrecuを低減するのに有効であることが示されているHSK試験6,10,11 rrent。 このモデルの弱点は、それ...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清</td><td>Sigma</td><td>S7023</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Cellgro</td><td>25-005-C1</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>ファンギゾン</td><td>Invitrogen</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Beckman</td><td>52-21</td><td></td></tr><tr><td>トランスイルミネーター</td><td>UVP</td><td>95-0452-02</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>Branson</td><td>Sonifier 450</td><td></td></tr><tr><td>オークリッジチューブ</td><td>Nalgene</td><td>Z 720410</td><td></td></tr><tr><td>フラスコ- 7150</td><td>Corning</td><td>430823</td><td></td></tr><tr><td>プレート- 12ウェル</td><td>Corning</td><td>CLS 3513</td><td></td></tr><tr><td>プレート- 48ウェル</td><td>Corning</td><td>CLS 3548</td><td></td></tr><tr><td>滅菌コニカルチューブ- 30 ml</td><td>Corning</td><td>CLS 430828</td><td></td></tr><tr><td>滅菌綿棒</td><td>Fisher</td><td>23-400-125</td><td></td></tr><tr><td>30G 針</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>25G 針</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>10 ml シリンジ</td><td>BD</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>10 ml シリンジ</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける再発性ヘルペス性間質性角膜炎、人間のhskを研究するためのモデル

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

ヘルペス性眼疾患と呼ばれるヘルペス性間質性角膜炎（HSK）は、角膜の潜在的に失明に至る感染症であり、その治療のために30万人以上の通院各年の結果。臨床疾患を持つ患者の1〜2％が感染し、角膜の視力喪失を経験するでしょう。これらのケースの大半はヘルペスで潜伏感染の再活性化の結果は、私はウイルスではなく、急性疾患に起因する単純に入力されています。興味深いことに、急性感染症は、ほとんどの場合、この病気を研究するために使用されるモデルです。しかし、HSK試験の再発モデルは臨床疾患の間に発生するものをより反映であろうと感じました。 HSK試験のために再発の動物モデルは、ウサギとマウスの両方を採用してきた。ウサギの利点は、彼らは、任意の既知の刺激が存在しない場合の待ち時間から再活性化を経験するということです。それはウサギモデルがIMMUNを持っていないので、それは多くの免疫学的要因が再発HSK試験に果たす役割を探求することは困難である、と述べたマウスが持っているologicalと遺伝資源。再活性化は、UV-B光への曝露によって誘発されるので、我々はそれがそこには多くのリソースが利用可能であるという利点を持っており、また再活性化が発生するときに我々は知っているので、再発HSKのマウスモデルを使用することにしました。これまでのところ、このモデルでは、この病気に重要ないくつかの免疫学的要因を定義するためにそれを使用して、それらの研究室ができました。また、私たちは、治療およびワクチンの有効性の両方をテストすることができました。

ヘルペス性角膜疾患のほとんどの研究は、一次感染モデルを使用しています。しかし、HSV-1の初感染は、典型的には、ヒトの疾患につながるものではない。ここでは、より密接に人間の病気を模倣ヘルペス性角膜疾患の再発モデルについて述べる。

マウスにおける再発性ヘルペス性間質性角膜炎、人間のHSKを研究するためのモデル

ヘルペス性角膜実質炎（HSK）と呼ばれるヘルペス性眼疾患は、失明に至る可能性のある角膜感染症であり、30万人以上の臨床的...

