Name: 蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 学ぶ、蛍光顕微鏡法を用いてライブ哺乳類細胞内のプラスミド複製を複数世代にわたって追跡する方法。ラクトースオペレーター配列と蛍光標識ラクレプレッサー蛋白質を利用し、細胞分裂時のウイルスゲノム分配を可視化する。

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この作品は、NIHとACS、T32CA009135含む、CA133027、CA070723、およびCA022443からの補助金によって賄われていた。ビルサグデンは、アメリカ癌協会の研究教授である。

1。可視プラスミドを有する細胞のエンジニアリング<ol><li>視覚化するプラスミドにラクトースオペレーター配列（LACO）の約250部を含むDNA断片を導入するために標準の制限酵素消化または相同組換え技術を使用しています。私たちのプラスミドは約170 kbpのバクミドだっおよびハイグロ12にカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスの全ゲノム（KSHV）とエンコードされた抵抗を含んでいた。 </li><li>リポフェクタミン2000を用いたトランスフェクションにより、哺乳動物細胞へLACO含有プラスミドDNAを導入。我々は、25μlのリポフェクタミン2000、0.5ミリリットルのOptiMEM、および3.5ミリリットルDMEMで精製プラスミドDNA10μgを4時間の場合は60 mmディッシュでHeLaおよびSLK細胞をトランスフェクションした。 </li><li> 10％ウシ胎児血清および48時間インキュベート細胞と5ミリリットルDMEMに培地を変更します。 </li><li>プレート導入ナンプラーための抗生物質の選択を含む培地中で大きな皿や培養細胞における低密度での細胞SMID、我々は3週間300μg/ mlのハイグロマイシンを10％ウシ胎児血清を含むDMEM中で細胞を選択した。 </li><li>新しい培養皿にハイグロマイシン耐性コロニーを転送するために、滅菌したトリプシンに浸したろ紙の小片を使用しています。 </li><li>トランスフェクトされたクローンは皿を埋めるために成長しているときは、プラスミドLACOのポリマーが均一に、予想されたサイズのあることを確認するブロッティング、制限消化し、サザンのためにDNAを単離する。 </li><li>プラスミドはlacIの融合を発現するように設計されていない場合は、そのようなLacIリ-tdTomatoとして赤色蛍光タンパク質と融合ラクトースリプレッサー（LACI）をコードするレトロウイルスを適切なクローンを感染させる。我々はtdTomatoはなく長い時間13を介して複数のエクスポージャーから生じるであろうphotoxicityを最小限にするために緑色に近い蛍光を発するタンパク質を使用しています。 </li><li>バインディングからの融合タンパク質をブロックするように200μg/ mlのイソプロピル-BD-ガラクトシド（IPTG）の存在下でLacIリ融合タンパク質が導入されると、細胞培養DNA。 </li><li>文化少なくとも3日間の細胞は、lacI-tdTomatoタンパク質の発現を可能にする。 </li><li>バインドされていない融合タンパク質の最小限のバックグラウンドレベルとの明確なシグナルを明らかLacIリ-tdTomatoの最適レベルとのそれらのためのスクリーンのクローン（IPTGを洗い流し、下記のようにセルを表示することによって）。 </li></ol> 2。イメージングシステムの開発当社のイメージング·システムは、電動ステージと計画Aochromat 63x/1.4油浸対物装備ZEISS AXIOVERT 200Mで構成されています。蛍光励起光がコリブリシステムのLEDが &quot;昼白色&quot;によって提供されています。 1024 EMCCDカメラ：発光がCascadeIIによって検出されます。これは、信号を増幅するゲイン·レジスタを用いて冷却、裏面入射型カメラです。暗電流は、毎秒画素あたり0.061電子であり、量子効率は0.90より大きい。システムはSmartExperimentsモジュールを含む、AxioVisionの4.8ソフトウェアによって制御されます。 tdTomaの検出のための我々はそのために通過した光の85％が蛍光と放出された光の95％を励起することができるツァイスフィルターセット75HEを使用すると、発光フィルターを通過します。 <ol><li>複数の長い時間間隔で連続して画像の自動取得のために敏感な信号の検出、特定の励起と高速シャッター、電動ステージとフォーカスアーム用LED光源、およびソフトウェア制御用倒立顕微鏡とEMCCDカメラとイメージングシステムを組み立てるZ-スタック。システムは、振動から隔離される空気テーブルの上に座ってください。 </li><li> 37℃、加湿チャンバー内の5〜10％のCO 2で細胞を維持するために、ステージトップインキュベーターを組み立てる。実験中に動きのアーチファクトを最小限に抑えるために安定した温度に来るシステムのための十分な時間を確保します。 </li><li>サンプルから熱を吸い上げるから客観を防ぐために客観的なため、加熱されたカラーを使用しています。 </li></ol> 3。標識されたDNAの可視化<ol><li> 35ミリメートルの板細胞セルのペアが重ならずに8月16日細胞のコロニーに分割することができます10％未満の合流点の密度でガラスボトムディッシュ、。生存細胞が分裂する時間を持つようにイメージを作成する前に、この少なくとも24〜48時間を行う。 </li><li>撮影開始前に1〜3時間、選択的薬剤およびIPTG両方を欠いている培地でプレートを3回すすいでください。この手順では、離れて、非生存細胞を洗浄およびlacI融合タンパク質はプラスミド中LACOサイトをバインドすることができます。 </li><li> 10％ウシ胎児血清および25mM HEPESで2ミリリットルDMEMで培養液を交換してください。 </li><li> 35mmディッシュ用取付リングに延伸CultFoilと培養皿の上部を元に戻します。このカバーは、時間をかけて塩濃度を増加させ、細胞を殺す培地の蒸発を抑制します。 </li><li>セルを表示し、ビューの複数のフィールド内のセルの上部と下部の焦点面を決定する微分干渉コントラスト（DIC）のイメージングを使用しています。各フィールドで、セルの上部から焦点面に道の約1/3を下に移動します。 x、yを保存し、zが保存されてステージ位置のリストに座標。 注：プラスミド信号は細胞があるlacI融合タンパク質を適切な波長のLEDによって照らされる接眼レンズを介して表示されない場合があります。弱い信号だけ時間をかけて信号の統合を可能にし、したがって効果的に弱い信号を増幅EMCCDカメラの使用、と見えるかもしれません。 </li><li>顕微鏡制御ソフトウェアでは、保存された各ステージの位置で実行される画像のzスタックを定義します。 z次元14に近似ナイキスト·サンプリングにあなたをできるようになります0.35から0.50μmのAZのステップサイズを選択してください。細胞周期の間の細胞の動きに従い、これらのスライスは、検出を可能にし、また画像スタックの取得後の処理（デコンボリューション）で使用され、細胞が置かれている面の上下に &quot;余分な&quot;スライスが含まれています。この包含は意志セルの厚さに応じて、40から60までの画像をスタックにつながる。 </li><li>顕微鏡制御ソフトウェアでは、（プラスミドを可視化するための10から60分間隔で30分間隔（長時間にわたって細胞分裂および移行を追跡するため）と蛍光画像でZ-スタックの明視野像を収集するために、時系列の実験を定義細胞内で）。それは長い間実験の過程で光毒性を不必要に細胞を公開することができます標準の明視野像、より多くの光を必要とするため、実験中にDICのイメージングを使用しないでください。 </li><li>ソフトウェア制御の実験を開始します。システムが妨害されないことを確認します（等、過剰な室内光にさらされ、バンプ）実験中。 </li><li>必要に応じて、実験中に加湿システムで水を補給してください。 </li></ol> 4。画像の取得後の処理<ol><li>各zスタックと時間ポイントの画像を確認してください。の不要な領域を切り抜く次のステップでコンピュータの処理時間を短縮するための画像。 </li><li>各zスタック15で原点の画素に信号強度を再割り当てするにはデコンボリューションアルゴリズムを使用します。このデコンボリューションは、イメージングシステムのための理論的な点広がり関数に基づくこ​​とができますが、それは、イメージング蛍光ミクロスフェアによる特定のシステムの点広がり関数を測定し、デコンボリューションアルゴリズムでは、この測定値を使用することが好ましい。私たちは、イメージングシステムの点広がり関数を測定し、適用AxioVisionのソフトウェア（AxioVisionのソフトウェアの説明、ツァイス）の最尤反復アルゴリズムを拘束されています。 </li><li>細胞周期と娘細胞へのプラスミドのパーティションの分割中にプラスミドの強度変化と動きを追跡するために画像を調べます。 </li></ol>

