Name: ヘルパー依存型アデノウイルスベクターによる遺伝子導入による糖尿病マウスの肝臓におけるネオ·膵島形成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: 学ぶヘルパー依存型アデノウイルスベクターを用いた糖尿病マウスの肝臓におけるネオ・膵島形成の手法。Ngn3とBtc遺伝子導入により高血糖を正常化し、膵島移植の代替治療としての可能性を示す。

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この作品は、NIHからの補助金によって支えられて：R03 DK089061-01（VKY）; NIH：K08 DK068391（VKY）、糖尿病·内分泌研究センター - （DERC - P30DK079638）ベイラー医科大学からパイロット＆フィージビリティ助成DERC（VKY）、若年性糖尿病研究財団：JDRF賞＃5-2006-134（VKY）。

<ol><li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li>
<li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li>
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<li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li>
<li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li>
<li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+Cre%2FloxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li>
<li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li>
<li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

HDAdsは、初期世代の広告の弱点を克服するために、遺伝子治療アプリケーション用に活用するために開発されている。しかし、技術的な課題が残っている。たとえば、HDAdはHDAdの包装とベクトルを増幅するためのHVは初期世代の広告ほど効率的ではありませんが必要です。 HVは、第一世代の広告とHV妥協HDAdの有効性の汚染である。したがって、各継代のために非常に効率的なトランスフェクションし、最適な条件が重要である。ベクトルの生産のためのもう一つの重要なパラメータは、直接浮遊細胞用種菌として使用され、その後の通路5に使用されるべきである通路（P1〜P4）です。我々の経験に、最良の結果がHDAdベクトル割合が劇的に次の一節（ 図2のP3）に増加していることで通路を使用することによって得られる。 HDAdベクターの収量は、導入遺伝子カセットに依存します。両方の遺伝子が下にあるので、ベクトル生産時には、両方の導入遺伝子が発現されるユビキタスプロモーター。 Ngn3は、転写因子とBTCは、そのことを表現成長ホルモンは、ベクトルの複製とパッケージングするのに役立ちますしながら細胞系統に影響を与える可能性の転写因子を発現HDAdベクターはベクター増幅を阻害を示唆している成長因子である。 糖尿病が大流行と想定すると、B細胞塊を復元するための新たなアプローチが必要とされている。本報告書では、膵島成長因子と共に膵島系譜定義する転写因子、Ngn3の遺伝子導入を行うためにHDAdベクトルの利点を活用する方法を記述し、ベータセルリンは、肝臓の門脈周囲の地域で膵島新生を誘導した。これの有効性を評価するためには、安定した高血糖を持つマウスを選択し、適切なコントロールが常に含まれていることを確認することが重要です。この遺伝子導入実験では、空のベクター治療糖尿病マウスは常に利用されるべきである。また、糖尿病のマイルは個別に扱わHDAd-Ngn3とHDAd-BTCを使用してceは膵島新生におけるこれら二つの遺伝子の個々の貢献をテストするために提供しています。我々のデータは、単独でNgn3、膵島新生を誘導するのに十分であることを示しているが、成長因子、BTCの添加は膵島新生の強力な誘導につながる応答を増大するのに役立つ。としてこれは、ベクトル表現が実際に標的組織、肝臓で達成され、また、処置されたマウスの血漿中でアッセイインスリンは膵臓の不在を証明することによって、膵臓の残留膵島から来ていないことを実証することをテストすることも重要である糖尿病マウスの膵島。 要約すると、遺伝子導入のためのHDAd - ベクター系の利点は、その高いクローニング能力、効率的な伝達と最小慢性毒性ならびに宿主へのベクターのゲノムの非統合のその性質を持つ肝臓で長期的な遺伝子発現にある染色体。主要な制限は、その世代とに関与する複雑な手順です。生体内のアプリケーションで主に最も人気のある広告の血清型5と肝臓に限られています。膵島新生は完全膵島成長因子、ベータセルリンと共に膵島系譜定義する転写因子、Ngn3の遺伝子導入することにより、肝臓での膵島新生を誘導することによって、糖尿病マウスにおける血漿インスリンと耐糖能を復元するように誘導することができる。本報告では、我々は高品質HDAd-Ngn3とHDAd-BTCを生成するために最適なプロトコルを示しており、高血糖症を逆に糖尿病マウスの肝臓において膵島新生を誘導し、評価するためのテクニックを紹介します。 脚注：ウイルスベクターおよびここで説明された細胞株は、ベクトルの生産コア研究所糖尿病研究センターは、ベイラー医科大学（から入手可能である<a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ）。いくつかの市販のキットには、HDAdウイルス（ 例えば Microbix biosyst生成するためにも利用できますEMS社）。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> ProFectionR哺乳類トランスフェクションキット</td><td>プロメガ</td><td> E1200 </td></tr><tr><td> DNeasyブラッド＆ティッシュキット（50） </td><td>キアゲン</td><td> 69504 </td></tr><tr><td>パーフェクSYBR Green Supermixを、ROX </td><td>クアンタサイエンス</td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM粉末</td><td>インビトロジェン</td><td> 61100087 </td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン</td><td>シグマ</td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td>アトランタバイオ</td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>インビトロジェン</td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td>ハイグロマイシンB </td><td>シグマ</td><td> H0654-1G </td></tr><tR&gt; <td> MEM EAGLE JOKLIK </td><td>シグマ</td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> RNアーゼ</td><td>ロッシュ</td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase Iを、グレードII </td><td>ロッシュ</td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td>ストレプトゾシン</td><td>シグマ</td><td> s0130 </td></tr><tr><td>ガラススピナーフラスコ</td><td>コー​​ニング</td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td>ガラススピナーフラスコ</td><td>コー​​ニング</td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> -アナライザcassetをスライドさせて</td><td>ピアスCH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td>チューブoptisealポリallomer、11.2ミリリットル</td><td>ベックマン·コールター</td><td> 362181 </td></tr><tr><td>塩化セシウム1キロ</td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td>ベックマンLE-80K </td><td>ベックマン·コールター</td><td>最適なLE-80K超遠心</td></tr><tr><td>フィルター</td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td>管500メートルを遠心リットル</td><td>コー​​ニング</td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner制止</td><td>ブレーントリーの科学的、INC </td><td> TV-150 </td></tr><tr><td>インスリン、マウスELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td>ザルスタット</td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td>シグマ</td><td> G8270 </td></tr><tr><td>マウスC-ペプチドELISAキット</td><td>和光純薬工業株式会社</td><td> ＃631から07231 </td></tr><tr><td>モルモット抗インスリン抗体</td><td>アブカム</td><td> ab7842 </td></tr><tr><td>ヤギ抗PDX1抗体</td><td>博士クリストファー·ライトからの贈り物</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗Ngn3抗体</td><td>ベータ細胞生物学コンソーシアム、 東大。ペンシルベニア州の</td><td> AB2013 </td></tr><tr><td>マウス抗Nkx6.1抗体</td><td>ベータ細胞生物学コンソーシアム、 東大。 Pennsyのlvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td>抗ベータセルリン抗体</td><td>セルサイエンス</td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT（SGPT）色試薬セット。 </td><td>テコ診断</td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST /（SGOT）、カラーエンド試薬セット</td><td>テコ診断</td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> 表2に特異的な試薬および器具。