本手順の全体的な目的は、単純ヘルペスウイルス（HSV）の再発感染を研究することである。まず、角膜損傷を与えずに潜在感染させる方法でマウスに感染させる。潜在感染が完全に成立した後、次のステップとしてUVB光に曝露してウイルスを再活性化させる。最終ステップでは、ウイルスシェディングを検出するために涙液を回収し、その後、疾患をモニタリングするためにマウスを少なくとも5週間観察する。最終的に、マウスに生じた疾患の程度は、ヘルペス性ストローマ角膜炎の疾患スコアリングによって評価できます。これは世界中の多くの人々が罹患する疾患であり、特にこの疾患は、感染性失明の主要な原因の一つとなっています。私たちは、この特定の疾患を模倣するためにマウスで使用しているモデルを有しています。この疾患を模倣できる他のモデルも存在しますが、これがこの特定の疾患を最もよく表現していると考えています。本日は、このビデオに登場する方々を数分かけてご紹介したいと思います。こちらは、ここ数ヶ月間私と一緒に研究しているクロエです。そしてこちらは、夏季インターンとして研究室で働いているニッポです。まず、T150フラスコを用いてVero細胞でHSV-1を3〜4日間培養し、コンフルエンシーを80%まで高めてから、実験を開始します。この時点までに細胞は丸まっており、フラスコを叩くことで容易に剥離します。細胞懸濁液を滅菌済みの50 milliliter コニカルチューブに移し、15分間遠心分離して細胞を沈殿させます。ベンチトップ遠心機を用い、4 °C、1,510 ×g で行います。次に、上清を50 milliliterの滅菌済みオークリッジチューブに移し、その後、各コニカルチューブに合計5 milliliterの培地を分注して再懸濁します。大きなペレットを懸濁させ、再懸濁したペレットを32分の1秒のバーストで2回、1分間超音波処理します。高速床置き遠心機で上清を遠心分離すると、小さなウイルスペレットが得られます。上澄み液を廃棄した後、細胞の沈殿物と少量のウイルスペレットを合わせ、再び45秒間超音波処理します。次に、超音波処理した細胞およびウイルス溶液を、ベンチトップ遠心機を用いて280 ×g、4 °Cで5分間再度遠心分離し、上澄み液を分注して、ウイルスストックとして-70 °Cで保存するか、タイタープレートに使用します。ウイルスストックの上清を用いて、10⁰から10⁻⁸まで10倍段階希釈したウイルス液を2組用意し、12ウェル滅菌プレート内のVero細胞に添加します。マウスを麻酔することから感染手順を開始します。ウイルスが十分に吸収されるよう、マウスが覚醒するまで20～30分間は完全に麻酔状態を維持させる必要があります。次に、実体顕微鏡下で30ゲージの針を用い、右眼の角膜を擦過します。その後、イヤーパンチで個体番号を付けます。続いて、一次感染時の角膜損傷を防ぐため、プールしたヒト血清1 mLをマウスに注射します。次に、20 µL ピペッターを用いて、傷をつけた眼に 10⁶ plaque forming units を接種し、動物が麻酔状態にある間に感染を確認するため、もう一方の眼に 5 µL の HBSS を点眼して湿潤状態を維持します。滅菌綿棒を 1 mL の Vero media で湿らせます。感染から3日後、綿棒で感染した眼をスワブし、その後、スワブした培地 100 µL を、一次感染から少なくとも5週間後に 48 ウェルプレートで培養した Vero 細胞に接種します。示したように、麻酔下にあるマウスの感染眼をスワブします。自発的な閉瞼を制御するため、48ウェルプレートの蓋にスワブ実施日を0日目として記録します。次に、マウスをピーク波長302 nanometersのUVBを照射できるトランスイルミネーターに設置し、片眼のみがUVB光にさらされるようにして、1 cm²あたり250 millijoulesのUVB光を照射します。その後、1日目から7日目まで毎日眼をスワブします。感染性ウイルスを含むスワブについて、UVB照射後に12ウェルプレートを用いた標準的なプラークアッセイでウイルス量を定量し、マウスの臨床的な眼疾患を評価します。マウスを実体顕微鏡下に設置します。角膜混濁は0から4のスケールで評価され、0は透明な実質、1は軽度の実質混濁を示します。2は虹彩が視認できる中程度の混濁、3は瞳孔縁以外の虹彩の詳細な構造が消失した高度な混濁、そして4は後方が全く見えない完全な混濁であることを示します。新生血管形成は、角膜を4つの等しい象限に分割し、それぞれの象限における血管新生の程度を判定することで、1から8のスケールで評価されます。この最初の図では、潜在感染させたマウスにUVB照射を行い再活性化を誘導し、その後35日間にわたって角膜混濁をモニタリングしました。これらのデータは、14日目から35日目にかけて雌のC 57 black sixマウスでウイルス誘発性疾患が有意に強く認められたことから、雄のC 57 black sixマウスは雌のC 57 black sixマウスよりも角膜混濁が有意に少ないことを示しています。同様に、同じ実験条件下で角膜新生血管を評価したところ、雄マウスは雌マウスよりも角膜における新生血管の増殖が有意に少ないことが示されました。そしてここでも、14日から28日にかけて、雌のC 57 black sixマウスにおいてウイルス誘発性疾患が有意に強く現れています。この手順を行う際は、マウスを完全に麻酔し、20分から30分間睡眠状態にすることを忘れないでください。このビデオを視聴したことで、この人間での疾患を研究するための再発性ストローマ角膜炎マウスモデルの使用方法について理解を深めていただけたと思います。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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慢性高眼圧症は、マウスの目に小柱網のレーザー光凝固を使用して誘導される。眼圧（IOP）は、レーザー治療後数ヶ月上昇する。視力と実験動物のコントラスト感度の低下は微細運動テストを使用して監視している。...

