Name: RootChipを使用して、ルート環境の急激な操作によるシロイヌナズナの根の成長のタイムラプス蛍光イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: 学ぶRootChipを用いたシロイヌナズナの根のタイムラプス蛍光イメージング法。マイクロ流体デバイスで環境を精密制御し、根の成長と代謝物動態を長期観察できます。

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我々は、センサをFRETを発現する植物ラインを提供するためのビデオの準備とBhavnaチャウのヘルプはフィリップDenningerに感謝します。この作品は国立科学財団（MCB 1021677）からの補助金によって支えられて、SRQGGにWBF、国立衛生研究所、ハワードヒューズ医学研究所のエネルギー省（DE-FG02-04ER15542は）EMBO長いによってサポートされていました長期フェローシップ。 MMは、アレクサンダー·フォン·フンボルト財団によってサポートされていました。

注意：無菌条件下でのすべてのステップの準備の手順を実行します。 1。種子発芽用プラスチックコーンの調製<ol><li> 5ミリメートルの厚さに1％の寒天を含有する増殖培地で10cmペトリ皿を記入してください。我々は、ホーグランド媒体4を変更した半分の強度を使用していますが、培地組成は、個々の実験的な要件に合わせて選択する必要があります。 </li><li>媒体がまだ液体であるが、シャーレから培地5μlの10μlのピペットチップを埋めるためにマルチチャンネルピペットを使用しています。 </li><li>媒体が固体であるまで、直立固体増殖培地を含むペトリ皿に4ミリメートル長いプラスチックコーンと場所にカットし、ピペットチップボックス内の塗りつぶされたヒントを格納します。 </li></ol> 2。種子の発芽および実生の成長<ol><li>表面は、培地を充填した円錐のそれぞれの上に、単一のシードを配置し、滅菌水で3回洗浄し、5分間、5％次亜塩素酸ナトリウムで種子を消毒す​​るだ。 </li><li> ℃で発芽を同期させるために4時に細孔テープ（3M）とストアと皿をシールします。 </li><li>三日後、発芽を開始するために成長キャビネットにプレートを転送します。私たちの成長条件は16H高いlight/8h明暗サイクルで23°C（100μEm -2 s -1での光強度）である。 </li><li>発芽後5〜7日の間、苗はRootChipへの転送のために準備する必要があります。この時点で、ルートヒントは、プラスチック製のコーンの底のコンセントの近くになければなりません。苗の状態、根の長さと、該当する場合は、解剖顕微鏡下で蛍光マーカーの発現を確認してください。 </li><li>チップ上に転送用の個々の苗をマークします。ケース1で10かそこらの苗を選択するには、転送中に破損しています。 </li></ol> 3。 RootChip上に苗の転送<ol><li>長期的な実験のためのRootChipを滅菌するために、ラップティッシュペーパー、ガラスのペトリ皿で​​行われ、オートクレーブ内のデバイス。 </li><li> RootChip、冷却した後、液体成​​長培地でそれをカバーしています。 RootChipは完全に浸漬する必要がありますが、液レベルがRootChip表面上以上3mm以下でなければなりません。 </li><li> 20μlのピペットを用いて、媒体との観測室を埋めるために、ルートの入口とチャンバー出口から培地を引き出します。 </li><li> RootChip口にステップ2.5で選択したプラグのプラスチックコーン。コー​​ンは口にぴったり収まる必要があります。 RootChipは光学ガラスの薄い層にマウントされているので、チップにあまり圧力を適用されません。 </li><li>液体培地で一晩RootChipインキュベートします。フローティング防止するために、チップ上に二つのガラススライドを配置します。磁気撹拌棒を追加し、皿を閉じます。 </li><li>マグネチックスターラーにアセンブリを移し、静かに培地を撹拌します。 </li><li> RootChipの口はfaciへの通常のデバイスに30°の角度で交差するチャンネルをチャネル（ 図1A）に根の成長をlitate。