大型単層小胞とBcl-2ファミリーの機能を調べる

この生化学的に定義された巨大単層小胞（LUV）のモデルシステムは、ミトコンドリア外膜を模倣しており、BCL2ファミリータンパク質の機能をin vitroで観察するために用いられます。まず、脂質を混合し、密閉バイアル内で脂質膜を作成します。次に、新鮮なLUV溶液を調製し、脂質膜を可溶化させます。

次に、脂質溶液を押し出し、ゲル濾過によって大単層小胞（LUV）を精製します。最終ステップとして、界面活性剤誘導によるLUVの蛍光増加を分析します。最終的に、このLUVモデルシステムを用いて、組換えBCL2タンパク質のような膜透過性タンパク質の機能と調節を評価します。

巨大単層小胞を用いたこのアプローチは、ミトコンドリアなどの既存のシステムと比較して、いくつかの利点があります。タンパク質が存在しない状態で精製脂質を用いて作製されるため、組成とサイズの両方が生化学的に定義されています。

これにより、調査対象となるタンパク質を自身で添加したもののみに限定できるため、結果を明確に解釈することが可能になります。この手法は、BCL2ファミリーがミトコンドリア外膜の完全性を調節する能力に関するメカニズム的な洞察を得るために有用です。また、膜のリモデリングや透過活性を調査する他の系にも適用できます。

これには、ミトコンドリアのダイナミクス機構や細菌由来の毒素などが含まれます。照明を最小限に抑えたドラフトチャンバー内で作業してください。ハミルトン社製Gast型ガラス製シリンジをクロロホルムで洗浄します。

次に、1.5 mLのGLガラスバイアルに、クロロホルムで溶解させた4 mgの脂質を合わせます。続いてクロロホルムを除去するため、窒素やアルゴンなどの不活性ガスの緩やかな気流を当てます。2〜3時間後、バイアルの底面と側面にLUVバッファー中で乾燥した脂質膜が形成されていることを確認します。

ポリ陰イオン色素とCASイオン性クエンチャーの溶液をそれぞれ500 µL調製し、ボルテックスします。これらの溶液を混合します。次に、A NTS溶液とDPX溶液を合わせて1分間ボルテックスし、超音波洗浄機で超音波処理して、溶液を完全に溶解させ均一にします。

次に、A-N-T-S-D-P-X溶液を脂質膜に加え、バイアルをパラフィルムで密閉します。脂質膜を5分間ソニケーションしてください。ソニケーション後、溶液は乳白色になります。小さな脂質凝集体は以降の工程に悪影響を及ぼすため、溶液が完全に可溶化していることを確認してください。また、バイアルの底や側面に脂質膜が残っていないかを確認してください。

メーカーのガイドラインに従ってエクストルーダーを組み立てます。その際、LUVバッファーを用いてフィルターサポートとポリカーボネートメンブレンを湿らせてください。押し出し操作中に液量減少が起きないようユニットのケーシングを締め付けますが、締めすぎないように注意してください。メンブレンを破裂させないよう、LUVバッファーを用いてエクストルーダーをテストし、漏れや問題がないことを確認します。次に、右側のシリンジに脂質溶液を満たし、大きなELLA小胞が少なくとも1回はメンブレンを通過するように31回押し出しを行い、左側のシリンジに回収します。溶液が突然急速にメンブレンを通過する場合、最初の数回の押し出しには少し強めの圧力が必要になることがあります。

メンブレンに破損がないか確認し、必要に応じて交換してください。一度の操作でカラムに加えてください。ビーズの界面を乱さないように注意してください。

バッファーをカラムから流し切ります。流れが止まったら、カラムをプラグで塞ぎ、ビーズを乱さないように注意しながら LUV バッファーをゆっくりと満たします。その後、プラグを取り外し、1 mL ずつ6つのフラクションを回収します。

AUVは通常、分画3および4で溶出し、白濁した外観によって識別できます。カラム洗浄液を回収し、4°Cで保存してください。カラム分画中のUUVは、CHAPSの存在による蛍光の増加によって検出されます。すべてのLUV研究には、黒色の不透明な96ウェルプレートを使用してください。

LUVバッファーまたは0.5% CHAPS添加LUVバッファーを100 µLずつ6つのウェルに分注します。それぞれに適切な分画を5 µL加え、biotech H one synergyのために混合します。Gen5 2.0ソフトウェアを起動し、励起波長を355 nm、蛍光波長を520 nmに設定します。

光学系ポジションを上部の125に設定し、ゲイン電圧を調整して、リードハイトを5.5 millimeters上げます。次に、37 degrees Celsiusでプレートを読み取り、LUVを含むフラクションを特定します。精製されたLUVのフラクションを回収します。

これらのアッセイは、BCL2ファミリータンパク質がLUVの透過性を直接的に誘導する能力および、その透過活性の調節を測定するように設計されています。アッセイ成分を添加順に組み合わせてください。BSおよびbidタンパク質のタイトレーションに関する詳細は、付属の論文でご確認いただけます。

各アッセイのタイムポイントに合わせて、反応液を37 °Cでインキュベートします。プレートをマイクロプレートリーダーに挿入し、先に示した手順に従ってプレートを振盪し、蛍光を測定します。この実験では、OG界面活性剤で活性化したリポソームを用いて、LUV透過性のポジティブコントロールを作成します。

なお、0.025%未満のOG濃度は、本系におけるLUVの透過性に直接的な影響を与えません。また、アッセイあたりのLUV蛍光の最大量を決定するために、0.5% chaps処理も用いられています。BCL2ファミリータンパク質によるLUV透過性を研究するための不可欠な出発点は、最適な放出を促進するBaxおよびBidの濃度を確立することです。

これらのBacsおよびBidの滴定曲線は、最小限のバックグラウンド放出と最適なシナジーを示しています。あるいは、LUVの透過性を速度論的に測定することも可能です。これらの測定は、各測定前に2秒間の緩やかなプレートシェーキングを行い、30分間、2分ごとに実施しました。

この実験では、抗アポトーシスタンパク質がBaxおよびBid依存的なLUV透過性に及ぼす影響を決定します。BCL-XLは、BaxおよびBidの活性を用量依存的に抑制します。D-repressionアッセイにおいて、この抑制効果は、その後にBH3のみドメインタンパク質を添加することで解除できます。

例えば、puma betaはBCL-xLに結合し、これによりBaxとBidが相乗的に作用して膜透過を誘導します。この巨大なELLA小胞の作製技術を習得することで、外膜に類似した生化学的に定義された環境下において、BCL-2ファミリータンパク質、ペプチド、および低分子化合物の効率的かつ迅速な解析が可能になります。重要な点として、このアッセイにより、エンドポイントおよび速度論的パラメータの両方を用いて、数百もの条件を迅速に解析することができます。

UUVおよびBCL-2タンパク質のいずれも界面活性剤によるアーティファクトの影響を非常に受けやすいことに注意してください。再現性のある結果を得るために、界面活性剤を取り除いた清潔な器具を使用してください。