ヘルパー依存型アデノウイルスベクターによる遺伝子導入による糖尿病マウスの肝臓におけるネオ·膵島形成

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

1型糖尿病は、膵臓のインスリン産生細胞のT細胞媒介性自己免疫破壊によって引き起こされます。膵島移植は、ドナーの可用性ごとおよび長期免疫抑制の必要性により制限されているので、今までインスリン補充は、依然として主要な治療法です。 Neuogenin3の遺伝子導入（Ngn3）によって誘導される膵島新生、膵島系譜定義する特定の転写因子とは、ベータセルリン（BTC）、膵島の成長因子は、1型糖尿病を治すために可能性を秘めています。 アデノウイルスベクター（広告）は、高効率遺伝子導入ベクターであるが、初期世代の広告は 、in vivoで使用中のため、いくつかの欠点を持っています。ヘルパー依存型広告（HDAds）は、広告の初期世代の安全性プロファイルを向上させ、導入遺伝子の発現1を延長するために開発された最も先進的な広告です。彼らはウイルスコード配列2-5を欠いているとだけ広告シス elを保持するので、彼らは慢性毒性を欠いているベクター複製とパッケージングに必要なements。これは、36キロバイトの遺伝子までのクローニングを可能にします。 このプロトコルでは、HDAd-Ngn3とHDAd-BTC生成するとSTZ誘発糖尿病マウスにこれらのベクターを提供する方法について説明します。我々の結果は、それがHDAd-Ngn3の同時注射と肝臓でHDAd-BTC誘発 &#39;ネオ小島&#39;示し、糖尿病マウスの高血糖を反転させます。