さらに、所望の方向に成長をサポートするために、店のチップは反対側にペトリ皿の下にスライドガラスを配置することによって、若干のアセンブリを傾けます。 </li><li>タイマーに接続さ：明/暗サイクルを維持するために、リングランプ（100μEm -2 s -1での光強度）で苗木を照らす。 </li></ol> 4。キャリアにRootChipを接続する<ol><li>次の日、液体成長培地（ 図1B）で密閉、加圧バイアルを記入してください。 </li><li>チップキャリアを反転させ、安定した面に置きます。液体培地からRootChipを削除し、チップキャリアの下部開口部にそれPDMS側を下に挿入します。オリエントチップができるように制御層入口を含んでいる側は、キャリア側の壁に圧力ラインのチューブのコネクタの側面に直面しています。 </li><li>上にカバーガラスを乾燥させる優しくティッシュペーパーでブロッティングによるチップの底面。テープと右全体のアセンブリとキャリアにRootChipを固定します。 </li><li>チューブコネクタは5 cmの長さの部分に柔軟なプラスチック製マイクロボアチューブ（タイゴン、0.20 &quot;ID X 0.060&quot; OD）を切断し、ステンレス鋼マイクロボアチューブ（ニューイングランド小さな管、0.025 &quot;外径x 0.013&quot; ID×0.75 &quot;にそれらを接続することによって作られてい長い）。チップ上の対応する制御層の入口に注射器とプラグインの各チューブコネクタを使用して、水でチューブコネクタを記入してください。水は後で制御層チャネルを記入し、マイクロメカニカルバルブへの圧力を送信するために使用することができます。 </li><li>メディア/溶液バイアル（S）に行の両端を差し込みます。空気のシリンジで溶液バイアルに圧力を適用します。溶液のバイアル内で増加した空気の圧力はラインに液体を強制します。 </li></ol> 5。顕微鏡でRootChipをマウントする<ol><li> microscにキャリアを配置OPEステージ。客室内に振動による実験の経過とともにシフトアセンブリの可能性を減らすために、キャリアは、ステージインサートのノッチに正確に適合する必要があります。 </li><li>チップを介してチップバルブや媒体の流れは空気の圧力によって制御されます。規制当局との2行はメイン圧ラインから分岐されている - つはチャネルを介してメディアの流れを制御するために使用され、もう一方は制御層のプッシュアップバルブを作動させるソレノイド空気バルブに接続されています。ソレノイドバルブは、USBバルブコントローラ（ラファエル·ゴメス·シェーベルイ、ローレンス·バークレー国立研究所によって開発された）を介してコンピュータから運営されています。チップを接続する前に両方の圧力レギュレーターを閉じます。 </li><li>アセンブリ内の湿度を高く保つためにキャリアの貯水池への水の数mlを追加します。この手順は、乾燥から植物を維持するために長い実験の過程で繰り返されるべきである。 tを最小限に抑えるためにボリュームを低く保つ顕微鏡の上にこぼしたことができる液体の彼は額。長期的な実験のために、チップの電源プラグをコンセントから流出はマイクロボアチューブ（ステップ4.4を参照）貯水池にチップのコンセントを接続することにより、キャリアの貯水池に導くことができる。また、チップの表面に蓄積流出は、ピペッティングにより回収することができる。 </li><li>シートプロテクター（Cライン）から、透明なプラスチックの二乗シートを準備します。アセンブリ内の高湿度を維持するために両面テープでキャリアに透明なプラスチックを修正します。 </li><li>チップ上のリングの光を置き、明/暗サイクルを維持しています。リングの光が直接照明は、画像コレクションを妨害するように、蛍光マーカーを使用するすべての実験の開始前にオフにする必要があります。 </li></ol> 6。 LabVIEWインタフェースを使用してRootChipを操作する LabVIEWソフトウェア·プラットフォームのRootChipコントローラインタフェースことができます当社のウェブサイトからダウンロードすることが<a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> 。 <ol><li>チップ上のバルブは、ソレノイド空気弁を開くことによって、このケースでは、制御層に圧力を適用することによりクローズされます。