<ol><li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).</li>
<li>Chang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li>
<li>Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fields+Virology+2+volume+set%22">Fields Virology 2 volume set</a>. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).</li>
<li>Adams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+latent+Epstein-Barr+virus+genomes+in+Raji+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells.</a> J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).</li>
<li>Humme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EBV+nuclear+antigen+1+%28EBNA1%29+enhances+B+cell+immortalization+several+thousandfold%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).</li>
<li>Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimal+replicator+element+of+the+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+terminal+repeat+supports+replication+in+a+semiconservative+and+cell-cycle-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner.</a> J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).</li>
<li>Yates, J. L., Guan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-derived+plasmids+replicate+only+once+per+cell+cycle+and+are+not+amplified+after+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells.</a> J. Virol. 65, 483-488 (1991).</li>
<li>Ye, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+latent+nuclear+antigen+leads+to+abortive+episome+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence.</a> J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).</li>
<li>Robinett, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).</li>
<li>Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coupling+of+synthesis+and+partitioning+of+EBV%27s+plasmid+replicon+is+revealed+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells.</a> Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).</li>
<li>Herndier, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+human+Kaposi%27s+sarcoma+cell+line+that+induces+angiogenic+tumors+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals.</a> Aids. 8, 575-581 (1994).</li>
<li>Zhou, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+infection+by+a+recombinant+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+cloned+in+a+bacterial+artificial+chromosome%3A+application+for+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis.</a> J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).</li>
<li>Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCannell%2C+MB+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここで説明する方法は、複数の世代にまたがる時間をかけて生きた哺乳動物細胞におけるプラスミドをフォローするために使用できます。励起光への曝露を制限することによって、我々は、少なくとも72時間、3細胞分裂を表す16から32細胞のコロニーを通って新しく分割ペアからセルをフォローするために、これらの技術を使用している。これらの実験は、このような定量的PCR、サザンブロッティング、魚のような静的なアッセイから得られない情報を提供します。 このようなタンデムLACO繰り返されるような反復配列を有するプラスミドを使用するときに転位が発生する可能性があるとして、それは、均質な構造を持つプラスミドの細胞のクローンをスクリーニングすることが不可欠である。また、最適な信号強度のために感染した細胞のレトロウイルス感染と画面クローンを最適化することが有用である。あまりにも多くのLacIタンパク質を発現する細胞は、核内に高いバックグラウンド蛍光を持つことになり、あまりにも少し発現するものでは弱い信号を持つことになります。最後に、私はsは、重要な細胞の形態を見て、その可視化時に使用するビューのフィールドをマーキ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> OptiMEM中</td><td> GIBCO </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> Hyclone社</td><td> SH30910.03 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン</td><td>シグマ</td><td> P3032 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸ストレプトマイシン</td><td>シグマ</td><td> S9137 </td><td></td></tr><tr><td>ハイグロマイシン</td><td>カルビオケム</td><td> 400050 </td><td> SLKのための400μg/ mlの、HeLa細胞では300μg/ mlの</td></tr><tr><td>イソプロピル-BD-ガラクトシド（IPTG） </td><td>ロッシュ</td><td> 10 724 815 001 </td><td>最終濃度が200μg/ mlの</td></tr><tR&gt; <td>リポフェクタミン2000 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11668-027 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td>ガラスボトムディッシュ</td><td>マテック</td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> CultFoil </td><td> Pecon </td><td> 000000-1116-08 </td><td></td></tr><tr><td> AXIOVERT 200M </td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コリブリ</td><td>ツァイス</td><td> 423052-9500-000 </td><td></td></tr><tr><td>中性の白色LED </td><td>ツァイス</td><td> 423052-9120-000 </td><td></td></tr><tr><td>フィルターキューブ75 HE </td><td>ツァイス</td><td> 489075-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td>プラン·アポクロマート63x/1.4客観</td><td>ツァイス</td><td> 440762-9904-000 </td><td></td></tr><tr><td> CascadeII：1024 EMCCDカメラ</td><td> Photometrics </td><td> B10C892007 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrolミニ</td><td>ツァイス/ Pecon </td><td> 000000-1116-070 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol 37から2デジタル</td><td>ツァイス/ Pecon </td><td> 000000-1052-320 </td><td></td></tr><tr><td> CTIコントローラー3700デジタル</td><td>ツァイス/ Pecon </td><td> 411856-9903 </td><td></td></tr><tr><td>客観ヒーター</td><td>ツァイス/ Pecon </td><td> 440760-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td>ステージ加熱インサートP </td><td>ツァイス/ Pecon </td><td> 411861-9901-000 </td><td></td></tr><tr><td>ステージトップインキュベーターS </td><td>ツァイス/ Pecon </td><td> 411860-9902-000 </td><td></td></tr><tr><td>加湿システム</td><td>ツァイス/ Pecon </td><td> 000000-1116-065 </td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