我々は、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター（HDAd）と高血糖の反転を用いた遺伝子Neurogenin3の転送（Ngn3）とベータセルリン（BTC）によりSTZにおける肝ネオ膵島形成（ストレプトゾトシン）誘発糖尿病マウスを記述します。我々の方法は、生体内伝達および長続きが遺伝子発現におけるそれらの高効率を持つヘルパー依存型アデノウイルスベクターの機能を活用できます。

1型糖尿病は、膵臓内のインスリン産生細胞がT細胞介在性の自己免疫破壊を受けることで発症します。これまで、インスリン補充療法が依然として...

本実験の全体的な目的は、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターによる遺伝子導入を用いて、糖尿病マウスの肝臓にネオアイレット（新生アイレット）を誘導することです。これは、アイレット転写因子であるneuro遺伝子と、アイレット成長因子であるbetalin遺伝子を搭載したヘルパー依存性アデノウイルスベクターを作製し、これを糖尿病マウスに注入することで肝門脈周囲にネオアイレット形成を誘導することにより達成されます。処理後の糖尿病マウスにおいて、血糖値および血漿インスリン値の正常化、ならびに肝臓内でのインスリン産生β細胞の存在を確認します。これらのアッセイの結果から、肝臓の門脈周囲領域における新生眼瞼（neo eyelid）の形成により、ベクター投与マウスにおいて高血糖が改善されることが示されました。ヘルペス依存性アデノウイルス（herpa dependent avir）ベクターの利点は、広範な親和性と高い容量にあることです。また、ヘルペス依存性アデノウイルスベクターには、アデノウイルス（avir）のコード領域は含まれていません。そのため、慢性毒性は認められません。この手法の意義は糖尿病の治療にまで及びます。なぜなら、新たなアイレットの誘導は、ドナー不足、移植片不全、および同種免疫によって制限されるアイレット移植に代わる有効な選択肢となるからです。一般的に、この方法に不慣れな方は、ベクタークラスのサイズが大きいため、トランスフェクションの手順に苦労することになります。また、ウイルス汚染を最小限に抑えるため、増幅および精製プロセスは慎重に行う必要があります。ヘルパー依存性アデノウイルスベクターの作製には、最適な結果を得るために厳守すべき複数の工程が含まれます。トランスフェクションの準備として、2枚の6 cmディッシュにそれぞれ800,001 16個の細胞を播種します。37°C、5% 二酸化炭素条件下でインキュベートします。2日後、細胞はトランスフェクションに適した70〜80%のコンフルエンシーに達します。トランスフェクション当日、培地を5 mLの新鮮な培地に交換し、細胞を3時間インキュベートします。次に、Promega Transfect社のProfection Agent Mammalian Transfection Kitを用いて、16細胞にneuro gene in three（以下、threeと表記）またはbeta cell（以下、BTCと表記）をコードするDNAを10 µg導入します。翌日、細胞を成長培地1 mLで2回洗浄します。カルシウムおよびマグネシウムを含む0.1 millilitersのPBSで、1細胞あたり500 vector particlesのヘルパーウイルスを添加します。その後、10分ごとに細胞をインキュベーターに入れます。ディッシュを緩やかに揺すり、ヘルパーウイルスを均一に分散させます。60分後、1.5 millilitersの維持培地を加え、ディッシュをインキュベーターに戻して24時間培養します。翌日、さらに1 milliliterの維持培地を加えます。その後、標準的な光学顕微鏡を用いて細胞を観察し、細胞変性効果を評価します。感染細胞は円形となり、剥離します。感染細胞を2日目まで継続して培養してください。この時点で、80%以上の細胞に細胞変性効果（CPE）が認められるはずです。ピぺッティングで粗ウイルスライセートを回収し、5 mLチューブに移します。そこに40% sucroseを10%容量分加えます。このチューブに、継代0回目の粗ウイルスライセートを意味するCVLとラベルを貼ります。ウイルス粒子を放出させるため、粗ウイルス溶解液を含むチューブを-80℃のフリーザーと37°Cのウォーターバスに交互に浸し、凍結融解を3回繰り返します。