マウスにおける再発性ヘルペス性間質性角膜炎、人間のHSKを研究するためのモデル

本手順の全体的な目的は、単純ヘルペスウイルス（HSV）の再発感染を研究することである。まず、角膜損傷を与えずに潜在感染させる方法でマウスに感染させる。潜在感染が完全に成立した後、次のステップとしてUVB光に曝露してウイルスを再活性化させる。最終ステップでは、ウイルスシェディングを検出するために涙液を回収し、その後、疾患をモニタリングするためにマウスを少なくとも5週間観察する。

最終的に、マウスに生じた疾患の程度は、ヘルペス性ストローマ角膜炎の疾患スコアリングによって評価できます。これは世界中の多くの人々が罹患する疾患であり、特にこの疾患は、感染性失明の主要な原因の一つとなっています。

私たちは、この特定の疾患を模倣するためにマウスで使用しているモデルを有しています。この疾患を模倣できる他のモデルも存在しますが、これがこの特定の疾患を最もよく表現していると考えています。本日は、このビデオに登場する方々を数分かけてご紹介したいと思います。

こちらは、ここ数ヶ月間私と一緒に研究しているクロエです。そしてこちらは、夏季インターンとして研究室で働いているニッポです。まず、T150フラスコを用いてVero細胞でHSV-1を3〜4日間培養し、コンフルエンシーを80%まで高めてから、実験を開始します。

この時点までに細胞は丸まっており、フラスコを叩くことで容易に剥離します。細胞懸濁液を滅菌済みの50 milliliter コニカルチューブに移し、15分間遠心分離して細胞を沈殿させます。ベンチトップ遠心機を用い、4 °C、1,510 ×g で行います。

次に、上清を50 milliliterの滅菌済みオークリッジチューブに移し、その後、各コニカルチューブに合計5 milliliterの培地を分注して再懸濁します。大きなペレットを懸濁させ、再懸濁したペレットを32分の1秒のバーストで2回、1分間超音波処理します。高速床置き遠心機で上清を遠心分離すると、小さなウイルスペレットが得られます。

上澄み液を廃棄した後、細胞の沈殿物と少量のウイルスペレットを合わせ、再び45秒間超音波処理します。次に、超音波処理した細胞およびウイルス溶液を、ベンチトップ遠心機を用いて280 ×g、4 °Cで5分間再度遠心分離し、上澄み液を分注して、ウイルスストックとして-70 °Cで保存するか、タイタープレートに使用します。

ウイルスストックの上清を用いて、10⁰から10⁻⁸まで10倍段階希釈したウイルス液を2組用意し、12ウェル滅菌プレート内のVero細胞に添加します。マウスを麻酔することから感染手順を開始します。ウイルスが十分に吸収されるよう、マウスが覚醒するまで20～30分間は完全に麻酔状態を維持させる必要があります。

次に、実体顕微鏡下で30ゲージの針を用い、右眼の角膜を擦過します。その後、イヤーパンチで個体番号を付けます。続いて、一次感染時の角膜損傷を防ぐため、プールしたヒト血清1 mLをマウスに注射します。

次に、20 µL ピペッターを用いて、傷をつけた眼に 10⁶ plaque forming units を接種し、動物が麻酔状態にある間に感染を確認するため、もう一方の眼に 5 µL の HBSS を点眼して湿潤状態を維持します。滅菌綿棒を 1 mL の Vero media で湿らせます。感染から3日後、綿棒で感染した眼をスワブし、その後、スワブした培地 100 µL を、一次感染から少なくとも5週間後に 48 ウェルプレートで培養した Vero 細胞に接種します。

示したように、麻酔下にあるマウスの感染眼をスワブします。自発的な閉瞼を制御するため、48ウェルプレートの蓋にスワブ実施日を0日目として記録します。次に、マウスをピーク波長302 nanometersのUVBを照射できるトランスイルミネーターに設置し、片眼のみがUVB光にさらされるようにして、1 cm²あたり250 millijoulesのUVB光を照射します。

その後、1日目から7日目まで毎日眼をスワブします。感染性ウイルスを含むスワブについて、UVB照射後に12ウェルプレートを用いた標準的なプラークアッセイでウイルス量を定量し、マウスの臨床的な眼疾患を評価します。マウスを実体顕微鏡下に設置します。

角膜混濁は0から4のスケールで評価され、0は透明な実質、1は軽度の実質混濁を示します。2は虹彩が視認できる中程度の混濁、3は瞳孔縁以外の虹彩の詳細な構造が消失した高度な混濁、そして4は後方が全く見えない完全な混濁であることを示します。

新生血管形成は、角膜を4つの等しい象限に分割し、それぞれの象限における血管新生の程度を判定することで、1から8のスケールで評価されます。この最初の図では、潜在感染させたマウスにUVB照射を行い再活性化を誘導し、その後35日間にわたって角膜混濁をモニタリングしました。これらのデータは、14日目から35日目にかけて雌のC 57 black sixマウスでウイルス誘発性疾患が有意に強く認められたことから、雄のC 57 black sixマウスは雌のC 57 black sixマウスよりも角膜混濁が有意に少ないことを示しています。

同様に、同じ実験条件下で角膜新生血管を評価したところ、雄マウスは雌マウスよりも角膜における新生血管の増殖が有意に少ないことが示されました。そしてここでも、14日から28日にかけて、雌のC 57 black sixマウスにおいてウイルス誘発性疾患が有意に強く現れています。この手順を行う際は、マウスを完全に麻酔し、20分から30分間睡眠状態にすることを忘れないでください。このビデオを視聴したことで、この人間での疾患を研究するための再発性ストローマ角膜炎マウスモデルの使用方法について理解を深めていただけたと思います。