いくつかの天然に存在するプラスミドを、哺乳動物細胞内に保持されます。これらのうち、複数のヒト悪性腫瘍1-3引き起こすエプスタイン-バーウイルス（EBV）およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）を含むガンマヘルペスウイルスのゲノムは、されています。これら二つのゲノムは単一のウイルス蛋白質と細胞複製機構を使用して、それぞれの、ライセンスされた方法で複製され、その欠けている伝統的なセントロメア4月8日にもかかわらず、細胞分裂の際に娘細胞に渡されます。 多くの仕事は、サザンブロッティングやin situハイブリダイゼーション（FISH） 蛍光 inなどのメソッドを使用して、これらのプラスミドゲノムの複製を特徴付けるために行われている。これらの方法は、しかし、制限されています。定量PCRおよびサザンブロットは、細胞集団における細胞あたりのプラスミド数の平均値に関する情報を提供します。 FISHは平均数とプラスミドの分布の両方を明らかに単一セルアッセイである<html>の細胞あたりの細胞集団でなく調べセルの親や子孫の情報を全く許さない、静的なものである。 ここでは、生きた細胞内のプラスミドを可視化するための方法を説明します。このメソッドは、関心9のプラスミド内に複数のサイトへの蛍光標識ラクトースリプレッサータンパク質の結合に基づいています。目的とするDNAをラクトースオペレーター（LACO）配列の約250タンデムリピートを含むように設計されています。 LACOは、具体的に蛍光タンパク質に融合させることができるラクトースリプレッサータンパク質（LACI）によってバインドされています。融合タンパク質は、いずれかの人工プラスミドまたはレトロウイルスベクターにより導入されたから発現させることができる。このように、DNA分子は、蛍光標識、したがって、蛍光顕微鏡を介して、目に見えるようになるされています。プラスミドが閲覧できるようになるまで融合タンパク質は、IPTGの存在下で培養することによりプラスミドDNAを結合からブロックされています。 ontentは &quot;&gt;このシステムは簡単にトランスフェクションし、理想的な細胞が接着されています。それらの合成の特性を明らかにし、娘細胞に分割、プラスミドは数世代を通して生きた細胞で監視することができ、大規模な核を持っているこの技術はあることを決定するために使用されていますEBV由来プラスミドの84％は、HeLa細胞に娘細胞に忠実に、各世代を合成し、新たに合成されたプラスミドパーティションの88％されており、これらのEBVプラスミドのペアがでそれらの合成の後につながまたは姉妹染色分体に関連付けられていることが観察されたS-彼らは後期10で分離された姉妹染色分として分離するのを見たまで。メソッドは現在、HeLa細胞とSLK細胞におけるKSHVゲノムの複製を研究するために使用されています。HeLa細胞は、ヒト上皮細胞を不死化され、SLK細胞が内皮ヒト不死化している段階細胞。SLK細胞はもともとKSHVの病変に由来したものの、ヒーラもSLKのセルライン自然にハーブもORS KSHVゲノム11。ウイルス複製の勉強に加えて、この可視化技術は、合成、ローカリゼーション、および他の組換えプラスミドDNAのパーティション化に様々なDNA配列の要素の追加、削除、または変異の影響を調査するために使用することができます。