コントローラ·インタフェースは、バルブ番号下のボタンをクリックして、バルブの作動を可能にします。明るい緑色は、チップバルブ（ 図2B）の圧力と終了のアプリケーションを示しています。圧力レギュレータを開く前に、コントローラインターフェイスのすべての3つのソリューションの入口弁をアクティブにします。注：コントローラ·インタフェースは、システムのステータスの監視を可能にするフィードバックループを備えています。この機能は、コントローラ·インタフェースの &quot;リードバック&quot;ボタンをクリックしてアクティブにすることができます。 </li><li>制御層の圧力レギュレータを開き、当初は15 psiに設定し、フロー層のためにレギュレータを開き、最初に5 PSIに設定されています。依鼎所望の流量で、圧力が後で調整されることがあります。 </li><li>媒体とチャンバーをフラッシュするための選択肢の成長培地の入口バルブを開きます。 </li><li>顕微鏡下での流路を確認してください。通常、空気は流路の中に閉じ込めて、削除する必要があります。さらに、制御層のチャネルは、まだチューブコネクタ（デッドエンド充填）からの水によって強制的に交換する必要があり空気を含んでいます。両方のタスクは、すべての空気がPDMSへのチャネル（ &quot;脱気&quot;）から強制されるまで、8室の各々数回（5 psi）をフラッシングすることによって達成される。注：コントローラーインターフェースは実験を自動化するためにプログラムすることができます。そのようなルーチンは、脱チップに使用することもできます。 </li></ol> 7。代表的な結果 RootChipの主な目的は、高レベルの集積化を単一のデバイスのイメージングプラットフォームと灌流システムを組み合わせることです。操作を実証するために、根の微小環境の我々はダーク食品着色料（水耕培地中の1:4希釈）とチャンバーをフラッシュし、チャンバー内の流体の交換を測定した。 5 psiの推奨圧力で我々は、約1.5μL/分（ 図3）の計算の流量で10秒以内に完全な交換を測定した。 また、この場合、暗闇の中で成長し、外部のエネルギー源（ 図4）、10 mMグルコースに付属で、苗の根の成長を観察した。そのような媒体の光と組成物としての成長条件に応じて、植物は最大3日間までRootChipで観察することができます。 RootChipはフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）5-7に基づいて、遺伝的にエンコードされたナノセンサーを発現している根の細胞内グルコースとガラクトースレベルを監視するために使用されています。チップ内のルーツは、グルコースやガラクトース溶液の矩形パルスで灌流した（ <strong&gt;図5）。糖の細胞内レベルが監視され、ここに示されているドナーECFPの強度に対するアクセプターフルオロフォアシトリンの強度の比として表されます。比率の上昇は、糖の蓄積を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 RootChip原理 。 <ol class="ualpha"><li> RootChipは根の成長とイメージングのための8つの観測室を備えています。種子は初のプラスチックコーンの発芽 - プラスチック製のピペットチップから作製 - 固形培地で充填されている。根の先端には、媒体を介して成長し、液体培地の連続的な流れはチャンバー一定の条件を保持室に達しています。マイクロメカニカルバルブ（赤）の流れを制御します。チップは、光のカバーガラスに搭載されている。 スケーリングしないように描画します。 （グロスマンら 、2011植物細胞からの許可を得て適応。） </li><li> SCHダイアフラム（赤）と加圧ソリューションバイアルのEME。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 RootChipを接続して取り付け 。 <ol class="ualpha"><li>完全に接続されたRootChipとキャリアのトップビューには、倒立顕微鏡に取り付けられた。 </li><li>スキームは、弁システムとコントローラ·インタフェースを示す。シングルチャンバーに流体の流れを導くために設定弁の例が示されている。