蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

この手順の全体的な目的は、分裂細胞におけるウイルスゲノムの分配を観察することです。これは、まず蛍光顕微鏡で可視化可能なプラスミドを作製することによって達成されます。ここでは、ラクトースオペレーター配列（LAC O）のタンデムリピートを含むようにプラスミドを設計します。次のステップとして、このプラスミドを分裂細胞に導入し、続いて、蛍光タンパク質と融合したラクトースリプレッサー（lac I）をコードするレトロウイルスを細胞に感染させます。

ラクトースリプレッサー融合タンパク質は、プラスミドsub内のラクトースオペレーター配列に特異的に結合します。細胞を蛍光顕微鏡で観察し、複数の細胞周期にわたって個々のプラスミドを追跡します。最終的に、取得した画像を解析し、分裂細胞においてウイルスゲノムがどのように維持されているかを決定します。

定量的PCR、サザンブロッティング、または蛍光in situハイブリダイゼーションなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、個々のプラスミドを複数の時点で観察できる点にあります。蛍光顕微鏡でプラスミドを可視化するために、標準的な分子クローニング技術を用いて、ラクトースオペレーター配列（LAC O）を約250コピー含むDNA断片をプラスミドに導入します。本例では、プラスミドは約170 kilobase pairsのBACMIDであり、カポシ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）の全ゲノムを含み、ハイグロマイシン耐性をコードしています。

トランスフェクションにより、プラスミドDNAを含むLAC OをHeLa細胞およびSLK哺乳類細胞に導入します。60 mmディッシュを用い、10 µgの精製プラスミドDNA、25 µLのLipofectamine 2000、0.5 mLのOpti-MEM、および3.5 mLのDMEMと共に細胞を4時間インキュベートします。その後、培地を10%胎児牛血清含有DMEMに交換し、48時間かけて細胞を回復させます。

続いて、形質転換した細胞を大きなディッシュに低密度で播種し、導入したプラスミドを選別するため、10% 胎児牛血清および 300 µg/mL ハイグロマイシンを含む DMEM 中で3週間培養します。滅菌したチップの破片と浸したフィルターペーパーを用いて、ハイグロマイシン耐性コロニーを新しい培養ディッシュに移します。1〜2週間後、形質転換クローンがディッシュいっぱいに増殖したところでディッシュをインキュベーターに入れ、制限酵素消化およびサザンブロッティングのために DNA を単離し、LAC O プラスミドのポリマーが均一であり、期待されるサイズであることを確認します。この例として示しているブロットでは、クローン1の LAC O ポリマーが均一であり、ポジティブコントロールと同一であることが示されています。

レーン7において、プラスミドにラクトースリプレッサーlacIの融合タンパク質を発現するように設計されていない場合は、lacIを赤色蛍光タンパク質（例：tdTomato）と融合させたレトロウイルスを適切なクローンに感染させます。長時間の複数回露光による光毒性を最小限に抑えるため、緑色に近い蛍光を発するタンパク質ではなくtdTomatoが選択されます。lacI融合タンパク質を導入した後、200 µg/mLのIPTG存在下で細胞を培養し、融合タンパク質がDNAに結合するのを阻止します。本手順において最も重要な点の一つは、適切な蛍光強度を持つクローンを得ることです。

最適な蛍光を示すクローンを特定するために、多数のクローンをスクリーニングする必要があります。LAC I TD tomatoタンパク質を発現させるため、細胞を少なくとも3日間培養します。未結合の融合タンパク質によるバックグラウンドレベルが最小限であり、かつ明確なシグナルを示す、最適なレベルのlac eye TD tomatoを発現しているクローンをスクリーニングします。イメージングの24〜48時間前に、LAC I TD tomato発現細胞を35 mmガラスボトムディッシュに、コンフルエンスが10%未満となる密度で播種します。これにより、イメージング開始の1〜3時間前に、細胞のペアが重なり合うことなく8〜16個の細胞からなるコロニーに分裂することができます。

選択薬剤とIPTGの両方を欠いた培地で、プレートを3回洗浄します。これにより、生存不能な細胞が洗い流され、lacアイ融合タンパク質がプラスミド内のLACサイトに結合できるようになります。培地を、10%胎児牛血清および25 mM Hippiesを含むDMEM 2 mLに交換し、1〜3時間インキュベートします。イメージングの直前に、培養皿の蓋を、35 mm用ディッシュのマウンティングリングに張ったカルトフォイルに交換します。

