の血小板媒介クランピングのためのシンプルなプロトコル熱帯熱マラリア原虫感染した赤血球
May 16th, 2013
この方法は、血小板の媒介凝集表現型を調査熱帯熱マラリア原虫感染赤血球（PRBC）。これは、多血小板血漿とPRBCの懸濁液を分離し、共培養することにより行われる。
この手順は、臨床または実験室のマラリア原虫偽パレム分離株の血小板媒介凝集アッセイを実施するためのいくつかの標準化されたガイドラインを提供します。まず、感染した患者から血液を採取し、寄生した赤血球を遠心分離機で採取し、次に無性成熟期を培養して精製します。次に、健康なドナーから採血し、遠心分離によって多血小板血漿を調製および標準化します。
血小板と寄生赤血球の両方を組み合わせて、凝集アッセイを行います。免疫蛍光顕微鏡の結果は、血小板によって媒介されたP Fal精子塊を示すことができると言います。この技術は、資源の乏しい環境でマラリア原虫sra.Clinical分離株の凝集表現型を測定するために特別に設計されています
。手順のバリエーションが最小限であることは、現場での凝集酸の結果への影響を増大させると報告されています。したがって、クエン酸ナトリウムでは、vacutainerはマラリア未感染の宿主から約5ミリリットルの全血、またはCMまたはSMマラリア患者から2.5ミリリットルの血液を収集します。
全血を250Gで室温で10分間遠心分離します。次に、曇った上清をきれいな15ミリリットルのチューブに慎重に移します。血小板は、温度、変動、および物理的な衝撃によって簡単に活性化されることを忘れないでください。
annoy bower's、ヘモサイトメーターを使用してPRP懸濁液を列挙し、PBSで所望の濃度に調整して、1500GSで10分間遠心分離することにより、PRP画分の一部から血小板の大部分である血小板の貧弱な血漿ペレットを得る。PRPおよびPPPフラクションは、摂氏4度で最大8〜10日間保存します。理想的には、凝集アッセイに新鮮な血小板を使用します。
ペレット状にした末梢赤血球を5〜10ミリリットルのRPMI 1640で3回洗浄し、標準的なマラリア培養物、中程度で新鮮な未感染赤血球を含む培養フラスコサプリメントPRBCで5%ヘマトクリットを達成します。92.5%の窒素、2.5%の酸素、および5%の二酸化炭素の混合物を培養フラスコに浸透させます。次に、患者のPBCから成熟した寄生虫をシールして培養します。
培養フラスコを摂氏37度のインキュベーターで24〜36時間、5%二酸化炭素でインキュベートします。平らな面に置かれたすりガラスのスライドの一方の端に約10〜15マイクロリットルの血液を置きます。2 番目のスライドを 45 度の角度で保持しながら、血液が 2 番目のスライドの端に均等に広がるまで、2 番目のスライドの端で血液の滴に触れます。
最初のスライドに過度の圧力をかけずに、すばやく、しかし穏やかに、最初のスライド全体に血液を均等に広げます。次に、血液の薄膜を風乾し、標本領域をメタノールで10秒間脱水します。次に風乾し、試料を2%キームに浸します。
少なくとも10分間持続します。水が透明になり、風乾するまで、広範囲にすすぎます。100 x オイルエマルジョンレンズの光学顕微鏡でサンプルを観察します。
次に、成熟したPFSパラムであるPRBCを、テキストプロトコルに記載されているように精製し、同期させます。すべてのチューブで培養物を清潔で滅菌済みの15ミリリットルチューブに移します。細胞を室温、370 GSで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット
化します。次に、ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引します。次に、全体積の半分がゼリー融合になるように細胞を再懸濁します。後半の3分の1はプロテインフリー培地で、後半の3分の2はPBCsです。
懸濁液を滅菌済みの15ミリリットルチューブに移し、摂氏37度のインキュベーターで15〜20分間インキュベートし、上部と下部のレベルの間に明確な境界が形成されるまでインキュベートします。上層を新鮮な滅菌15ミリリットルチューブに慎重に移し、370〜430GSで10ミリリットルの新鮮なRPMI遠心分離機を5分間追加します。次に、上清を慎重に捨てます。
次に、薄い血液塗抹標本でパーシットと発達段階を評価し、前述のように光学顕微鏡で調べます。血漿ゲル浮遊選鉱後に得られるP RBC懸濁液を、新鮮な1.5ミリリットルチューブ内のマイクロリットルあたり10倍から8番目のP RBCに調整します。pbcsを5%ヘマトクリットアインオレンジで、または臭化アテリウムを20マイクログラム/ミリリットルで、最終濃度とPRPを総量の10%で懸濁します。
同様に、以下のコントロールを未感染の赤血球とPRPおよびPPPでPRBCを調製し、PBCの凝集における血小板の役割を確認します。次に、懸濁液を2ミリリットルのスクリューキャップバイアルに移します。室温で10〜12RRPで転がし、15〜20分間隔で合計120分間、バイアルを穏やかに攪拌して、凝集の形成を確認します。
サンプルの10マイクロリットルをスライドガラス上にピペットで移動し、ガラススリップで覆って蛍光下で調べると、塊は3つ以上の感染した赤血球の集合体と見なされます。この実験では、血漿ゲル浮選による濃縮後のp FALsのパレムの約70%成熟した段階をアッセイしました。凝集塊は、通常の光下と同様に顕微鏡下でも容易に見つけることができます。それらは細胞凝集体として現れ、蛍光下では緑色または赤色の斑点として現れます。
アクロおよびオレンジまたは臭化アテリウムで染色すると、それぞれ死にます。凝集体サイズは、120分間インキュベートした後、凝集体あたり平均15pbcsを超えるまでに大幅に増加し、一部の凝集体は、目視でカウントできない凝集体あたり多数のpbcsを含んでいます。凝集表現型の頻度は、重複アッセイでカウントされた感染細胞1000個あたりの凝集体に存在する感染細胞の数として計算されます。
このビデオを見た後、熱帯熱マラリア原虫、血小板媒介凝集アッセイの実施方法を明確に理解できるはずです。ぎくしゃくした動きや温度変化で血小板を活性化しないように注意してください。このアッセイは、重症マラリアにおける血小板媒介凝集アッセイの測定にも適用できます。
概要
この方法は、臨床分離株におけるマラリア原虫感染赤血球の血小板を介する凝集表現型を調査します。この手順には、寄生された赤血球の懸濁液と血小板を豊富に含む血漿を分離し、共同培養することが含まれます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 微生物学
- 臨床研究
背景
- 血小板を介する凝集は、マラリアの病理学において重要な現象です。
- この凝集を理解することで、マラリアの重症度を評価するのに役立ちます。
- 研究の再現性を確保するために、標準化された方法が不可欠です。
- この研究は、資源の乏しい環境における臨床分離株に焦点を当てています。
研究の目的
- 血小板を介する凝集アッセイの標準化プロトコルを開発すること。
- マラリア原虫の凝集表現型を測定すること。
- マラリアが蔓延する地域での研究を促進すること。
使用された方法
- 感染患者と健康なドナーからの採血。
- 寄生された赤血球を分離し、血小板を豊富に含む血漿を準備するための遠心分離。
- 血小板と寄生された赤血球の共同培養。
- 免疫蛍光顕微鏡を用いた凝集の評価。
主な結果
- 臨床分離株において凝集表現型を正常に測定しました。
- 変動性を最小限に抑えるための血小板活性化条件を特定しました。
- 結果は、培養後に重要な凝集形成を示しました。
- 凝集塊のサイズは時間とともに著しく増加し、活発な凝集を示しました。
結論
- このアッセイは、マラリアの病理学を研究するための信頼できる方法を提供します。
- 標準化は、異なる環境間で一貫した結果を得るために重要です。
