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この手順の全体的な目的は、摂食運動プログラム中の神経、筋肉、ニューロンからの電気活動と、それに伴う摂食装置の動きを記録することです。まず、麻酔をかけた個体から口咽頭塊（buccal mass）を取り出し、主要な神経と筋肉にフック電極を取り付けます。次に、口咽頭塊を記録用ディッシュに配置し、細胞外記録のために神経節を準備します。

次に、細胞外電極を用いて標的ニューロンを特定します。最終ステップでは、噛む、飲み込む、拒絶するといった摂食運動プログラムを誘発し、記録します。最終的に、この懸垂した口球塊標本を用いて、口球塊のさまざまな摂食様運動における神経、筋肉、および個々のニューロンの活動を示します。

孤立神経節研究のような既存の手法に対する本手法の主な利点は、神経、筋肉、および個々のニューロンからの記録を、摂食器官の動きに直接的に関連付けられる点にあります。手順のデモンストレーションを補助するのは、当研究室の大学院生のhuuです。まず、解剖トレイに入れた200〜300 gの健康なplegiaに、体重の約50%相当の等張塩化マグネシウムを注入して麻酔をかけます。動物の尾付近に最初の注入を行った後、動物の体表を軽くマッサージして、塩化マグネシウムを広げます。

必要に応じて、動物の頭部付近に追加注入を行ってください。動物が緩やかな触覚刺激に反応しなくなった後、背面を上にしてトレイにピンで固定します。尾に1本、各前触手に1本のピンを刺してください。

次に、ピンセットを用いて動物の頭部中央の皮膚をつまみ、持ち上げます。ライノフォー（rhino fours）の後方で、保持している箇所のすぐ後ろから頭部を横切るように冠状切開を行います。その後、口側に向かってライノフォーの間に正中矢状切開を加え、頬塊（buccal mass）を露出させます。

次に、皮膚のフラップを口腔塊から引き離し、体壁に付着している神経と結合組織を切断します。この皮膚フラップを口腔塊から完全に分離させるため、口腔塊固有の神経や組織を切断しないように注意してください。その後、食道を掴んで保持します。

保持している箇所の後方で食道を切断します。食道を上に引き上げ、口腔塊の後ろにある口腔塊を持ち上げます。脳神経節、胸神経節、および足神経節は環状に配置されており、脳神経節は脳口コネクティブによって口腔神経節に接続されています。

これらの環状神経節を口球に付着させたままにし、これらの神経節から体の他の部位に伸びるすべての神経を切断します。次に、口球周囲の結合組織を切断し、体との接続が少なくなった口球を引き上げ続けます。口球が口にのみ付着した状態になったら、食道と口球を保持します。

真っ直ぐに切断します。顎の直前を最後に切断し、口腔塊を体から切り離します。電極を装着する間、部分麻酔状態を維持するため、口腔塊を50%等張塩化マグネシウム溶液と50%SIA生理食塩水の混合溶液に入れます。

続いて、溶液とともに口塊をシガーボトムシャーレに入れ、口塊の腹側にある口動脈を切断します。次に、胸膜神経節および足神経節と脳神経節との接続を切断し、これらを除去します。脳神経節はCBCを介して口神経節および口塊に接続したままにし、脳神経節と口塊との間のその他の接続を切断します。

食道と唾液腺を短く切り詰めます。このステップでは、鉤状電極を ular nerve eye、2つの muscle buccal nerves two および three、および buccal nerve two の分枝Aに取り付けます。Collins および Shield による JoVE の出版物で実演され、ここで簡潔に要約されている手順と同様の手法を用いて行います。

電極を剥離させるたびに、電極を神経または筋肉の近くに配置し、標的となる神経をフックにかけ、マニピュレーターを用いてゆっくりと持ち上げます。次に、キムワイプを使用して神経の切断面を拭き取ります。フックにかけた神経に速乾性の瞬間接着剤を少量塗布し、フックが完全に接着剤で覆われていること、および参照電極の先端に接着剤が付着していないことを確認してください。

次に、ポリエチレンチューブを装着したシリンジを使用して、ディッシュ内の溶液を接着剤に塗布し、接着剤の表面を硬化させます。次のステップでは、記録チャンバーとして使用する直径100mm、深さ50mmのPyrex製記録ディッシュを準備します。漏れを最小限に抑えるため、ピペットチップを用いて、大脳チャンバーとバックルチャンバーの間の切り込み部分に真空グリースを薄く塗布します。その後、フロントチャンバーにプレシア生理食塩水を満たします。

