RootChipを使用して、ルート環境の急激な操作によるシロイヌナズナの根の成長のタイムラプス蛍光イメージング

この資料では、RootChipのシロイヌナズナ実生の栽培のためのプロトコル、細胞内の代謝産物レベルの微視的なルートのモニタリングおよびFRETベースの測定と成長条件の自動制御を組み合わせたマイクロイメージングプラットフォームを提供します。

最大の収量を提供するためには、植物には一連の栄養素、栄養素の欠乏、寒さや極端な暑さなどのストレス、干ばつ、または病原体が毎年作物の収量を大幅に減少させる必要があります。これらの問題の多くの原因は、多くの場合、地下にあります。根は植物の物理的なアンカーですが、水の摂取や、窒素、硫酸リン、多くの微量元素などのミネラル栄養素の摂取に関与する器官でもあります。

高い作物収量を生み出すための持続可能なアプローチを開発したいのであれば、根がどのように発達し、この広範囲の栄養素をどのように取り込むか、そして共生生物や病原性生物とどのように相互作用するかをよりよく理解する必要があります。これを行うには、ミクロのレベルで根を探求できる必要があります 明らかな理由から。根の生物学を研究することは、植物の地上部を研究することよりも常に困難でした。

根は通常地下に隠されているため、顕微鏡研究には簡単にアクセスできません。土壌からの除去は根系に深刻な損傷を与えるため、それらの行動を研究するための良い方法ではありません。根をよりアクセスしやすくするための1つの解決策は、jeedで根を育てること、またはこの例で水耕培地で示されています。

ゼリー状の培地や水耕栽培培地での栽培計画は、多くの根の研究で非常に成功裏に使用されてきましたが、これらの方法では、成長する根にできるだけ近づき、イメージングの準備による物理的ストレスを避けるために、根を微視的に詳細に長期間にわたって研究することは依然として非常に困難です。 私たちは、根を成長させ、イメージ化できると同時に、根の微小環境を非常に高い精度と速度で制御および変更できるプラットフォームを構築します。このプラットフォームをルートチップと呼びました。ルートチップは、シリコーン系有機高分子であるPDMSから作製したマイクロ流体デバイスです。

このチップは、ウサギの実生の根の成長とイメージングのための観察室を備えています。種子は、プラスチックピペットの先端から製造されたプラスチックコーンで最初に発芽し、固体培地で充填します。その後、根の先端は培地を通って成長し、チャンバーに到達し、そこで液体媒体の連続的な流れを経験し、チャンバー内の状態を維持します。

スタンフォード大学のSteve Quake氏の研究室が開発したコンスタントマイクロメカニカルバルブは、赤いコントロールで示されています。この流れは、顕微鏡検査に一般的に使用される透明なカバーガラスにチップが取り付けられているため、観察チャンバー内のすべてのプロセスを倒立顕微鏡で監視できます。流体の流れを導く二股のチャネル構造は、顕微鏡で見ることができます。

ルートチップは2つの層で構成されており、制御層にはバルブが含まれ、フロー層には成長培地試験溶液が観察チャンバーに流れるチャネルが含まれています。これらのチャンバーの容量は約400ナノリットルです。これは、非常に少量の溶液しか必要とせず、条件を非常に迅速に変更できることを意味します。

このプロトコルは、8本またはシロイヌナズナの実生の生き根を根チップ上で並列顕微鏡イメージングのために準備し、最大3日間観察する方法を説明し、培地がまだ液体である間に10ミリメートルのペトリ皿に1%寒天を含む成長培地を充填することから始まります。マルチチャンネルピペットを使用して、10マイクロリットルのピペットチップにペトリ皿から5マイクロリットルの培地を入れます。充填されたチップは、培地が固まるまでピペットチップボックスに保管されます。

次に、長さ4ミリメートルのプラスチックコーンにカットし、固体成長培地を含むシャーレに直立させて置きます。表面滅菌後、培地充填コーンの上に単一の種子を置きます。次に、皿をマイクロポアテープで密封し、プレートを4度で保存して発芽を同期させます。