3回目の凍結融解サイクルの後、付属のテキストに記載されている通り、培地を用いてベクターをさらに増幅させます。ベクターの増幅プロセスにより、ベクターの継代5回目（P5）の粗ウイルス溶解液が得られます。大規模なヘルパー依存性アデノウイルスの製造では、まずベクター増幅手順で得られたP5を、前述の凍結融解プロセスと同様に3回凍結融解することから始めます。3Lスピナーフラスコから1.6×10⁸個の細胞を500mLコニカルボトルに移し、1000×gで5分間遠心分離します。遠心後、上清を100mLだけ残してすべて取り除きます。次に、細胞を再懸濁し、250 mLのスピナーフラスコに再懸濁した細胞を移します。P5粗ウイルス溶出液をすべて加えます。その後、細胞1個あたり200ウイルス粒子となるようにヘルパーウイルスを添加し、37 °C、60 RPMで1時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞懸濁液1 mLを12ウェルプレートのウェルに分注します。残りの細胞懸濁液を新しい3 Lスピナーフラスコに移し、2 Lの懸濁増殖培地を加えます。フラスコとプレートの両方を、二酸化炭素インキュベーター内で60 RPMで2日間インキュベートします。その後2日間にわたり、プレート内の細胞に細胞変性効果（CPE）が現れないか観察します。プレート内の細胞に細胞変性効果（CPE）が見られる場合、スピナーフラスコ内の細胞にも細胞変性効果が現れています。インキュベーション後、遠心分離によって細胞を回収し、「P6」とラベルを貼った50 milliliterチューブ内で15 millilitersの100 millimolar tris. HCLを用いて再懸濁します。精製まで、このチューブを-80 °Cで保存してください。ベクターを精製するには、解凍したP6粗ウイルス溶菌液を含むチューブに5% sodium deoxy coateを1 mL加えます。静かに混ぜ、室温で30分間インキュベートします。次に、塩化マグネシウム、RNase A、およびDNase Iを添加し、37 °Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを6,000 ×gで10分間遠心分離します。遠心後、上清を新しい50 mLチューブまたは滅菌済みのNVT 65超遠心管に回収します。ここに、1.25 g/mLの低密度塩化セシウム溶液2.8 mLを添加します。次に、2 mL ピペットを使用して、1.41 g/mL の高密度 CsCl 溶液 2.8 mL を、ピペットの先をチューブの底に接触させ、ゆっくりと溶液を放出することで加えます。続いて、2 mL ピペットを使用して、上清 5〜6 mL を重ねます。この際、ピペットの先をチューブの側壁に接触させ、ゆっくりと溶液を放出することで、チューブのネックまで満たしてください。そうしないと、高速遠心分離中に潰れる可能性があります。必要に応じて、100 millimolar tris HCLを使用してチューブの残りを満たしてください。その後、10 °Cで237,000 ×g、10 °Cで30分間遠心分離します。密度勾配超遠心分離後、不透明な細胞デブリの下に、乳白色の単一のベクターバンドが確認できます。場合によっては、より顕著なベクターバンドの下に、非常に薄いヘルパーバンドが見えることがあります。乳白色の下のバンドがある部分のチューブ外側を70% ethanolで拭き取ります。次に、22ゲージの針を装着した3mLのシリンジを使用します。ベクターバンドの底部にあるチューブの壁を穿刺し、下方の乳白色のバンドを回収します。回収したベクター物質を新しい滅菌済み超遠心管に移し、チューブのネックまで満たされるように1.35 g/mLの塩化セシウム密度勾配溶液を重ねます。10 °Cで237,000 ×gにて一晩遠心分離します。2回目の密度勾配超遠心分離後、前回と同様に乳白色のバンドを回収します。このバンドを透析カセットに移し、塩化マグネシウムとショ糖を含む滅菌T tris, HCLを用い、4 °Cで翌日まで一晩、3 Lで透析します。透析カセットからヘルパー依存性アデノウイルスベクターを回収するため、3 mLシリンジを用いてカセットの上端隅から2 mLの空気を注入します。カセットを回転させてシリンジと針を下端隅に配置し、カセットを垂直に保ったまま溶液をシリンジ内に吸引します。精製されたウイルスを含むこの溶液を、ラベル付きのクライオチューブに移します。