の血小板媒介クランピングのためのシンプルなプロトコル熱帯熱マラリア原虫感染した赤血球

本手順では、臨床または実験室で分離されたPlasmodium falciparum株を用いて、血小板介在性凝集アッセイを行うための標準化されたガイドラインを提示します。まず、感染患者から血液を採取し、遠心分離によって寄生赤血球を回収した後、無性生殖の成熟期を培養し精製します。次に、健康なドナーから血液を採取し、遠心分離によって血小板富化血漿を調製および標準化します。

凝集アッセイのために、血小板と寄生赤血球の両方を混合します。免疫蛍光顕微鏡による結果から、血小板が介在する P Fal sperum の凝集が示されることがあります。この手法は、plasmodium sra の凝集表現型を測定するために特別に設計されたものです。

資源が乏しい環境における臨床分離株について。手順のわずかな変動が、現場での凝集酸（clumping acid）の結果に影響を及ぼすことが報告されています。そのため、マラリア流行地域のフィールドサイト間で標準化を図るために、低資源環境に適応した、明確で簡潔なプロトコルが必要とされていました。クエン酸ナトリウム入りバキュテイナーを用いて、マラリア未感染のホストから約5 mL、または脳性マラリア（CM）または重症マラリア（SM）患者から2.5 mLの全血を採取します。

全血を室温で250 Gsで10分間遠心分離します。次に、白濁した上清をきれいな15 milliliterチューブに注意深く移します。血小板は温度変化や物理的な衝撃によって容易に活性化されることに注意してください。

ヘモサイトメーターを用いてPRP懸濁液を計数し、PBSで目的の濃度に調整します。その後、PRP画分の一部を1500 gで10分間遠心分離し、血小板貧乏血漿（PPP）ペレットとして血小板の大部分を回収します。PRPおよびPPP画分は、4 °Cで最大8〜10日間保存してください。凝集試験には、可能な限り新鮮な血小板を使用することが理想的です。

培養フラスコ内で、ペレット化した末梢赤血球を5〜10 mLのRPMI 1640で3回洗浄します。標準的なマラリア培養培地と新鮮な非感染赤血球をPRBCに添加し、ヘマトクリット値を5%に調整します。培養フラスコ内を92.5%窒素、2.5%酸素、および5%二酸化炭素の混合ガスで置換します。その後、密閉し、患者由来のpbcsから寄生虫を成熟させます。

培養フラスコを37 °C、5% carbon dioxideのインキュベーター内で24～36時間インキュベートします。平らな面に置いたフロステッドガラススライドの一端に、約10～15 µLの血液を滴下します。2枚目のスライドを45度の角度に保持し、血液の滴に2枚目のスライドの端を接触させ、血液が2枚目のスライドの端に均一に広がるまで操作します。

1枚目のスライドに過度な圧力をかけないよう、素早く、かつ丁寧に血液を均一に塗布します。次に、血液の薄膜を風乾させ、検体領域をメタノールで10秒間脱水します。その後、再び風乾させ、検体を2% keemに浸します。

少なくとも10分間保持します。水が透明になるまで十分にすすぎ、風乾させます。光学顕微鏡の100倍油浸レンズでサンプルを観察します。

次に、テキストプロトコルに従って、成熟したPFS parum、PRBCを精製し同期させます。その後、培養液を清潔で滅菌済みの15 milliliterチューブに移します。室温にて370 GSで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。

次に、ペレットを乱さないように注意して上清を吸引します。その後、全容量の半分がjello fusingとなるように細胞を再懸濁します。残りの半分については、3分の1をタンパク質不含培地、3分の2をpbcsとしてください。

懸濁液を滅菌済みの15 mLチューブに移し、上層と下層の間に明確な境界ができるまで、37 °Cのインキュベーターで15～20分間インキュベートします。上層を慎重に新しい滅菌済み15 mLチューブに移し、新鮮なRPMIを10 mL加えて、370～430 ×gで5分間遠心分離します。その後、上清を慎重に除きます。

次に、前述の手順に従い、薄い血液塗抹標本を用いて寄生率と発育段階を評価し、光学顕微鏡で鏡検します。プラズマゲル浮遊法で得られたP RBC懸濁液を、新しい1.5 mLチューブ内で1 × 10⁸ P RBCs/µLに調整します。P RBCsを、最終濃度20 µg/mLのアニリンオレンジまたはエチジウムブロマイド、および全容量の10%のPRPを含む5%ヘマトクリット溶液に懸濁します。

同様に、PBCの凝集における血小板の役割を確認するため、非感染赤血球、PRP、およびPPPを用いたPRBCのコントロールを調製します。次に、懸濁液を2 mLのスクリューキャップバイアルに移します。バイアルを室温で10〜12 RPMで回転させ、緩やかに撹拌しながら、凝集形成を確認するために15〜20分間隔で計120分間サンプリングを行います。

10 µLのサンプルをガラススライド上にピペットで滴下し、カバーガラスで覆って蛍光顕微鏡下で観察します。3個以上の感染赤血球が集まっているものを凝集塊と見なします。この実験では、プラズマゲル浮上法による濃縮後、p FALs原虫の成熟期の約70%を分析しました。凝集塊は、通常の光の下でも顕微鏡で容易に確認できます。それらは細胞の凝集体として現れ、蛍光下では緑色または赤色のスポットとして観察されます。

アクロクローム・オレンジまたはエチジウムブロマイドでそれぞれ染色したところ、120分間のインキュベーション後、クランプサイズは平均1クランプあたり15 pbcs以上に有意に増加し、中には視覚的にカウントできないほど多数のpbcsを含むクランプも見られた。クランプ表現型の頻度は、2回の反復アッセイでカウントした1,000個の感染細胞あたりのクランプ内に存在する感染細胞数として算出した。

このビデオを視聴したことで、*Plasmodium falciparum*を用いた血小板介在性凝集アッセイの実施方法について明確に理解できたはずです。急激な動作や温度変化によって血小板を活性化させないよう注意してください。このアッセイは、重症マラリアにおける血小板介在性凝集の測定にも適用可能です。