- この方法は、低資源環境での使用に適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes provides a measurable phenotype linked to malaria severity in endemic populations. Standardizing this assay enables consistent evaluation of parasite adhesion mechanisms across resource-limited field sites. This supports target validation and mechanistic de-risking in antimalarial therapeutic development by linking in vitro phenotypes to clinical outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host-parasite adhesion pathways involving CD36 and gC1qR/HABP1/p32 receptors.
- Operational Value: Provides a standardized method to assess clumping phenotype in clinical isolates without cryopreservation.
- Predictive Value: Links in vitro clumping frequency to disease severity in patient populations, supporting biomarker association studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses platelet-rich plasma and purified parasitized erythrocytes to generate quantitative clumping readouts.
- Reproducibility: Defines centrifugation, incubation, and sampling intervals to minimize variability in low-resource settings.
- Scalability: Requires minimal equipment (centrifuge, microscope) enabling deployment across malaria-endemic field sites.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects platelet-mediated clumping to severe malaria phenotypes observed in pediatric cerebral malaria cases.
- Translational Continuity: Allows progression from field isolate testing to mechanistic studies of adhesion receptor inhibition.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables prioritization of compounds or antibodies that disrupt platelet-mediated clumping in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the malaria discovery continuum from early target validation to preclinical evaluation of adhesion-blocking interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of parasite ligand-receptor interactions involved in sequestration and microvascular pathology.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (clump frequency and size) for evaluating compound effects on platelet-mediated aggregation.
- Analytics: Generates measurable endpoints—clump frequency per 1000 infected cells and average clump size—enabling comparison across isolates and conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro phenotyping with ex vivo clinical correlations from severe malaria patient cohorts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing adhesion phenotypes across diverse Plasmodium falciparum strains and geographic isolates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in parasite sequestration by quantifying a receptor-mediated adhesion phenotype.
- Operational Value: Ensures standardization through defined platelet preparation, parasite enrichment, and timed incubation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in antimalarial programs by identifying compounds that inhibit pathogenic adhesion mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by linking in vitro clumping inhibition to potential reduction in severe malaria outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in parasitology, blood handling, and microscopy for accurate isolate preparation and clump detection.
- Dependent on centrifuge access for platelet-rich plasma preparation and parasitized erythrocyte purification.
- Necessitates standardization of agitation speed (10–12 rpm) and sampling intervals (15–20 min) across sites to ensure reproducibility.
- Must account for platelet sensitivity to temperature shifts and mechanical stress during isolation and assay setup.
- Limited to qualitative and semi-quantitative readouts unless paired with automated imaging or flow cytometry for high-throughput adaptation.
