Name: アン in vitroで準備アメフラシカリフォルニ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 学ぶ、アメフラシカリフォルニの口腔質量を用いたin vitro電気生理学的記録法。神経・筋・個別ニューロンの活動と摂食運動を同時に観測し、噛み・嚥下・拒否行動の神経機構を解析する。

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この研究は、NIHの助成金NS047073とNSFの助成DMS1010434によってサポートされていました。

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

前の仕事は無傷動物で、そのような隔離された神経節などの還元剤、でアメフラシモータープログラムを特徴付けている。個々のニューロンのレコーディングは5を取得してきたが無傷の動物では、このような実験は非常に困難であり、電極が授乳中のニューロンへのニューロンから移動することはできません。隔離された神経は、神経活動によって誘発される摂食の動きを観察することができません。中断頬マスの準備は、この両極端の間のギャップを埋めます。 他の半無傷製剤は以前の研究で使用されますが、一時停止頬マスの準備は重要な利点がありますされています。 1半無傷準備では、唇や頬の質量がまだ取り付けられていたが、準備があまりに14を観察する飽食の動きのために減少した。 試験管内での動きを供給する供給ヘッドの準備15,16許さ観察。しかし、目頭の準備を給電していると、一時停止頬質量はここで説明するよりも設定が複雑だった、とだけ頬神経節では、脳神経節内の個々のニューロンへのアクセスを提供しない。供給ヘッ...

<table><tbody><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671</td><td>Biological, Certified</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td>Certified ACS</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Acros Organics</td><td>19753</td><td>99% </td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td>Certified ACS </td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Fisher Scientifc</td><td>C79</td><td>Certified ACS </td></tr><tr><td>グルコース (デキストロース)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>MOPS緩衝液</td><td>Acros Organics</td><td>17263</td><td>99%</td></tr><tr><td>カルバコール</td><td>Acros Organics</td><td>10824</td><td>99%</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255</td><td>Certified</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>Certified</td></tr><tr><td>単管キャピラリーガラス</td><td>A-M Systems</td><td>6150</td><td></td></tr><tr><td>Flaming-Brown マイクロピペットプラー モデル P-80/PC</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>使用フィラメント: FT345B</td></tr><tr><td>エナメル被覆ステンレス鋼線</td><td>California Fine Wire</td><td></td><td>0.001D, coating h </td></tr><tr><td>家庭用シリコンII接着剤</td><td>GE</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Duro Quick-Gel 瞬間接着剤</td><td>Henkel corp.</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>A-M Systems モデル 1700 アンプリファイア</td><td>A-M Systems</td><td></td><td>フィルタ設定: 神経 300-500 Hz, I2 筋肉 10-500 Hz</td></tr><tr><td>Pulsemaster マルチチャンネルスティミュレーター</td><td>World Precision Instruments</td><td>A300</td><td></td></tr><tr><td>スティミュラス・アイソレーター</td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>AxoGraph X</td><td>AxoGraph Scientific</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Veeder-Root 合計カウンタ</td><td>Danaher</td><td>C342-0562</td><td></td></tr><tr><td>金メッキコネクタピン</td><td>Bulgin</td><td>SA3148/1</td><td></td></tr><tr><td>金メッキコネクタソケット</td><td>Bulgin</td><td>SA3149/1</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 シリコンエラストマー</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 x 50 mm 結晶化皿</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高真空グリース</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375D</td><td></td></tr><tr><td>微細ピン</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>モデリングクレイ</td><td>Sargent Art</td><td>22-4400</td><td></td></tr><tr><td>絹縫合糸</td><td>Ethicon</td><td>K89OH</td><td></td></tr><tr><td>Whisper エアーポンプ</td><td>Tetra</td><td>77849</td><td></td></tr><tr><td>アクアリウム用チューブ</td><td>Eheim</td><td>7783</td><td>12/16 mm</td></tr><tr><td>Elite エアーストーン</td><td>Hagen</td><td>A962</td><td></td></tr><tr><td>Vannas スプリング鋏</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 精密ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>焼き海苔</td><td>Rhee Bros</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キムワイプス</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr></tbody></table>

アン<em&gt; in vitroで</em生理的動きと送りモータプログラムを引き出すと録音用&gt;準備<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