バルブ4つのバルブとして8の行為を通じて、一方で、バルブグループの3行為を介して0になります。このシステムでは個々のチャンバーは、バルブの組み合わせを活性化することによって対処することができます。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。観測チャンネルのソリューションの交換琥珀。染料溶液を用いて観察チャンバ内の流体の交換の可視化。画像は、明るいフィールドと色素信号の偽色の強度のオーバーレイです。 <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。オンチップの根の成長の蛍光を発現している単一の成長ルートの観察は、20Hのコース上にグ ​​ルコース/ガラクトースためのナノセンサーFRETが。時間形式：HH：MM、スケールバー：100μmである。 <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。用いた測定、細胞内の糖のレベルがナノセンサーをFRET。 <ol class="ualpha"><li>センサーの量は、根端内シトリン強度（左）と表示されます。細胞は、グルコースやガラクトースソリューションのアプリケーションへのナノセンサーFRETの応答は、レシオメトリック画像として表示されます。 （グロースマンらから許可を得て適応。、2011プラNT細胞）スケールバー：100μmである。 </li><li>トレースは、グルコース（緑色）とガラクトース（赤）の3繰り返し方形波パルスに対する応答として比の変化をFRETが。 </li></ol>

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利害の衝突が宣言されません。

従来の成長方法に比べてRootChipの主な利点は、顕微鏡検査のために低侵襲の準備、可逆的に繰り返しルート環境を変更する機能、および数日間にわたって発達有能かつ生理学的に健康な組織の連続観測のための能力です。以前は、苗はゲルメディアに垂直に成長させただけで時間8時、単一の根を測定する実験を許可、直前の灌流システムに転送されます。マイクロ流体のツールは、シロイヌナズナのために、低集積度9または灌流制御10せずに使用されています。 RootChipは、正確なフローガイダンスを通して実験を自動化する機能との統合を高いレベルで兼ね備えています。このプラットフォームのもう一つの利点は、すべてのマイクロ流体デバイス11の特徴は、その液体の最小限の量が必要なナットでルートを入力する必要がありますです。でも、数日間にわたる実験のためのrients、。 RootChipは現在、シングルユースデバイスとして設計されたが、チップの製造コストが低いので、消費される試薬の少量はまだ非常に費用対効果の高いチップを作るされています。 苗の健康を保証するために注意する必要がありますいくつかの重要なステップがあります。 プラスチック製の円錐の体積は、空気にさらされると乾燥を開始します3〜4μlを、である。したがって、それはコーンがすぐにチップ上に転送され、根が十分な水でそれらを供給する観測室を、到達するまで湿度が高く維持されていることが重要です。ステップ4.2から4.5までは、苗木の乾燥を防ぐために迅速かつ中断せずに実行する必要があります。 ステップ3.5から3.8まで根が観察室に成長する間に、液体媒体中のチップのインキュベーションを記述します。この手順は、cにチップをマウントすることで、スキップされることがありますarrierはすぐに、成長培地で一定の灌流を開始します。それはいくつかの利点があるのでしかし、我々は、一晩増殖培地中に浸漬をお勧めします。苗は、彼らが観察室に成長するように乾燥になる可能性が低くなりますので、湿度の高い環境を作成する1）、2）チップが液体に浸しているので、脱気し（ステップ6.4）が速くなります。 低溶質濃度のメディアを使用することが重要です。より濃縮されたソリューションは、チップが数日間にわたって使用されている場合は特に、沈殿およびチャネルを詰まらせる可能性があります。 デバイスは、空気圧ラインに接続されると、媒体の流量は、バルブの油圧圧力を変えることにより制御されます。マイクロメカニカルバルブの適切なクロージャを保証するためには、流量、圧力の約3倍高くなって制御圧を選択することが重要です。流体が根口から押し出されるようにフローの圧力は15 psiを超えないようにしてください。