Name: における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微鏡の使用 Cエレガンス胚 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学ぶ スピニングディスク共焦点顕微鏡とマイクロインキュベーション室を用いて、C. elegans胚における酸素欠乏誘導の亜細胞動態を可視化する方法。この技術は細胞応答をリアルタイムで観察可能にする。

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我々は、入力とパディーヤラボのメンバーからのコメントに感謝の意を伝えたい。この作品で線虫株は研究資源のためのNIHナショナルセンター（NCRR）によって運営されている線虫の遺伝学センターから提供された。我々は、共焦点顕微鏡について技術的な支援のために博士ロンターンブルを認め、感謝しています。この作品は、PAPに国立科学財団（NSF-IOS、キャリア）からの助成金によって支えられてきた

1。試料調製<ol><li>適切なトランスジェニックCを生成または取得elegansはトランスジェニックの手法を用いて、関心のあるまたは線虫遺伝ストックセンター（CGC）や同僚への負担が少なくなります。細胞分裂のマーカーとして染色体や中心体を視覚化するために5;このケースでは、（PIE-1 :: GFP ::パイH2B-1 :: TBG-1 :: GFP）株TH32を使用しています。 </li><li> 3つの方法のいずれかを使用して同期化された集団を生成する：1）次亜塩素酸溶液中で妊娠成人を崩壊させ、残りの胚6を使用して 、2）播種板上に妊娠成人をピックアップし、それらを1〜2時間のために胚を置く、または3）L4を選ぶことができ混合集団とmoveから新しいシードプレートに幼虫。 </li><li>孵化から約96時間かかります妊娠青年期、〜20℃、L1幼虫または24時間後、L4の脱皮から72時間で線虫を育てています。 子宮内で胚（2-20セル）IMAGに最適な大割球と核を含むるサブ携帯とサブ核の変化であった。この方法論は、初期胚の豊富な数を含む若年成人の集団を生成する手段を提供します。 </li></ol> 2。スライドの調製と酸素欠乏症商工会議所は、設定<ol><li>十分なサイズの蓋で覆われた大きなシャーレまたはビンの内側に湿らせたペーパータオルを配置することによって準備されたスライドを保持するために、湿潤チャンバーを作る。 </li><li>マイクロ波あるいは水浴を介してガラスに混合物を加熱することにより脱イオンH 2 Oで溶融2％アガロースを準備します。 </li><li>きれいなガラス顕微鏡スライド上に暖かいアガロースの1-3滴を置きます。直ちにアガロースドロップ（複数可）の上に垂直に反転した2枚目のスライドを配置し、その結果、パッドが薄いと気泡の自由になるように少し押します。 </li><li>クールゆっくりとスライドの1つ上のアガロースパッドはそのままにして2顕微鏡スライドを分解する時間を確保します。アガロースパッドがinterfeないように十分に薄いようにすることが重要です後で顕微鏡を集中する能力を使用して再。サンプルを視覚化する能力はまた、顕微鏡間で異なることができ、使用中の特定の目的の光学距離に依存する。 </li><li>小さな正方形にアガロースパッドを形成するためにクリーンなかみそりの刃を使用しています。使用する準備ができるまで準備湿潤チャンバーに保管してください。 </li><li>慎重に、同じクリーンなカミソリの刃を用いて、アガロースパッドの端を取るとラウンド25ミリメートルマイクロカバーガラス上にスライドからそれを転送し、パッドの下に気泡の蓄積を回避する。使用するために選択した丸いカバーガラスはmicroincubatorで適切にフィットします。 </li><li>麻酔薬として使用するためのアガロースパッドに麻酔薬（0.5％tricaine、M9のバッファ内の0.05％tetramisole）のドロップを追加します。麻酔薬のドロップに5月10日ワームや場所を選ぶ。動きを止めるためにワームの1から3分を許可します。 </li><li>成人子宮内の胎児を観察するための理論的根拠はなく、解剖した胚は、胚desiccaの可能性を最小限にすることですると胚全体で窒素ガスの流れによる移動。 </li><li>すぐにガスがチャンバを通して流されるように脱水からワームを防ぐために、ワームの上にハロカーボンオイルを一滴を追加します。ハロカーボン油は粘性があるので、一つはワームワームにオイル·アンド·ドロップを収集するために選ぶのピペットチップまたはチップを使用することができます。 </li><li>一度ワームを含む円形カバーガラスの準備が整ったので、ライデン閉鎖灌流microincubatorの二つの部分を分離し、カバーガラスを慎重にボトムリングに直立して配置されます。チャンバーの両側は、その後しっかりと一緒に閉鎖されています。 </li><li>チャンバーはその後、柔軟なプラスチックチューブを介して窒素ガスをタンクに接続されており、顕微鏡ステージ（ 図1C）の適当な位置に配置されます。この時チューブとmicroincubatorは慎重にチューブのチャンバの側面に沿ってポートプラグの確実な取り付けを確実にすることによって、任意の漏れがないかチェックする必要があります。一つは、ALができますとても軽くリークが存在するかどう形成する気泡を探すためにチューブを介してSOAP少量の水を広める。 </li></ol> 3。酸素欠乏症で顕微鏡<ol><li>低倍率で動物を見つけ、その後、そのような大人の胚割球や卵母細胞のような関心の画像組織または細胞に適した高倍率（このアプリケーションの64倍）に移動します。 GFPシグナルを表示し、目的の細胞（s）のGFP融合タンパク質を見つけるために488nmのレーザーをオンにします。 </li><li>細胞周期停止の特定の段階で逮捕を可視化するために（ 例えば、前期の後期）細胞分裂の前段階（ 例えば後期中間期または早期前期）で割球を識別します。このような中心小体の位置、染色体凝縮の開始、染色体の場所と核膜の有無などの細胞マーカーは、細胞周期段階（ 図2A）を識別するのに役立ちます。 </li><li>チャンバーは、窒素ガス（99.999％で灌流さN 2、&lt;2 ppmのO 2）。我々は6 psiの圧力を使用しかし、この場合には圧力が各microincubatorのサイズと、使用中のチューブの直径に応じて調整し、最適化する必要があるかもしれません。窒素は、必要に応じて焦点面を調整し、チャンバーを埋めるように割球（s）を継続的に監視します。 </li><li>この時点で、タイムラプスイメージングが始まりました。イメージングは​​、核の内膜に染色体のこの場合前期の逮捕とドッキングで、興味のある現象を捕捉するために必要な限りのために行われている。画像は30分を超えないために10秒ごとに一度取られます。画像キャプチャとゲインやレーザパワー等の設定の周波数が必要に応じて調整されるべきである。 </li><li>胚は無酸素環境に対応する時間は無酸素暴露時に細胞周期の段階に応じて変えることができる。一般的に酸素欠乏によって誘導された前期の逮捕は、窒素ガス流を開始してから20〜30分以内に起こる。我々は、酸素欠乏によって誘導された細胞周期停止occuを観察している&lt;20分でRRING。画像はこの時間枠の間に取得することができる、または特定の画像は後でタイムラプスシリーズから単離することができる。追加のオプションは、胚で細胞内構造を可視化するビデオ顕微鏡を使用することです。 </li><li>酸素欠乏によって誘導された逮捕された状態からの回復を文書化するために、ガスがオフになっていて、チャンバーをタイムラプスシリーズを記録しながら、拡散によって酸素正常状態に戻ることを許可されています。染色体の細胞周期の進行およびドッキング解除の再開は、典型的には窒素ガスをオフにして5〜20分以内に起こる。 </li><li>別の実験では無酸素インジケーター、レサズリンは、フロースルーマイクロチャンバ内に配置されたことに注意してください、それは窒素ガスフローが開始された後チャンバーは約19分の平均で無酸素になることを決定した。 </li><li>画像と動画は、Imaris、イメージJまたはPhotoshopを使用して処理し、ディスプレイ用のQuickTimeにインポートされます。 </li></ol>

