における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微​​鏡の使用

この手順の全体的な目的は、高倍率顕微鏡上のガスフロー装置を用いて、無酸素状態に置かれたC. elegans胚における細胞内ダイナミクスをイメージングするin vivo手法について説明することです。まず、イメージングに適した若齢胚の集団を確保するため、若年成体のトランスジェニック動物のサンプルを調製します。次に、マイクロインキュベーションチャンバーで使用するための薄いアガロースパッドスライドを調製します。

次に、ウミエレガンスを適切に麻酔し、ガス流にさらされた際の乾燥を防ぐためにハロカーボンオイルで覆います。最後に、麻酔した個体が載ったラウンドカバーガラスをマイクロインキュベーションチャンバーに入れます。その後、チャンバーを顕微鏡ステージに設置し、窒素ガスで満たして無酸素環境を作り出し、最終的にマイクロインキュベーションチャンバーへのガス流を用いてイメージングを行います。

in vivo 蛍光顕微鏡法を併用することで、無酸素状態に応答した細胞周期停止の高解像度で詳細なビデオおよび画像を得ることが可能になります。間接免疫蛍光法などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、動物を特定の条件下に置いたまま、細胞内小器官レベルの変化を in vivo で記録できる点にあります。この手法により、C. elegans 胚における無酸素誘発性の仮死状態についての知見を得ることができます。

本手法は、酵母や細胞培養、あるいはその他の小型無脊椎動物や脊椎動物の胚などの他のシステムにも適用可能です。また、高酸素状態、温度、ストレス、または低分子化合物による処理などの追加条件を適用することもできます。本手順の実演を行うのは、私の研究室の大学院生であるAnastacia GarciaとMary Lattです。まず、目的の適切なC. elegans導入系統を用意します。本研究では、細胞分裂のマーカーとして染色体と中心体を可視化するために、TH 32導入系統を使用します。

次亜塩素酸溶液で成虫を溶解させて同期集団を作成し、残った胚を利用するか、播種済みプレートに成虫を移して1〜2時間産卵させるか、あるいは混合集団からL4幼虫を新しい播種済みプレートにピックアップします。線虫を20 °Cで若年成虫まで育成させます。これには、孵化から約96時間、L1幼虫から72時間、またはL4脱皮後24時間を要します。この手法により、多数の初期胚を含む若年成虫の集団を作成することができ、これらの胚には細胞内および核内の変化をイメージングするのに最適な大きな細胞質と核が含まれています。

準備したスライドを保管するための加湿チャンバーを設置するには、十分な大きさの蓋付きの大型ペトリ皿または容器の中に、湿らせたペーパータオルを敷きます。脱イオン水で2% arosを調製し、ガラス器具に入れて電子レンジまたはウォーターバスで加熱して溶解させます。次に、清潔なガラス製顕微鏡スライドの上に、温めたarosを1〜3滴滴下し、直ちに2枚目のスライドをそのaros滴の上に垂直に反転させて重ね、 resulting padが薄くなり気泡が入らないように軽く押さえます。

arosがゆっくりと冷却した後、2枚の顕微鏡スライドを離し、一方のスライドにarosパッドをそのまま残します。顕微鏡のピント合わせに影響が出ないよう、arosパッドが十分に薄いことを確認することが重要です。その後、清潔なカミソリを使用して、arosパッドを小さな正方形に整えます。

使用直前まで、スライドを準備した加湿チャンバー内に保管します。同じ清潔なカミソリの刃を用いて、アロスパッドの端を慎重に持ち上げ、スライドから直径25 millimeterの円形マイクロカバーガラス上へ移します。円形カバーガラスの下に気泡が溜まらないように注意し、マイクロインキュベーターに適切に収まるように設置してください。

麻酔薬を1滴、アロスパッドに滴下します。5〜10匹の線虫をピックアップし、麻酔薬の滴の中に置きます。線虫の動きが止まるまで1〜3分間待ちます。

ピペットチップを使用して、ハローカーボンオイルを線虫の上に1滴滴下し、チャンバー内にガスを流す際の線虫の脱水を防ぎます。次に、柔軟なプラスチックチューブの一端をチャンバーに接続します。密閉型灌流マイクロインキュベーターの上下2つのパーツを分離し、カバーガラスを底部のリングの上に慎重に直立させて配置します。

チャンバーの両側をしっかりと閉じます。次に、柔軟なプラスチックチューブを介してチャンバーを窒素ガスボンベに接続し、顕微鏡ステージの上に配置します。胚をイメージングする前に、チューブとチャンバー側面のポートプラグがしっかりと固定されていることを確認し、漏れがないかチェックしてください。

まず、低倍率で個体を探索します。その後、適切な高倍率に切り替えます。成体における胚性blasphemersをイメージングするには、488 nanometerレーザーを使用して、目的の細胞内のGFP融合タンパク質を特定します。

細胞周期停止の特定の段階（例えば、前期の後半）を可視化するには、細胞分裂の前段階（間期の後半や前期の前半など）にある標的細胞を特定します。チャンバーに窒素ガスを灌流させ、窒素がチャンバーを満たす間、必要に応じて焦点面を調整しながら、標的細胞のモニタリングを継続します。タイムラプスイメージングを行い、今回のケースで目的とする現象をキャプチャします。

前期的停止および染色体の核内膜へのドッキング。最大30分間、10秒ごとに画像を撮影する。通常、低酸素誘導性の前期的停止は、窒素ガスの流量開始から20〜30分以内に起こる。

無酸素状態で誘導された停止状態からの回復を記録するために、ガスを停止し、タイムラプス撮影を行いながらチャンバー内を正常酸素状態に戻します。通常、5分から20分以内に細胞周期の再開と染色体の凝縮解除が起こります。画像およびビデオの処理にはImage JまたはPhotoshopを使用し、表示用にQuickTimeにインポートしてください。

アノキシア（無酸素状態）に曝露された胚内において、前期の染色体は凝縮し、核膜の内周に沿って整列します。この現象はクロモソームドッキングと呼ばれ、再酸素化により細胞周期の進行が再開されると、前期の染色体が

Blasphemyは核周辺から赤道板へと移動し、中期への移行を示します。この手法を習得すれば、適切にステージングされた動物を用いて3〜4時間で実施することが可能です。この手順を行う際は、実験を完了させるための十分な時間を確保するために健康な若成体動物のみを使用すること、および適切なステージのblasphemerを選択できるようになるまで根気強く取り組むことが重要です。

このビデオを視聴することで、高倍率顕微鏡とガスフローチャンバーを用いて、GaN胚におけるアノキシア（無酸素状態）誘発性の細胞内イベントをin vivoでキャプチャする方法について深く理解することができます。