多機能、複数の、そして、異なった行動を生成するには1つの周辺構造の能力は、動物が急速に変化する環境に自分の行動を適応することができます。海洋軟体動物アメフラシカリフォルニは多面的機能の研究のための扱いやすいシステムを提供します。授乳中は、 アメフラシは同じ送り装置、頬質量を用いて行動のいくつかの異なったタイプを生成します。これらの行動を制御する神経節の電気生理学的研究からアクセス可能な、大規模で識別されたニューロンの数を含んでいます。これらのニューロンの活性がprotracts縮みグラスパー2その神経活動に対する相対食品グラスパーを閉じ神経活動のタイミングに基づいて2種類、ingestiveとegestiveプログラム、に分けることができ、モータのプログラムに記載されている。しかし、単離された神経節で、これらの行動を生み出すであろう筋肉の動きは、それを作って、欠席している観測されたモータのプログラムは、実際の行動の相関があるかどうか。 生体 、神経と筋肉のレコーディングでは、特定することが難しいが2,3,4給餌プログラムに対応して得られますが、それは直接個々のニューロン5から録音することは非常に困難であるされています。さらに、in vivoで 、ingestiveプログラムは、さらに刺され、ツバメの1,2、最も以前にin vitro標本で説明で行うことが困難である区別に分けることができます。 中断頬大量調製（ 図1）は、孤立した核と無傷の動物の間のギャップを埋めます。この準備として、ingestive行動-かむと嚥下の両方を含む-とegestive行動（拒否）は、個々の神経細胞は、細胞外から記録電極6を使用して刺激することができると同時に、誘発することができます。これらの異なる動作に関連付けられている餌の動きがrecorすることができますDEDに、定量化、およびモータのプログラムに直接関係する。中断頬大量調製におけるモータープログラムは孤立核において誘発運動プログラムよりもin vivoで観察されたものにもっと似ているように見える。したがって、この準備のモータのプログラムは、より直接的に生体内挙動にに関連することができます。同時に、個々の神経細胞は無傷の動物よりも記録と刺激によりアクセス可能です。また、孤立した核と無傷の動物との間に中間のステップとして、中断頬塊から得られた知見は、より減少し、より完全な両方の設定で得られたデータの解釈を助けることができます。中断頬マスの準備はアメフラシにおける多面的機能の神経制御を特徴づけるための便利なツールです。

細胞外電極をニューロンの細胞体に配置して刺激を行うと、細胞体チャネルにおけるスパイクと、そのニューロンが投射する神経におけるスパイクとの間に一対一の対応が観察されます（図 6 左パネル、同定済みニューロン B9 の刺激）。細胞体チャネル（上部チャネル）は、電流を印加した際に刺激モードに設定され（図中の時間 1）、その後速やかに記録モードに切り替えられます（時間 2）。電極の位置を維持することで、I2 筋肉、歯舌神経、および左右の口神経 2 および 3 の活動とともに、運動プログラム実行中のニューロンの活動を記録することが可能です（図 6 右パネル）。
図 7 は、脳神経節へのカルバコール投与によって誘発された一連の嚥下パターン、およびカルバコール誘発性の咬合中に海藻の帯を把持器に配置した際のビデオ画像を示しています。7Aでは、海藻を掴むために歯舌が前伸しており、7Bでは、歯舌が後退して海藻を口の中に引き込んでいます...

我々は細胞外記録し、神経、筋肉、および個々の識別されたニューロンから刺激するテクニックを説明<em&gt; in vitroで</em&gt;の送り装置では摂食行動の異なったタイプを引き出すと観察しながら、<em&gt;アメフラシ</em&gt;。

多機能性、すなわち1つの末梢構造が複数の異なる行動を生成できる能力1により、動物は自身の行動を迅速に適応させることが可能になります...