頬部組織をシャーレから丸型のPyrex製ディッシュの前方チャンバーへ慎重に移動させ、電極が強く引っ張られて神経が断裂しないように注意してください。ディッシュを別の実体顕微鏡へ移動させる必要がある場合は、フック電極の取り扱いに十分注意してください。これは鞘を薄くするためです。

頬部塊の各側にある電極をまとめてグループ化します。コネクタピンを覆っているラボテープを掴んで電極を慎重に保持し、電極が強く引っ張られていないことを再度確認してください。ディッシュを顕微鏡の下に配置した際、休憩時や実験のステージ間では、電極がディッシュの側面に緩やかに掛けられ、プラットフォーム上に置かれている状態にします。アクアリウム用エアストーンを用いて、頬部塊チャンバー内の生理食塩水をエアレーションしてください。

次に、CBCをノッチに通した状態で、後方のチャンバーにある脳神経節をピンで固定します。CBCの上に真空グリスをさらに塗布してください。その後、神経節が完全に浸るように、ディッシュの両方にSIA生理食塩水をさらに加えます。

生理食塩水の水位が、大脳室と口室の間の真空グリスの高さよりも低く、室間で漏れが発生しないことを確認してください。この段階で、口塊は前方室の底に静止しているはずです。次に、口塊にまだ付着している神経への損傷を避けるため、中間プラットフォーム上の口神経節をピンで固定します。

2本の神経の間の鞘にのみピンを刺します。次に、CBCを伸展させ固定するために、CBCの側面にさらに2本のピンを追加します。目的のニューロンの位置に合わせて、口神経節を平らに保つか、または回転させてください。

頬神経節を回転させるには、微細ピンセットを用いてCBCの余分な鞘を掴み、頬神経2と頬神経3の間にピンで固定します。これにより、後方に位置し、頬神経節の上方からでは容易にアクセスできなかった細胞体の大部分を確認できるようになります。最後に、頬神経節の鞘の、頬塊側に近い位置に2本のピンを刺します。

口神経節の動きを最小限に抑えるため、後室に近い口神経節の鞘をつかみ、細胞体を露出させないように細いハサミで余分な鞘を切り取ります。損傷を最小限にするため、鞘の薄層化が完了した後、細胞体が見えるのに必要な分だけの鞘を取り除いてください。すべての電極ピンを、アンプに接続されるケーブルのソケットに取り付けます。

電極が強く引っ張られていないこと、適切なケーブルに正しく接続されていること、および極性が正しいことを確認し、残留している塩化マグネシウムを洗い流します。頬塊チャンバー内のSIA生理食塩水を新しいSIA生理食塩水に交換します。次に、頬塊の前方、顎軟骨の背側の軟組織に絹縫合糸を通します。

2つの粘土を用いて縫合糸をディッシュの縁に固定し、口蓋塊を前方端の位置で吊り下げます。ガラス製細胞外電極をマニピュレーターで保持し、電極先端を口蓋神経節の近くに配置します。ニューロンを探索して特定するには、細胞外電極の先端を鞘の上にゆっくりと降ろします。

ニューロンの細胞体に合わせます。刺激電流を印加した後、細胞体の興奮に使用していたチャネルを記録モードに切り替え、細胞外電極での活動および拒絶を誘導する神経上の対応する活動を記録します。モータープログラムと同様に、2 Hz、1 msのパルスを長時間連続して口腔神経2Aに刺激し、eesパターンを生成させます。

これらのパターンは刺激の間持続し、刺激終了後しばらくまで続くことがあります。噛みつきのような運動プログラムを誘発するには、少量の固形カラコール結晶を脳神経節の上に直接置いてください。

反復パターンは通常5分以内に始まり、嚥下を誘導して減衰し始めるまで、およそ10〜15分間持続します。運動プログラムと同様に、caracolを適用し、口腔塊が強力な咬合を生成するまで待ちます。その後、咬合中に海藻の破片を動物の口に配置し、海藻を掴ませます。

ここでは、特定された運動ニューロンB9の刺激および記録と、摂食運動プログラム中の同ニューロン、I2筋肉、および数本の神経からの記録を示します。また、同一の一連の運動プログラムから撮影されたビデオ画像を示します。飲み込みパターンは、脳神経節へのカルバコール投与と、それに続くカルバコール誘発性の咬合中の把持器への海藻片の挿入によって誘導されました。

この画像では、海藻を掴むために歯舌が伸展しており、もう一方の画像では、歯舌が後退して海藻を口の中へと引き込んでいます。このビデオを視聴することで、懸垂式口塊標本の作製方法と、in vitroでの摂食運動プログラムの記録取得方法について十分に理解できるはずです。