より高い圧力ミリアンペアyは、チップが使用不能になり、チップの剥離が発生します。 RootChipの制限は、PDMSは、多孔質疎水性であるということです。材料は、水溶液に実質的に不活性であるが、それは有機化合物12を吸収することができます。これは、有機化合物はこの化合物の供給が入口で停止されていても、材料から漏れる可能性があるソリューションの迅速な交換を妨げる可能性があります。多孔性に起因する、有機溶剤を使用すると、PDMS 12の腫れの原因となります。 我々は、作物の根とRootChipを最適化し、例えば、その有用性を拡張し続けています。我々は治療法や観察のルートへのアクセスを改善することにより、RootChipのような流体のツールはルート研究の新たな次元を開くと信じています。

<table border="1"><tbody><tr><td> アイテム </td><td> ソース </td><td> 情報 </td></tr><tr><td>チップキャリア、ソフトウェアおよびその他の情報を表示します。 </td><td>カーネギー研究所 - DPB </td><td>キャリアの製造、コントローラソフトウェアと詳細については、CADやCNCのファイルはWebサイトからダウンロードできます<a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchipの</a>キャリアも、このウェブサイトから注文することができます。 </td></tr><tr><td> RootChip </td><td>スタンフォードファウンドリー</td><td>マスクのデザインと製造プロトコルはリクエストを承ります。すぐに使用できるRootChipsはから注文することができ<a href="http://www.stanford.edu/group/foundry/" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/</a> </td></tr><tr><td>チップコントローラ</td><td> 家庭を内蔵</td><td>自動バルブコントローラシステムは、もともとラファエル·ゴメス·シェーベルイ、ローレンス·バークレー国立研究所によって開発されました。どのようにあなた自身の作動バルブコントローラを構築するための詳細な命令を見つけることができます<a href="https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers" target="_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers</a> </td></tr></tbody></table>

rootchipを使用して、ルート環境の急激な操作によるシロイヌナズナの根の成長のタイムラプス蛍光イメージング

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

ルートプラントの物理的なアンカーとして機能し、そのような植物が土壌から取得する窒素、リン、硫酸塩および微量元素などの水やミネラルの栄養素の取り込みに関与する器官である。我々は、高収量を生産する持続可能なアプローチを開発する場合、我々がより良いルートが開発方法を理解する必要があり、栄養素の広い範囲を占めており、共生と病原生物と相互作用する。これらの目標を達成するために、我々は数分間から数日間までの期間にわたって微細な詳細にルーツを探索できるようにする必要があります。 ベースのマイクロ流体デバイス、イメージング1（ 図1）の準備中に根に物理的なストレスを回避しながら、シロイヌナズナ実生から私たちが成長することができ、画像の根-私たちはRootChip、ポリジメチルシロキサン（PDMS）を開発しました。このデバイスは、流体の流れを誘導するマイクロメカニカルバルブを備えた分岐チャネル構造が含まれていますソリューションの入口から8観察室2の各々へ。この潅流システムは、ルートの微小環境を制御し、精度と速度を変更することができます。チャンバーの容積は、このように試験溶液の最小限の量を必要とする、約400 nlのです。 ここでは、実際の時間分解能でのイメージングベースのアプローチを使用してRootChip上のルート生物学を研究するための詳細なプロトコルを提供しています。根は時間経過顕微鏡を用いて数日間にわたって分析することができます。根は、培養液または阻害剤を灌流することができ、最大8つの苗を並行して分析することができます。このシステムは、化学物質、遺伝子発現の蛍光ベースの分析、バイオ分析の存在下または非存在下で根の成長の分析などのアプリケーションの広い範囲の可能性を秘めている、例えば、ナノセンサー3を FRETの。