<ol><li>Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+signaling+and+resistance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Hypoxia signaling and resistance in C. elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).</li>
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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

酸素欠乏と仮死状態深刻な酸素欠乏への曝露は、いくつかの生物にとって致命的なことができますが、いくつかの生物が無酸素への暴露を生き抜いてきた。 Cの場合にはelegansは 、無酸素暴露の生存率は、発達段階や酸素欠乏に対する応答に依存するエントリが観察可能な生物学的プロセスの数が逮捕された仮死状態に可逆的である。酸素は環境7,9に再導入されるまで、細胞分裂、開発、運動、食べると生殖過程はやむ。酸素欠乏にさらされた胚の細胞周期の進行、間期、前期の後期または中期で可逆的に逮捕。酸素を奪われた環境で、特定のサブ細胞構造のイメージングを可能にするような固定したサンプルおよび in vivo GFP融合タンパク質アッセイにおける免疫染色などの細胞生物学的手法の使用は、識別および特性に尽力されましたCの酸素欠乏によって誘導された仮死状態の特定の特徴エレガンス 8,10,11。 胚および卵母細胞の両...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/機器 </td><td></td><td></td><td> 構図 </td></tr><tr><td>次亜塩素酸塩溶液</td><td></td><td></td><td> 0.7グラムのKOH、12ミリリットルの5％次亜塩素酸ナトリウムは、蒸留H 2 0で50mlにもたらす</td></tr><tr><td> M9バッファー</td><td></td><td></td><td> 3グラムのKH 2 PO 4、11グラムのNa 2 HPO 4、5gのNaCl、1リットルの蒸留H 2 Oあたり1ミリリットル（1 M）のMgSO 4を </td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-550-343 </td><td> 3 &quot;×1&quot; X1.0さmm </td></tr><tr><td>ラウンドマイクロカバーガラス</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 72223から01 </td><td>直径25mm </td></tr><tr><td>ハロカーボン油700 </td><td>シグマ</td><td> H8898-100ML </td><td></td></tr><tr><td>麻酔薬</td><td></td><td></td><td> TRIC 0.5パーセントアイネ、0.05％tetramisole </td></tr><tr><td>ライデンクローズド灌流Microincubator </td><td>ハーバード装置</td><td> 650041 </td><td></td></tr><tr><td>超高純度窒素</td><td> Calgaz（エア·リキード） </td><td></td><td> &gt; 99.9990パーセントのN 2 &lt;2 ppmのO 2 </td></tr><tr><td>プラスチックチューブ</td><td> VWR </td><td> 89068-468 </td><td> 0.062 &quot;内径x 0.125&quot; OD </td></tr><tr><td>ディスク共焦点顕微鏡をスピニング</td><td>マクベインシステムズ</td><td></td><td>ツァイスは光学顕微鏡、落射照明系、CSU-10横河電機共焦点スキャナ、浜松電子増倍CCDカメラを反転します。 </td></tr></tbody></table>

における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微​​鏡の使用<em&gt; cエレガンス</em&gt;胚

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabditsエレガンスは、成人と胎児の段階の透明度だけでなく、融合タンパク質1-4の無数を表現する遺伝子変異体およびトランスジェニック系統の可用性によって促進されるストレス耐性、の研究に広く用いられている。また、このような細胞分裂のような動的なプロセスは、蛍光標識したレポータータンパク質を使用して表示できます。有糸分裂の研究は、無傷の生物を含む様々なシステムでタイムラプス実験の使用によって容易にすることができ、したがって初期のC.線虫の胚はよくこの研究に適しています。ここで紹介する無酸素に応答して、それによって細胞内構造のin vivoイメージング技術（99.999％N 2、&lt;2 ppmのO 2）があるストレスが高倍率の顕微鏡でのセットアップを使用した単純なガスの流れを使用することで可能です。 microincubation室が通じ窒素ガスの流れと回転するディスク共焦点顕微鏡と組み合わせて使用​​され動物は、in vivoで画像化することができる管理された環境を作成することができます。 GFPタグガンマチューブリンやヒストン用いて、ダイナミクスと細胞分裂の逮捕は、酸素欠乏環境にさらされている間と後に、前に、監視することができます。この手法の結果は、酸素欠乏にさらされた胚の割球内の高解像度、詳細なビデオや細胞構造のイメージです。

深刻な酸素欠乏（無酸素）にさらさC. elegansの胚は、開発や細胞分裂7を含む生物学的プロセスを停止させることで生き残ることができます。細胞分裂の酸素欠乏によって誘導された逮捕は、動物は、in vivoで画像化することができる管理された環境を作成することによる窒素ガスの流れと回転するディスク共焦点顕微鏡と組み合わせてmicroincubation室を使用することによって、サブ細胞レベルで監視することができます（ 図1）。興味のある細胞構造は、様々なガス環境に曝さ胚でモニタすることができ、この場合、我々は酸素欠乏にさらされる胚の染色体構造を監視するためにGFPタグガンマチューブリンやヒストンH2Bを使​​用していました。 酸素欠乏にさらされる胚の中では、前期の割球の染色体が凝縮すると内側核周辺部に合わせ、 &quot;染色体のドッキング&quot;（ 図2、ムービー1）と呼ばれる現象である。再酸素の細胞周期の進行次第再開され、前期の割球の染色体は中期（ <...

ここで説明<em生体内で&gt;</em回転するディスク共焦点顕微鏡と組み合わせてmicroincubation室を介してガス流を用いた無酸素に暴露された動物の画像サブ細胞構造へ&gt;テクニック。この方法は簡単で、実験パラメータとモデルの様々なシステムに適合するように十分な柔軟性を備えています。

における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微​​鏡の使用<em&gt; Cエレガンス</em&gt;胚