この手順の全体的な目的は、摂食運動プログラム中の神経、筋肉、ニューロンからの電気活動と、それに伴う摂食装置の動きを記録することです。まず、麻酔をかけた個体から口咽頭塊（buccal mass）を取り出し、主要な神経と筋肉にフック電極を取り付けます。次に、口咽頭塊を記録用ディッシュに配置し、細胞外記録のために神経節を準備します。次に、細胞外電極を用いて標的ニューロンを特定します。最終ステップでは、噛む、飲み込む、拒絶するといった摂食運動プログラムを誘発し、記録します。最終的に、この懸垂した口球塊標本を用いて、口球塊のさまざまな摂食様運動における神経、筋肉、および個々のニューロンの活動を示します。孤立神経節研究のような既存の手法に対する本手法の主な利点は、神経、筋肉、および個々のニューロンからの記録を、摂食器官の動きに直接的に関連付けられる点にあります。手順のデモンストレーションを補助するのは、当研究室の大学院生のhuuです。まず、解剖トレイに入れた200〜300 gの健康なplegiaに、体重の約50%相当の等張塩化マグネシウムを注入して麻酔をかけます。動物の尾付近に最初の注入を行った後、動物の体表を軽くマッサージして、塩化マグネシウムを広げます。必要に応じて、動物の頭部付近に追加注入を行ってください。動物が緩やかな触覚刺激に反応しなくなった後、背面を上にしてトレイにピンで固定します。尾に1本、各前触手に1本のピンを刺してください。次に、ピンセットを用いて動物の頭部中央の皮膚をつまみ、持ち上げます。ライノフォー（rhino fours）の後方で、保持している箇所のすぐ後ろから頭部を横切るように冠状切開を行います。その後、口側に向かってライノフォーの間に正中矢状切開を加え、頬塊（buccal mass）を露出させます。次に、皮膚のフラップを口腔塊から引き離し、体壁に付着している神経と結合組織を切断します。この皮膚フラップを口腔塊から完全に分離させるため、口腔塊固有の神経や組織を切断しないように注意してください。その後、食道を掴んで保持します。保持している箇所の後方で食道を切断します。食道を上に引き上げ、口腔塊の後ろにある口腔塊を持ち上げます。脳神経節、胸神経節、および足神経節は環状に配置されており、脳神経節は脳口コネクティブによって口腔神経節に接続されています。これらの環状神経節を口球に付着させたままにし、これらの神経節から体の他の部位に伸びるすべての神経を切断します。次に、口球周囲の結合組織を切断し、体との接続が少なくなった口球を引き上げ続けます。口球が口にのみ付着した状態になったら、食道と口球を保持します。真っ直ぐに切断します。顎の直前を最後に切断し、口腔塊を体から切り離します。電極を装着する間、部分麻酔状態を維持するため、口腔塊を50%等張塩化マグネシウム溶液と50%SIA生理食塩水の混合溶液に入れます。続いて、溶液とともに口塊をシガーボトムシャーレに入れ、口塊の腹側にある口動脈を切断します。次に、胸膜神経節および足神経節と脳神経節との接続を切断し、これらを除去します。脳神経節はCBCを介して口神経節および口塊に接続したままにし、脳神経節と口塊との間のその他の接続を切断します。食道と唾液腺を短く切り詰めます。このステップでは、鉤状電極を ular nerve eye、2つの muscle buccal nerves two および three、および buccal nerve two の分枝Aに取り付けます。Collins および Shield による JoVE の出版物で実演され、ここで簡潔に要約されている手順と同様の手法を用いて行います。電極を剥離させるたびに、電極を神経または筋肉の近くに配置し、標的となる神経をフックにかけ、マニピュレーターを用いてゆっくりと持ち上げます。次に、キムワイプを使用して神経の切断面を拭き取ります。フックにかけた神経に速乾性の瞬間接着剤を少量塗布し、フックが完全に接着剤で覆われていること、および参照電極の先端に接着剤が付着していないことを確認してください。次に、ポリエチレンチューブを装着したシリンジを使用して、ディッシュ内の溶液を接着剤に塗布し、接着剤の表面を硬化させます。次のステップでは、記録チャンバーとして使用する直径100mm、深さ50mmのPyrex製記録ディッシュを準備します。漏れを最小限に抑えるため、ピペットチップを用いて、大脳チャンバーとバックルチャンバーの間の切り込み部分に真空グリースを薄く塗布します。その後、フロントチャンバーにプレシア生理食塩水を満たします。頬部組織をシャーレから丸型のPyrex製ディッシュの前方チャンバーへ慎重に移動させ、電極が強く引っ張られて神経が断裂しないように注意してください。ディッシュを別の実体顕微鏡へ移動させる必要がある場合は、フック電極の取り扱いに十分注意してください。これは鞘を薄くするためです。頬部塊の各側にある電極をまとめてグループ化します。コネクタピンを覆っているラボテープを掴んで電極を慎重に保持し、電極が強く引っ張られていないことを再度確認してください。ディッシュを顕微鏡の下に配置した際、休憩時や実験のステージ間では、電極がディッシュの側面に緩やかに掛けられ、プラットフォーム上に置かれている状態にします。アクアリウム用エアストーンを用いて、頬部塊チャンバー内の生理食塩水をエアレーションしてください。