<html>代表的な実験で取得したZ-スタックの最大強度の予測を図3に示します。典型的なプラスミド信号は、単一またはプラスミドのクラスタを表しているかどうかに応じてzスタックの3-8スライスに存在しています。細胞が分裂期に達するまでのEBVおよびKSHV由来プラスミドの場合、信号が細胞内でゆっくりと移動します。細胞自体は、実験のコースを上に移行されます。彼らはまた、球状になり、有糸分裂の間に皿から切り離す。健康HeLaおよびSLK細胞の細胞周期は約24時間かかります。細胞周期を完了するには30以上の時間がかかるこれらの種類の細胞が正常でないと判断されるべきである。娘細胞は、通常、互いに近くに添付し、次の細胞周期で同時に分割するために行く。細胞周期を完了することを示すことができる唯一の​​細胞を分析する必要があります。 05/4305fig1.jpgの &quot;alt =&quot;図1 &quot;/&gt; 図1のプラス...

生きた細胞内の個々のDNA分子を観察する方法が記載されている。技術は目的のDNAに組み換え結合部位に蛍光標識lacリプレッサータンパク質の結合に基づいています。この方法は、時間をかけて生きている細胞内の多くの組換えDNAをたどるように適応させることができる。

天然に存在するプラスミドが哺乳類細胞内で維持される例はほとんどありません。その中には、Epstein-Barr virus（EBV）を含むγ-ヘルペスウイルスのゲノムが含まれます。

この手順の全体的な目的は、分裂細胞におけるウイルスゲノムの分配を観察することです。これは、まず蛍光顕微鏡で可視化可能なプラスミドを作製することによって達成されます。ここでは、ラクトースオペレーター配列（LAC O）のタンデムリピートを含むようにプラスミドを設計します。次のステップとして、このプラスミドを分裂細胞に導入し、続いて、蛍光タンパク質と融合したラクトースリプレッサー（lac I）をコードするレトロウイルスを細胞に感染させます。ラクトースリプレッサー融合タンパク質は、プラスミドsub内のラクトースオペレーター配列に特異的に結合します。細胞を蛍光顕微鏡で観察し、複数の細胞周期にわたって個々のプラスミドを追跡します。最終的に、取得した画像を解析し、分裂細胞においてウイルスゲノムがどのように維持されているかを決定します。定量的PCR、サザンブロッティング、または蛍光in situハイブリダイゼーションなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、個々のプラスミドを複数の時点で観察できる点にあります。蛍光顕微鏡でプラスミドを可視化するために、標準的な分子クローニング技術を用いて、ラクトースオペレーター配列（LAC O）を約250コピー含むDNA断片をプラスミドに導入します。本例では、プラスミドは約170 kilobase pairsのBACMIDであり、カポシ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）の全ゲノムを含み、ハイグロマイシン耐性をコードしています。トランスフェクションにより、プラスミドDNAを含むLAC OをHeLa細胞およびSLK哺乳類細胞に導入します。60 mmディッシュを用い、10 µgの精製プラスミドDNA、25 µLのLipofectamine 2000、0.5 mLのOpti-MEM、および3.5 mLのDMEMと共に細胞を4時間インキュベートします。その後、培地を10%胎児牛血清含有DMEMに交換し、48時間かけて細胞を回復させます。続いて、形質転換した細胞を大きなディッシュに低密度で播種し、導入したプラスミドを選別するため、10% 胎児牛血清および 300 µg/mL ハイグロマイシンを含む DMEM 中で3週間培養します。滅菌したチップの破片と浸したフィルターペーパーを用いて、ハイグロマイシン耐性コロニーを新しい培養ディッシュに移します。1〜2週間後、形質転換クローンがディッシュいっぱいに増殖したところでディッシュをインキュベーターに入れ、制限酵素消化およびサザンブロッティングのために DNA を単離し、LAC O プラスミドのポリマーが均一であり、期待されるサイズであることを確認します。この例として示しているブロットでは、クローン1の LAC O ポリマーが均一であり、ポジティブコントロールと同一であることが示されています。レーン7におい