Caenorhabditis elegansは、成体および胚段階の透明性により、ストレス耐性の研究に広く利用されてきた。

この手順の全体的な目的は、高倍率顕微鏡上のガスフロー装置を用いて、無酸素状態に置かれたC. elegans胚における細胞内ダイナミクスをイメージングするin vivo手法について説明することです。まず、イメージングに適した若齢胚の集団を確保するため、若年成体のトランスジェニック動物のサンプルを調製します。次に、マイクロインキュベーションチャンバーで使用するための薄いアガロースパッドスライドを調製します。次に、ウミエレガンスを適切に麻酔し、ガス流にさらされた際の乾燥を防ぐためにハロカーボンオイルで覆います。最後に、麻酔した個体が載ったラウンドカバーガラスをマイクロインキュベーションチャンバーに入れます。その後、チャンバーを顕微鏡ステージに設置し、窒素ガスで満たして無酸素環境を作り出し、最終的にマイクロインキュベーションチャンバーへのガス流を用いてイメージングを行います。in vivo 蛍光顕微鏡法を併用することで、無酸素状態に応答した細胞周期停止の高解像度で詳細なビデオおよび画像を得ることが可能になります。間接免疫蛍光法などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、動物を特定の条件下に置いたまま、細胞内小器官レベルの変化を in vivo で記録できる点にあります。この手法により、C. elegans 胚における無酸素誘発性の仮死状態についての知見を得ることができます。本手法は、酵母や細胞培養、あるいはその他の小型無脊椎動物や脊椎動物の胚などの他のシステムにも適用可能です。また、高酸素状態、温度、ストレス、または低分子化合物による処理などの追加条件を適用することもできます。本手順の実演を行うのは、私の研究室の大学院生であるAnastacia GarciaとMary Lattです。まず、目的の適切なC. elegans導入系統を用意します。本研究では、細胞分裂のマーカーとして染色体と中心体を可視化するために、TH 32導入系統を使用します。次亜塩素酸溶液で成虫を溶解させて同期集団を作成し、残った胚を利用するか、播種済みプレートに成虫を移して1〜2時間産卵させるか、あるいは混合集団からL4幼虫を新しい播種済みプレートにピックアップします。線虫を20 °Cで若年成虫まで育成させます。これには、孵化から約96時間、L1幼虫から72時間、またはL4脱皮後24時間を要します。この手法により、多数の初期胚を含む若年成虫の集団を作成することができ、これらの胚には細胞内および核内の変化をイメージングするのに最適な大きな細胞質と核が含まれています。準備したスライドを保管するための加湿チャンバーを設置するには、十分な大きさの蓋付きの大型ペトリ皿または容器の中に、湿らせたペーパータオルを敷きます。脱イオン水で2% arosを調製し、ガラス器具に入れて電子レンジまたはウォーターバスで加

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生物学

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

この記事では、線虫の胚発生の初期のイベントの可視化のための手法について説明...

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

シンプルなマイクロ流体デバイスは、麻酔薬を無料で行うために開発されました...

のためのシンプルなマイクロ流体デバイス<em生体内で&gt;</emの&gt;イメージング<em&gt; Cエレガンス</em&gt;<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;とゼブラフィッシュ

このプロトコルは、画像に線虫（Caenorhabditis elegans）の胚における組織内の細胞を分割する方法について説明します。いくつかのプロトコルは、初期胚の画像細胞分裂に、このプロトコルはどのように中期後期胚形成の間に開発し、組織内の細胞分裂像に説明して方法について説明している。...

中に神経芽細胞細胞質分裂を可視化する<em&gt; C.虫</em&gt;胚

プロトコルは、Cで酸素欠乏症/飢餓を使用していますことが記載されている虚血/再灌流をモデル化するエレガンス 。機能的転帰は、死亡率の増加、GFP標識神経突起で見える異常、および神経機能を必要とする障害のある行動反応が含まれています。...

における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル<em&gt; C.虫</em

ここでは、C.エレガンスの発生過程を追跡し定量化する方法を示しています。提示されている方法は、簡単に実装できるオープンソースのツールに基づいています。3D細胞形状モデルの再構築方法、細胞内構造の手動追跡方法、皮質収縮流の解析方法などを実演します。...

の発達過程を追跡し、定量化<em&gt; C。エレガンス</em&gt;オープンソースのツールを使用しました

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

ここでは、 elegans胚における高分解能顕微鏡、計算ツール、および単一細胞標識法を用いて、neurodevelopment...

等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を Caenorhabditis elegans 胚発生

C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

ここでは、 Caenorhabditis elegans胚を...

4D顕微鏡:ノマルスキ顕微鏡を用いた カエノラブディティス・エレガンス 胚発生の解明

このプロトコルは、最大36時間の連続的な食物供給の存在下で C.エレガンス を成長させるために使用される単純なマイクロ流体チップ設計および微細加工方法論を説明しています。成長およびイメージングデバイスは、数日間の開発中の細胞および細胞内プロセスの断続的な長期高解像度イメージングも可能にします。...

カエノラブディティス・エレガンスの長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ

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