ビジュアル欠陥を特徴づけるために慢性高眼圧症のレーザー誘起マウスモデル

我々は、動物モデルの組織切片内の永続的なDNAウイルスゲノムの検出のためのin situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて蛍光を確立した。このプロトコルは、ウイルスゲノムのcodetection、そのRNA産物、および単一細胞内のウイルスまたは細胞タンパク質によって感染プロセスを研究できます。...

蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

皮膚は、ヒト病原体単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）の標的組織の一つです。HSV-1の組織への浸潤経路を探るために、皮膚の最外層を表すマウス表皮シートのex...

単純ヘルペスウイルス1型を持つマウス表皮の ex vivo 感染

このプロトコルは、ひと造血幹細胞の放射線-調節された新生児 NSG マウス注入肝を介してヒト化マウス (胡 NSG) を確立するためのメソッドを提供します。胡 NSG マウス HIV 感染および組合せの抗レトロ ウイルス療法 (カート) に敏感であるし、HIV...

ヒト NOD/SCID/IL2rγ のnull (胡 NSG) マウスは、HIV 複製の遅延研究のモデルします。

ここでは、ヒト化マウスにおけるHIV感染のダイナミクスを研究するための3つの実験的アプローチについて説明する。最初は慢性感染イベントの研究を許可し、後者の2つは一次感染またはウイルス再活性化後の急性イベントの研究を可能にする。...

ヒト化免疫不全マウスモデルにおける慢性、急性、再活性化HIV感染

フットパッド接種モデルは、生体内でウイルス誘発性神経炎症反応を特徴付けるための貴重なツールです。特に、末梢神経系において開始されたウイルス動態および関連する免疫病理学的プロセスの明確な評価を提供する。...

ウイルス誘導神経炎症反応を研究するマウスフットパッド接種モデル

実験薬の抗ウイルス効果を試験するためのブタ角膜の使用について述べる。...

単純ヘルペスウイルス-1抗ウイルス薬の有効性を研究するブタ角膜組織外植

接触過敏症(CHS)は、アレルギー性接触皮膚炎(ACD)のマウス実験モデルである。CHSは、胸部および腹部の剃毛された皮膚を塗ることによって反応性ハプテンによる感作に基づいており、その後の耳の皮膚の課題を希釈ハプテンで、様々な方法で評価される腫脹反応を引き起こす。...

アレルギー性接触皮膚炎のマウスモデルとしての接触過敏症

このプロトコルでは、ヒト様の瘢痕化をシミュレートするための機械伝達シグナル伝達を増加させる肥大性瘢痕マウスモデルを確立する方法について説明します。この方法では、マウスの治癒切開部全体の機械的張力を高め、特殊なデバイスを使用して再現性のある過剰な瘢痕組織を作成し、詳細な組織学的およびバイオインフォマティクス分析を行います。...

メカノトランスダクション駆動型ヒト様肥厚性瘢痕のマウスモデル

学ぶマウスを用いた再発性ヘルペス性間質性角膜炎のモデル構築法。UVB照射によるウイルス再活性化と涙液採取によるウイルス脱落検出により、人間のHSK病態を模倣した疾患進行の評価が可能です。

マウスにおける再発性ヘルペス性間質性角膜炎、人間のHSKを研究するためのモデル

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