この資料では、RootChipのシロイヌナズナ実生の栽培のためのプロトコル、細胞内の代謝産物レベルの微視的なルートのモニタリングおよびFRETベースの測定と成長条件の自動制御を組み合わせたマイクロイメージングプラットフォームを提供します。

RootChipを使用して、ルート環境の急激な操作によるシロイヌナズナの根の成長のタイムラプス蛍光イメージング

根は植物を物理的に固定するアンカーとして機能し、水や窒素などの無機養分を吸収する役割を担う器官である。

最大限の収量を確保するためには、植物に一連の栄養素を供給する必要があります。栄養不足や、寒冷または極端な高温、干ばつ、病原体などのストレスは、毎年甚大な作物収量の損失を引き起こします。これらの問題の多くは、多くの場合、地中で発生しています。根は植物を物理的に固定する役割を担っていますが、水分や、窒素、リン、硫酸塩、および多くの微量元素などの無機栄養素を吸収する器官でもあります。作物の高収量を実現するための持続可能なアプローチを開発するには、根がどのように発達し、幅広い栄養素をどのように吸収し、共生生物や病原生物とどのように相互作用するかをより深く理解する必要があります。そのためには、当然のことながら、根を顕微鏡レベルで探索できなければなりません。根の生物学的研究は、植物の地上部の研究よりも常に困難を伴ってきました。根は通常地中に隠れているため、顕微鏡を用いた研究で容易に観察することはできません。土壌から根を抜き出すと根系に深刻な損傷を与えるため、根の挙動を研究する方法としては不適切です。根をより観察しやすくするための解決策の一つは、この例で示すように、種子や水耕栽培培地で育成することです。ゲル培地や水耕栽培培地を用いた育成計画は、多くの根の研究で非常に有効に活用されてきましたが、これらの方法では、根を顕微鏡レベルの詳細で、かつ長期間にわたって観察することは依然として困難です。成長している根に可能な限り近づき、かつイメージングの準備による物理的ストレスを回避するため、我々は根の育成とイメージングを可能にし、同時に根の微小環境を非常に高い精度と速度で制御および変更できるプラットフォームを構築しました。このプラットフォームを「ルートチップ」と呼びます。ルートチップは、シリコンベースの有機ポリマーであるPDMSから作製されたマイクロ流体デバイスです。このチップは、rabbit opsisの苗の根を成長させ、イメージングするための観察室を備えています。種子は、まずプラスチック製ピペットチップで作製し、固形培地を充填したプラスチックコーン内で発芽させます。その後、根端が培地の中を伸びて観察室に到達し、そこでは液体培地が絶えず流れることで、室内条件が維持されます。スタンフォード大学のSteve Quakeの研究室で開発された定常マイクロメカニカルバルブが、ここでは赤色のコントロールとして示されています。チップが顕微鏡で一般的に使用される透明なカバーガラス上に搭載されているため、観察チャンバー内のすべてのプロセスを倒立顕微鏡でモニタリングすることが可能です。流体の流れを誘導する分岐チャネル構造を顕微鏡下で確認できます。ルートチップは2つの層で構成されており、バルブを含む制御層と、成長培地や試験溶液が観察チャンバーへ流れるチャネルを含むフロー層からなります。これらのチャンバーの容量は約400 nanolitersです。これにより、ごく少量の溶液で済むため、条件を非常に迅速に変更することが可能です。本プロトコルでは、8本のArabidopsis幼苗の生きた根をルートチップ上で並列的に顕微鏡イメージングするための調製方法と、最大3日間にわたる観察方法について説明します。まず、培地が液状のうちに、1% agarを含む成長培地を10 mmのペトリ皿に満たします。マルチチャンネルピペットを使用して、ペトリ皿から5 µLの培地を10 µLピペットチップに満たします。満たしたチップは、培地が凝固するまでピペットチップボックスに保管します。次に、4 mmの長さのプラスチックコーンを切り出し、固形培地を入れたシャーレの中に直立させて配置します。