このカバーは培地の蒸発を抑制します。蒸発が起こると、時間の経過とともに塩濃度が上昇し、細胞が死滅してしまいます。本実験で使用したイメージングシステムは、電動ステージと信号の高感度検出用EM CCDカメラを備えたZeiss Axio 200 M倒立顕微鏡で構成されています。蛍光励起光には、CollibraシステムのニュートラルホワイトLEDが使用されています。

イメージングシステムは、複数のZスタックを用いた長時間の間隔での自動画像取得用ソフトウェアによって制御されます。細胞を37 °C、5～10%の二酸化炭素濃度の加湿チャンバー内で維持するために、ステージトップインキュベーターを使用します。対物レンズのサイフォニングを防ぐため、オイル浸漬対物レンズには加熱カラーを使用してください。

サンプルから熱を加え、システムが安定した温度に達するまで十分な時間を置きます。実験中の動きによるアーチファクトを最小限に抑えるため、イメージングシステムは振動から隔離されたエアテーブルの上に設置してください。標識化されたDNAの可視化手順を開始するには、DICイメージングを用いて細胞を観察し、複数の視野において細胞の上面および下面の焦点面を決定します。各視野において、細胞の上端から約3分の1ほど下がった位置の焦点面に移動し、x、y、Z座標を保存済みステージ位置リストに保存します。

保存された各位置は、顕微鏡制御ソフトウェアで細胞をキャプチャするためのZスタック画像の中心となります。保存された各ステージ位置で実行されるZスタック画像を定義し、細胞が存在する平面の上限および下限に余裕を持たせ、細胞全体がキャプチャされる十分な枚数のスライスを定義してください。Z方向で概ねナイキストサンプリングが可能となるよう、Zステップサイズを0.35から0.50 µmに設定してください。これらのスライスにより、細胞周期中の細胞の移動後の検出が可能になり、また、撮像後の画像スタック処理にも使用されます。

これにより、細胞の厚さに応じて40〜60枚の画像スタックが得られます。30分間隔でZ-stackの明視野画像を、10〜60分間隔で蛍光画像を収集するようにタイムシリーズ実験を設定します。実験中にDICイメージングは使用しないでください。DICイメージングは標準的な明視野イメージングよりも多くの光を必要とするため、長時間の実験において細胞が不必要に光毒性にさらされる可能性があります。

ソフトウェア制御による実験を開始します。実験中にシステムに乱れが生じないようにしてください。実験のすべての画像が取得された後、各Zスタックおよびタイムポイントの画像を確認し、コンピュータの処理時間を短縮するため、画像から不要な領域をクロップして除外します。

次のステップでは、各Zスタックにおいて信号強度を元のピクセルに再割り当てします。イメージングシステムの測定済み点広がり関数に基づいたAxio visionソフトウェアのデコンボリューションアルゴリズムを使用してください。デコンボリューションの結果をここに示します。

画像を確認し、細胞周期におけるプラスミドの強度変化と移動、および娘細胞へのプラスミドの分配を追跡します。これらの画像は、異なるシグナルが存在する複数のZ平面を計算によって統合したものであり、LAC eye TD tomatoを発現しているHELOC細胞の核が、融合タンパク質上の核局在化シグナルによって核に局在するため、蛍光を発していることを示しています。I-P-T-Gが存在しない場合、LAC O配列をコードするK-S-H-Vゲノムに多くの蛍光タンパク質が集積し、核の背景強度に対して明るいシグナルとして際立って見えます。

対照的に、IPTGが存在すると、LAC eye 蛍光タンパク質は認識配列である lack O 配列への結合が阻害されます。代表的な実験における、5つの時間ポイントで取得した HeLa 細胞の細胞周期の最大強度投影（maximum intensity projections）を本図に示します。パネル A で可視化されている蛍光タグ付きウイルスゲノムは、パネル B に示すように合成されます。その後、パネル C、D、および E で観察されるように、細胞分裂に伴いウイルスゲノムは娘細胞に分配されます。正常な HeLa 細胞の細胞周期は約 24 時間であり、娘細胞は通常、互いに近接して付着し、次の細胞周期で同時に分裂します。

このプロトコルを用いることで、細胞内のウイルスゲノムを複数世代にわたって追跡することが可能です。本手順を実施する際は、実験期間を通じて細胞が健全な状態にあることを確認するため、世代交代時の細胞形態を観察することが重要です。