3日後、プレートを成長キャビネットに移し、発芽を開始します。この実験の生育条件は23°Cです。発芽後5〜7日の間の16時間のハイライト、8時間の暗さサイクルで、苗は根チップ苗の健康根の長さに移す準備ができているべきであり、該当する場合は、蛍光マーカーの発現を解剖顕微鏡で確認する必要があります。

苗の根の先端がプラスチックコーンの底部出口に到達するとすぐに、個々の苗木がチップに移すためにマークされます。 10本ほどの植物の苗木は、ルートチップを滅菌するために転送中に損傷を受けた場合に備えて選択する必要があります。長期実験のために、装置をティッシュで包み、ガラスのペトリ皿とオートクレーブに入れます。

このチップは、以前にオートクレーブされたばかりです。チップを冷却した後の実験は、液体成長培地でオーバーレイされます。チップは完全に覆われている必要がありますが、液面はチップ表面から3ミリメートルを超えないようにする必要があります。

20マイクロリットルのピペットを使用して、ルートインレットとチャンバーアウトレットからメディアをプルします。これにより、観測室が満たされます。メディアが選択されると、プラスチックコーンがルートチップに差し込まれます。

コーンは入口にぴったりと収まるはずです。ルートチップは光学ガラスの薄層に取り付けられているため、チップに圧力をかけすぎないように注意する必要があります。このステップでは、チップが浮遊するのを防ぐために、チップは液体培地内で一晩インキュベーションする準備が整います。

2つのスライドガラス(1つは半分にカット)がチップの上に置かれます。マグネティックスターバーを追加し、皿を閉じます。アセンブリはマグネティックスターに移され、マグネティックスターは培地を穏やかに攪拌して、出口に向かって根の成長を促進します。

ルートチップの。入口は斜めに打ち抜かれ、目的の方向への成長をさらにサポートします。アウトレットの反対側にあるチップの側面を持ち上げて、アセンブリを少し傾けます。

チップはリングランプで点灯し、タイマースイッチに接続して明るい暗いリズムを維持します。一晩のインキュベーション後、液体成長培地を密封可能な加圧バイアルに調製します。次の手順は、苗の乾燥を防ぐために、中断することなく迅速に実行する必要があります。

チップは液体媒体から取り出され、チップキャリアの底部の開口部に逆さまに置かれます。チップは、制御層の入口を含む側が圧力線の側を向くように向きを変える必要があります。キャリアの側壁にある2つの大きなコネクタ。

チップ底面のカバーガラスをティッシュペーパーでやさしく吸い取り、キャリアに貼り付けて乾燥させます。テープを使用すると、アセンブリ全体が反転されます。チューブコネクタはシリンジを使用して水で満たされ、各チューブコネクタは対応するインレットに差し込まれます。

チップ上。チューブはメディアと溶液に差し込まれます。バイアルと空気は、次に空気の注射器で溶液胆汁に圧力を加えることによってラインから除去され、キャリアは透明なプラスチックで覆われています。

アセンブリ内の湿度を高く保つために、キャリアを顕微鏡ステージに置きます。ステージのノッチに正確に収まる必要があります。チップバルブとチップを通る媒体の流れは、空気圧によって制御されます。

レギュレーター付きの2つのラインは、メイン圧力ラインから分岐しています。1つは流体の流れを制御するために使用され、もう1つはソレノイドエアバルブに接続されています。これらのバルブは、USBバルブコントローラーを介してコンピューターから操作され、チップ上のバルブを作動させる役割を果たします。

チップを接続する前に、両方の圧力レギュレータを閉じる必要があります。チューブ、コネクター、および溶液バイアルが対応する圧力ラインに取り付けられました。数ミリリットルの水がキャリアのリザーバーに追加されます。

この手順は、より長い実験の過程で繰り返す必要がある場合があります。湿度を高く保つには、体積負荷を維持して、顕微鏡にこぼれる可能性のある液体の量を最小限に抑えます。リングライトはチップ上の位置に移動し、実験が始まるまでライトダークサイクルを維持します。