表面滅菌後、単一の種子を培地を満たしたコーンの上部に置きます。その後、シャーレをマイクロポアテープで密封し、発芽を同期させるために4 °Cで保存します。3日後、プレートを発芽させるために育成キャビネットに移します。本実験における育成条件は23°Cとします。16時間の明期と8時間の暗期のサイクルで、発芽から5〜7日後に、苗をルートチップへ移転させる準備が整います。この際、苗の健康状態、根の長さ、および該当する場合は蛍光マーカーの発現を解剖顕微鏡下で確認してください。苗の根端がプラスチックコーンの底部の出口に達し次第、チップへ移送するための個別の苗をマークします。ルートチップへの移送中に損傷する場合に備え、10本程度の苗を選択してください。長期的な実験を行う場合は、装置をティッシュで包み、ガラス製のペトリ皿に入れ、オートクレーブで滅菌します。このチップは直前にオートクレーブ滅菌したものです。チップを冷却した後、液体増殖培地を上層に加えます。チップ全体を完全に覆うようにしますが、液面はチップ表面から3 mmを超えないようにしてください。20 µL ピペットを使用して、根の入口から培地を吸い上げ、チャンバーの出口へと流します。これにより、観察チャンバーに培地が満たされます。培地を入れた後、プラスチックコーンでルートチップを封止します。コーンは入口にぴったりと収まるようにしてください。ルートチップは薄い光学ガラス層上に固定されているため、チップに過度な圧力をかけないよう注意が必要です。この手順により、チップが浮き上がらないよう液体培地の中で一晩インキュベートする準備が整います。2枚のガラススライド（うち1枚は半分に切ったもの）をチップの上に配置します。マグネチックスターラーバーを加え、ディッシュを閉じます。このアセンブリをマグネチックスターラーに移し、培地を緩やかに撹拌することで、根がアウトレットに向かって成長するように促します。ルートチップの入口は、所望の方向への成長をさらに促進するため、角度をつけて穿孔されています。チップの出口とは反対側の端を持ち上げ、アセンブリをわずかに傾けてください。チップをリングランプで照射し、明暗リズムを維持するためにタイマースイッチに接続します。一晩の培養後、密閉可能な耐圧バイアルに液体成長培地を準備します。苗の乾燥を防ぐため、以下の手順は迅速に、中断することなく行う必要があります。チップを液体培地から取り出し、同様に反転させたチップキャリアの底部開口部に逆さまに配置します。このとき、コントロール層のインレットがある面が、キャリア側壁にある2つの大きなコネクタが接続される圧力ライン側に面するようにチップを方向付けなければなりません。チップ底面のカバーガラスをティッシュペーパーで軽く吸い取って乾燥させ、キャリアに固定します。次に、テープを用いてアセンブリ全体を反転させます。チューブコネクタにシリンジを用いて水を満たし、各チューブコネクタを対応する入口に接続します。チップ上での操作。チューブを培地および溶液に接続します。次に、溶液バイアルにシリンジで空気を注入して圧力をかけ、ライン内からバイアルと空気を除去します。その後、キャリアを透明プラスチックで覆います。アセンブリ内の高湿度を維持するため、キャリアを顕微鏡ステージ上に配置します。キャリアがステージの切り欠きに正確に収まるようにしてください。チップバルブおよびチップ内を流れる培地のフローは、空気圧によって制御されます。メインの圧力ラインからレギュレーターを備えた2本のラインが分岐しています。一方は流体の流量制御に使用され、もう一方は電磁エアバルブに接続されています。これらのバルブはUSBバルブコントローラーを介してコンピュータから操作され、チップ上のバルブを作動させる役割を担っています。チップを接続する前に、両方の圧力レギュレーターを閉じておく必要があります。次に、チューブ、コネクタ、および溶液バイアルを対応する圧力ラインに取り付けます。その後、キャリアのリザーバーに数 mL の水を加えます。長時間の実験では、このステップを繰り返す必要がある場合があります。湿度を高く維持するため、顕微鏡上に液体が漏れる可能性を最小限に抑えるよう、注入量を調整してください。実験が開始されるまで明暗サイクルを維持するため、リングライトをチップの上の位置に移動させます。チップ上のバルブは、この場合はソレノイドエアバルブを開いて圧力をかけることで閉じられます。