2012年12月3日
ここで説明テクニック。この方法は簡単で、実験パラメータとモデルの様々なシステムに適合するように十分な柔軟性を備えています。
この手順の全体的な目標は、高倍率顕微鏡のガスフロースルーセットアップを使用して、無酸素症に曝露された海のエレガンス胚の細胞内ダイナミクスを画像化するin vivo技術を説明することです。これは、まず、イメージングに適した若年胚の集団を生成するために、若年成体トランスジェニック動物のサンプルを調製することによって達成されます。次に、マイクロインキュベーションチャンバーで使用するための薄いアグロスパッドスライドを調製します。
その後、シーエレガンスは適切に麻酔され、ガス流にさらされたときの乾燥を避けるためにハロカーボンオイルで覆われます。最後に、麻酔をかけた動物が入った丸いカバーガラスをマイクロインキュベーションチャンバーに入れます。次に、チャンバーを顕微鏡ステージ上に配置し、窒素ガスで満たして無酸素環境を作り出し、最終的にはマイクロインキュベーションチャンバーを通るガス流の使用をイメージングします。
in vivo蛍光顕微鏡法と組み合わせることで、無酸素症に対する細胞周期停止の高解像度、詳細なビデオ、画像が可能になります。間接免疫蛍光法のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、動物が特定の条件にさらされている間に細胞内変化をin vivoで記録できることです。この方法は、エレガンスの胚における無酸素症誘発性の中断アニメーションについての洞察を提供することができます。
また、酵母、細胞培養、その他の小さな無脊椎動物や脊椎動物の胚など、他のシステムにも適用できます。また、高酸素、温度、ストレス、低分子による治療などの条件も適用できます。この手順を実証するのは、私の研究室の2人の大学院生であるアナスタシア・ガルシアとメアリー・ラットです この研究で関心のある適切なトランスジェニックCエルガン株から始めて、TH 32トランスジェニック株を使用して、細胞分裂のマーカーとして染色体と中心体を視覚化します。
重力の成虫を次亜塩素酸塩溶液で分解し、残りの胚を使用して重力の成虫を播種プレートと卵に摘み取り、1〜2時間産むか、混合個体群からL個の幼虫を新しい播種プレートに摘み取ります。摂氏20度で線虫を成長させます GR若年期、孵化から約96時間、L 1の幼虫から約72時間、またはL 4の脱皮後24時間かかります。この方法論は、細胞内および細胞内核の変化をイメージングするのに最適な大きな冒涜物質と核を含む多数の若い胚を含む若年成人の集団を生成する手段を提供します。
準備したスライドを保持するための湿ったチャンバーを設定するには、広告を置きますamp 十分なサイズの蓋で覆われた大きなペトリ皿またはビンの内側にペーパータオル。脱イオン水で溶融した2%arosを調製するには、ガラス器具で混合物を電子レンジまたは水浴で加熱します。次に、きれいなガラス顕微鏡に温かいアロを1〜3滴垂らします スライドは、すぐにアロスドロップの上に垂直に反転した2番目のスライドを置き、わずかに押して、結果として得られるパッドが薄くなり、気泡がなくなります。
アロスが冷えたら、2つの顕微鏡スライドをゆっくりと分解し、アロスパッドをスライドの1つにそのまま残します。アロスパッドは、顕微鏡の焦点を合わせる能力を妨げないように十分に薄くすることが重要です。あとで。清潔なカミソリの刃を使用して、アロスパッドを小さな正方形の店に形作ります。
準備した湿ったチャンバー内で、使用する準備ができるまでスライドさせます。同じ清潔なカミソリの刃を使用して、arosパッドの端を慎重に取り、スライドから丸い25ミリメートルのマイクロカバーガラスに移します。丸いカバーの下に気泡が溜まるのを避けるために、ガラスはマイクロインキュベーターに適切に収まる必要があります。
アロスパッドに麻酔薬を一滴加えます。5〜10匹のワームを選び、麻酔薬の滴に入れます。ワームが動きを止めるまで1〜3分待ちます。
ピペットチップを使用して、ガスがチャンバーを流れるときにワームが脱水するのを防ぐために、ワームの上にハローカーボンオイルを一滴加えます。次に、柔軟なプラスチックチューブの一端をチャンバーに接続します。閉じた灌流マイクロインキュベーターの2つの半分を分離し、カバーガラスを下部リングに慎重に直立させます。
チャンバーの両側をしっかりと閉じます。次に、チャンバーを柔軟なプラスチックチューブを介して窒素ガスタンクに接続し、顕微鏡ステージに置きます。チャンバーの側面に沿ってチューブとポートプラグを画像胚にしっかりと取り付けて、漏れがないか確認します。
まず、動物を低い倍率で見つけます。次に、適切な高倍率に移動します。成人の胚性冒涜者を画像化するには、488ナノメートルレーザーを使用して、目的の細胞内のGFP融合タンパク質を特定します。
細胞周期停止の特定の段階、例えば後期前期を可視化するには、細胞分裂の前の段階(後期間期や前期初期など)における冒涜者を特定します。チャンバーに窒素ガスを注入し、窒素がチャンバーに充填される間、必要に応じて焦点面を調整しながら、冒涜者を監視し続けます。タイムラプスイメージングを実施して、この場合に関心のある目的の現象を捉えます。
前期の停止と染色体の内核膜へのドッキング。10秒ごとに1回、最大30分間画像を撮影します。通常、無酸素症による前期停止は、窒素ガスの流れが始まってから20〜30分以内に発生します。
無酸素症による停止状態からの回復を記録するには、ガスをオフにして、タイムラプスシリーズを記録しながらチャンバーを正常酸素に戻すようにします。細胞周期の再開と染色体の取り消しは、通常5〜20分以内に行われます。erris image JまたはPhotoshopを使用して、画像やビデオを処理し、QuickTimeにインポートして表示します。
無酸素症にさらされた胚内では、前期の染色体。冒涜者は凝縮し、核の内側の周辺に整列します。再酸素化細胞周期の進行時に染色体ドッキングと呼ばれる現象が再開し、前期の染色体が再開されます。
冒涜は核末梢から赤道プレートに移動し、中期への進行を示します。一度習得すると、このテクニックは適切にステージングされた動物を使用して3〜4時間で実行できます。この手順を試行する際には、健康な若い成体動物のみを使用して実験を完了するのに十分な時間を確保し、適切にステージングされた冒涜者を選択する方法を学ぶときは辛抱強く待つことを覚えておくことが重要です。
このビデオを見た後、GaN胚と高倍率顕微鏡のチャンバーを通るガスフローを使用して、in vivoで無酸素症誘発性細胞内イベントをキャプチャする方法を十分に理解できるはずです。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
この記事では、無酸素状態にさらされたウミウシの胚における細胞小器官のダイナミクスをイメージするin vivo技術について説明します。この方法は、マイクロインキュベーションチャンバーを通過するガスフローと高出力のスピニングディスク共焦点顕微鏡を組み合わせて使用します。
This technique enables real-time visualization of subcellular dynamics in live embryos under controlled anoxic conditions, providing mechanistic insights into stress-induced cell cycle arrest. By capturing reversible prophase arrest and chromosome docking in C. elegans, it supports target validation in pathways governing suspended animation and metabolic dormancy. The approach offers a disease-relevant system for probing oxygen-sensing mechanisms with predictive confidence in preclinical de-risking.
The method integrates into early discovery workflows by providing live-cell imaging data that informs target engagement and pathway modulation studies prior to lead identification.