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、リアルタイムで個々のreplisomesによってDNA複製を視覚化するためのシンプルな単一分子蛍光顕微鏡の技法を示しています。...

蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

ここでは、画像への基本的なプロトコルを記述し、siRNAのトランスフェクション後のライブ哺乳類の組織培養細胞の有糸分裂のタイミングを定量化する。...

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

FRETに基づく記者はますます、生細胞におけるキナーゼとホスファターゼの活動を監視するために使用されています。ここでは、ターゲットのリン酸化の細胞周期依存性の変化を評価するためのFRETに基づくレポーターを使用する方法の方法を説明します。...

FRETはレシオメトリックで細胞周期のキナーゼおよびホスファターゼの活動を監視

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

我々は、T細胞活性化プロセスの間にタンパク質のダイナミクスについての洞察を提供して生細胞撮像方法を説明する。私たちは、定量的な結果は、T細胞活性化の全体の複合体形成のシグナルに従う得T細胞拡散アッセイ、共焦点顕微鏡と画像解析を組み合わせた使用法を示す。...

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

この手法は、収穫する方法を提供するものであり、哺乳動物細胞の感染に先立って自然原虫の宿主細胞にあらかじめ栽培されている細菌性病原体の細胞内増殖を正常化し、定量化する。このメソッドは、プライミング段階のための宿主細胞、ならびに標的細胞の種類の多種多様に対応するように変更することができます。...

原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染

クラミジアを含む細胞液胞(封入体)を照らすための生細胞蛍光タンパク質ベースの方法が説明されています。この戦略により、サンプル中のクラミジア感染性を迅速かつ自動的に測定でき、インクルージョン増殖ダイナミクスを定量的に調査するために使用できます。...

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました<em&gt;クラミジア</em生細胞内&gt;液胞の成長ダイナミクス

生体内の生体分子の研究は、生物学的な文脈における分子機能を理解するために非常に重要です。ここでは、DNAやタンパク質などの蛍光生体分子を生きた微生物に取り込むことができる新しい方法について説明します。蛍光顕微鏡で記録されたin...

エレクトロポ生きた微生物で内在化および蛍光生体分子の観測

私たちの実験的アプローチは、細菌集団における時間の経過とともにプラスミドの豊富さと抗生物質耐性に従う戦略を提供します。...

実験的進化論におけるプラスミド媒介抗生物質耐性の定量化

細菌におけるプラスミド保持の並列分析のために、アクセス可能なオープンソースのマイクロ流体ワークフローが紹介されています。蛍光顕微鏡法を用いてゲル微小液滴内の単一細胞微小コロニーにおけるプラスミドの存在を定量することにより、この方法は、従来のプレートカウントに代わる、正確でアクセスしやすく、スケーラブルな方法を提供します。...

オープンソースの液滴マイクロ流体工学によるプラスミド安定性解析

学ぶ、蛍光顕微鏡法を用いてライブ哺乳類細胞内のプラスミド複製を複数世代にわたって追跡する方法。ラクトースオペレーター配列と蛍光標識ラクレプレッサー蛋白質を利用し、細胞分裂時のウイルスゲノム分配を可視化する。

蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

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