LabVIEWインターフェースでは、バルブ番号の下にあるボタンをクリックすることでバルブを制御できます。明るい緑色は、圧力が印加され、チップバルブが閉じていることを示しています。この概略図はバルブシステムの構成を示しています。バルブ4から8は単独のバルブとして機能し、バルブ0から3はグループとして機能します。このシステムでは、バルブを組み合わせて動作させることで個々のチャンバーを指定できます。例えば、流体を上から3番目のチャンバーだけに誘導するには、バルブ0、3、および4を閉じる必要があります。さらに、バルブ6、7、および8は、インレットA、B、およびCの洗浄に使用する溶液を制御します。ここで、3つの溶液インレットバルブをすべて作動させて閉じます。コントローラーのインターフェースには、システムのステータスを監視するためのフィードバックループが搭載されています。この機能は、リードバックボタンをクリックすることで有効になります。まず、制御層の圧力レギュレーターを開き、15 PSIに設定します。次に、フローレイヤーのレギュレーターを開き、5 PSIに設定します。選択した培養液の入口バルブを開き、チャンバー内を培養液でフラッシュします。この際、顕微鏡下で液流経路を確認してください。多くの場合、チャネル内に気泡が混入しているため、これを除去する必要があります。さらに、コントロールエアのチャンネル内にはまだ空気が含まれており、これを押し出してチューブコネクタからの水に置き換える必要があります。このプロセスはデッドエンド充填と呼ばれます。これら両方の作業は、8つの各チャンバーを数回フラッシングし、チャンネル内のすべての空気がPDMS内に押し出されるまで行うことで達成されます。このシステムは、実験を自動化するようにプログラムすることが可能です。このようなルーチンは、チップの脱気にも利用できます。ルートチップの主な目的は、イメージングプラットフォームとプロフュージョンシステムを単一のデバイスに統合することです。根の微小環境の制御を実証するため、チャンバー内に染料を流し、チャンバー内の液体の交換を測定しました。推奨圧力である 5 PSI において、算出された流量は約 1.5 microliters per minute であり、10 秒以内に全交換が行われることを確認しました。また、暗所で育成し、外部エネルギー源として 10 millimolar glucose を供給した苗の根の成長についても観察しました。光や培地組成などの生育条件に応じて、植物をルートチップ内で最大3日間観察することができます。このシステムは、遺伝子組み込み型ナノセンサーを発現する根において、細胞内のグルコースおよびガラクトースレベルをモニターするために使用されてきました。FRET（蛍光共鳴エネルギー転移）に基づくこれらのセンサーは、Frommer研究室で開発されました。本実験では、チップ内の根にグルコースまたはガラクトース溶液を方形波パルスで灌流させました。細胞内の糖レベルをモニタリングし、左図にアクセプターであるfluoro four citrineの強度とドナーであるECFPの強度の比率として示しています。中央の根端のレシオメトリック画像ではセンサーであるcitrineの量を観察しており、右図では、グルコース（緑色）およびガラクトース（赤色）の3回の繰り返し方形波パルスに対する応答としての糖量の推移をトレースしています。比率の上昇は、糖の蓄積を示しています。従来の育成方法と比較してルートチップの主な利点は、顕微鏡観察のための準備が低侵襲であること、根の環境を可逆的かつ繰り返し変更できること、そして発達能を有し生理的に健全な組織を数日間にわたって連続的に観察できることです。もう一つの非常に重要な利点は、根に必要なすべての栄養素を長期間供給するために、最小限の量の液体で済むことです。これにより、特に高価な試薬を使用する場合において、ルートチップのコスト効率が非常に高くなります。私たちは、この重要な器官を治療や観察により適した状態にすることで、ルートチップのようなマイクロ流体ツールが植物研究に新たな次元を切り拓く可能性があると信じ、ルートチップの最適化と利便性の向上を続けています。ルートチップシステムの構築方法に関する詳細は、当社のウェブサイトでご確認いただけます。チップはStanford Foundryで注文可能です。

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