チップ上のバルブは、圧力を加えることによって閉じられます この場合、ソレノイドエアバルブを開くことによって。ラボビューインターフェースでは、バルブ番号の下にあるボタンをクリックしてバルブを制御できます。明るい緑色は、圧力がかかり、チップバルブが閉じていることを示します。

このスキームは、バルブ4から8がシングルバルブとして機能し、バルブゼロから3が機能するバルブシステムの構成を示しています。このシステムを持つグループでは、個々のチャンバーは、例えば、流体の流れをトップバルブゼロ、3、4から3番目のチャンバーに排他的に導くために、バルブの組み合わせを作動させることによって対処することができます。さらに、バルブ 6、7、および 8 は、インレット A、B、C のフラッシングに使用される溶液を制御し、3 つの溶液インレットバルブすべてを作動させて閉じます。

コントローラインターフェースはフィードバックループを備えており、システムのステータスを監視できます。この機能は、リードバックボタンをクリックすることでアクティブにできます。制御層の圧力調整器が最初に開いて、15 PSIに設定されます。

次に、フロー層のレギュレータがオープンになり、5 PSIに設定されます。選択した成長培地のインレットバルブが開き、チャンバーが培地の流路でフラッシュされているので、顕微鏡で確認する必要があります。ほとんどの場合、空気はチャネルに閉じ込められ、除去する必要があります。

さらに、制御空気のチャネルにはまだ空気が含まれており、それらを強制的に排出してチューブコネクタからの水で置き換える必要があります。このプロセスは、行き止まりの充填と呼ばれます。どちらのタスクも、すべての空気がチャネルからPDMSに押し込まれるまで、8つのチャンバーのそれぞれを数回フラッシングすることで達成されます。

このシステムは、実験を自動化するようにプログラムできます。このようなルーチンは、チップの脱気にも使用できます。ルートチップの主な目的は、イメージングプラットフォームとプロフュージョンシステムを1つのデバイスに統合することです。

根の微小環境の操作を実証するために、チャンバーを染料で洗い流し、チャンバー内の流体の交換を測定しました。推奨圧力5PSIで、10秒以内に約1.5マイクロリットル/分の計算流量で完全交換を測定しました。また、この場合、暗所で成長し、外部エネルギー源として10ミリモルグルコースが供給された苗の根の成長も観察されました。

光や培地の組成などの生育条件にもよりますが、植物は最大3日間根チップで観察できます。このシステムは、遺伝的にコードされたナノセンサーを発現する根の細胞内グルコースおよびガラクトースレベルを監視するために使用されています。これらのセンサーは、第1または共振エネルギー伝達またはフレットに基づいており、Fromerラボで開発されました。

この実験では、チップの根にグルコースまたはガラクトース溶液の方形パルスを灌流しました。糖の細胞内レベルをモニターし、ここに示し、ドナーECFPの強度に対するアクセプターフルオロ4シトリンの強度の比を左に示します。中央のセンサーシトリンの量または根の先端の比率メトリック画像を観察し、右側には、緑と赤で示されたガラクトースのグルコースの3つの繰り返しの正方形パルスに対する応答として砂糖の量をトレースします。

比率の上昇は、砂糖の蓄積を示しています。従来の成長方法に対するルートチップの主な利点は、顕微鏡検査のための低侵襲調製、根の環境を可逆的かつ繰り返し変更する能力、および発生能力のある生理学的に健康な組織を数日間にわたって継続的に観察する能力です。もう一つの本当に重要な利点は、時間の経過とともに必要なすべての栄養素を根に供給するために必要な液体の量が最小限であることです。

これにより、ルートチップは、特に高価な試薬が適用される場合に、非常に費用対効果が高くなります。私たちは、この重要な臓器を治療や観察により利用しやすくすることで、ルートチップのようなマイクロ流体ツールが植物研究の新たな次元を切り開く可能性があると信じているため、ルートチップの最適化とその有用性を拡大し続けています。ルートチップシステムの構築方法の詳細については、当社のWebサイトを参照してください。

チップはスタンフォードファウンドリーから注文できます。