次に、CBCをノッチに通した状態で、後方のチャンバーにある脳神経節をピンで固定します。CBCの上に真空グリスをさらに塗布してください。その後、神経節が完全に浸るように、ディッシュの両方にSIA生理食塩水をさらに加えます。生理食塩水の水位が、大脳室と口室の間の真空グリスの高さよりも低く、室間で漏れが発生しないことを確認してください。この段階で、口塊は前方室の底に静止しているはずです。次に、口塊にまだ付着している神経への損傷を避けるため、中間プラットフォーム上の口神経節をピンで固定します。2本の神経の間の鞘にのみピンを刺します。次に、CBCを伸展させ固定するために、CBCの側面にさらに2本のピンを追加します。目的のニューロンの位置に合わせて、口神経節を平らに保つか、または回転させてください。頬神経節を回転させるには、微細ピンセットを用いてCBCの余分な鞘を掴み、頬神経2と頬神経3の間にピンで固定します。これにより、後方に位置し、頬神経節の上方からでは容易にアクセスできなかった細胞体の大部分を確認できるようになります。最後に、頬神経節の鞘の、頬塊側に近い位置に2本のピンを刺します。口神経節の動きを最小限に抑えるため、後室に近い口神経節の鞘をつかみ、細胞体を露出させないように細いハサミで余分な鞘を切り取ります。損傷を最小限にするため、鞘の薄層化が完了した後、細胞体が見えるのに必要な分だけの鞘を取り除いてください。すべての電極ピンを、アンプに接続されるケーブルのソケットに取り付けます。電極が強く引っ張られていないこと、適切なケーブルに正しく接続されていること、および極性が正しいことを確認し、残留している塩化マグネシウムを洗い流します。頬塊チャンバー内のSIA生理食塩水を新しいSIA生理食塩水に交換します。次に、頬塊の前方、顎軟骨の背側の軟組織に絹縫合糸を通します。2つの粘土を用いて縫合糸をディッシュの縁に固定し、口蓋塊を前方端の位置で吊り下げます。ガラス製細胞外電極をマニピュレーターで保持し、電極先端を口蓋神経節の近くに配置します。ニューロンを探索して特定するには、細胞外電極の先端を鞘の上にゆっくりと降ろします。ニューロンの細胞体に合わせます。刺激電流を印加した後、細胞体の興奮に使用していたチャネルを記録モードに切り替え、細胞外電極での活動および拒絶を誘導する神経上の対応する活動を記録します。モータープログラムと同様に、2 Hz、1 msのパルスを長時間連続して口腔神経2Aに刺激し、eesパターンを生成させます。これらのパターンは刺激の間持続し、刺激終了後しばらくまで続くことがあります。噛みつきのような運動プログラムを誘発するには、少量の固形カラコール結晶を脳神経節の上に直接置いてください。反復パターンは通常5分以内に始まり、嚥下を誘導して減衰し始めるまで、およそ10〜15分間持続します。運動プログラムと同様に、caracolを適用し、口腔塊が強力な咬合を生成するまで待ちます。その後、咬合中に海藻の破片を動物の口に配置し、海藻を掴ませます。ここでは、特定された運動ニューロンB9の刺激および記録と、摂食運動プログラム中の同ニューロン、I2筋肉、および数本の神経からの記録を示します。また、同一の一連の運動プログラムから撮影されたビデオ画像を示します。飲み込みパターンは、脳神経節へのカルバコール投与と、それに続くカルバコール誘発性の咬合中の把持器への海藻片の挿入によって誘導されました。この画像では、海藻を掴むために歯舌が伸展しており、もう一方の画像では、歯舌が後退して海藻を口の中へと引き込んでいます。このビデオを視聴することで、懸垂式口塊標本の作製方法と、in vitroでの摂食運動プログラムの記録取得方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

ここでは、海洋軟体動物アプリシアカリフォルニカの摂食装置に固有の筋肉の最小限に侵襲的な外科的病変のためのプロトコルを提示し、摂食行動中にこれらの筋肉の役割を理解する。...

アプリシア・カリフォルニカのオドントフォアに固有の筋肉のための最小限に侵襲的な病変技術

このプロトコルは、吸光度の電圧依存性色素とフォトダイオードアレイを用いた非トランスジェニック無脊椎動物種における単細胞分解能を用いたニューロン集団活性をイメージングする方法を提示する。このアプローチにより、迅速なワークフローが可能になり、イメージングと解析を1日にわたって追求できます。...

非トランスジェニック無脊椎動物における単一ニューロン分解能を用いたネットワークダイナミクスを記録するためのフォトダイオードベースの光学イメージング

本プロトコルは、若年RAC1/CED-10変異型...

初期パーキンソン病研究のためのツールとしての Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10変異体の消化管運動評価

学ぶ、アメフラシカリフォルニの口腔質量を用いたin vitro電気生理学的記録法。神経・筋・個別ニューロンの活動と摂食運動を同時に観測し、噛み・嚥下・拒否行動の神経機構を解析する。

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