物理的タイター測定用に20 µL、DNA特性解析用に50 µLを1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注し、凍結させる。クライオチューブには精製ウイルスが-80 °Cで保存されている。その後、精製ウイルスのタイター純度とin vitro有効性を評価する必要がある。付属文書に記載されている通り、糖尿病の誘発にはstrept Odinを使用します。本研究では、付属文書に従い、strept zos投与マウスおよび治療マウスの高血糖状態を毎週モニタリングします。血糖値が48時間にわたって250から500 milligrams per deciliterの間で推移した時点で、マウスを尾静脈用固定具に固定し、尾静脈注射を行います。尾静脈を拡張させるため、尾を温水を入れた50 mLチューブに入れます。次に、70% ethanolを浸したティッシュで尾を拭きます。30.5ゲージの針を装着した1 mLシリンジに、適切な濃度のベクターチェックを充填し、シリンジ内に気泡がないことを確認します。次に、親指と人差し指で注入部位より下側の尾を把握し、針を尾静脈に挿入します。針が静脈に入っていれば、針のハブに血液の逆流が見られます。ベクターをゆっくりと注入してください。針が適切に配置されていれば、注入時の抵抗はありません。針を抜き、ガーゼで注入部位を圧迫して止血した後、マウスをケージに戻します。ベクター投与後、6時間絶食後の血糖値と体重を毎週測定し、インスリン値および肝酵素レベルを2週間ごとにモニターします。治療から6週間後に糖耐性試験を行い、治療後3週間および6週間で、グルコース刺激性インスリン分泌がin vivoで回復しているかを確認します。糖尿病マウスの肝臓において、アデノウイルスベクター介在性遺伝子導入によりアイレット新生が誘導されるかを評価するため、組織のMNA分析および免疫染色用にマウスから肝臓と膵臓を採取します。ヘルパー依存性アデノウイルス（H-D-A-D-N-G-N 3およびBTCベクター）は、本ビデオの説明に従って調製および精製し、ストレプトゾトシン誘発糖尿病マウスの尾静脈に注入しました。空ベクトルおよびH-D-A-D-B-T-Cベクトル単独を陰性対照とした。その後、注射から7〜10日後まで2日ごとに血糖値をモニタリングした。HDADおよびGN threeとH-D-A-D-B-T-Cの両方を注射したマウスでは高血糖が改善したが、対照マウスでは改善しなかった。ここに見られるように、治療の6週間後に実施した糖耐性試験により、グルコース刺激性インスリン分泌もモニタリングしました。インスリンが肝臓で合成されたかを確認するため、HDADとGN threeおよびH-D-A-D-B-T-Cの両方を注入したマウスにおいて、インスリン分泌が回復したことを評価しました。肝臓におけるC-peptideおよびインスリン含量を測定しました。C-ペプチド濃度および総インスリン含量を、市販のELISAキットを用いて測定した。モル比におけるC-ペプチドとインスリンの存在は、肝臓で検出されたインスリンが実際に肝臓で合成されていることを裏付けている。免疫組織化学染色では、HDAD、NGN3、およびH-D-A-D-B-T-Cを投与したマウスの肝臓で陽性細胞が認められたが、コントロールベクターを投与したマウスでは認められなかった。また、免疫染色により、NGN3-BTC投与マウスの膵臓に残留膵島が存在しないことが示された。眼瞼特異的な系譜転写因子の発現は、肝臓の免疫染色によっても評価されました。ここで示されているように、NGN threeはNGN three BTC投与マウスの肝臓で発現していましたが、空ベクトル投与マウスでは発現していませんでした。同様に、ここに見られるように、空ベクトルを投与した群と比較して、NGN3 BTCを投与したマウスの肝臓ではBTCが高レベルで発現していました。PDX1の免疫染色では、NGN3 BTC投与マウスの肝臓で核への局在が認められましたが、空ベクトル投与マウスの肝臓では認められませんでした。また、NKX6.1についても、NGN3 BTC投与マウスの肝臓でのみ検出されました。以上の結果を総合すると、マウスの肝臓において眼瞼の新生誘導が成功したことが示唆されます。このビデオを視聴することで、眼瞼の系統決定遺伝子を肝臓に導入して眼瞼の新生を誘導するための、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターの作製方法について深く理解できるはずです。この手法を習得し、適切に実施すれば、3週間で完了させることができます。本手順を実施する際は、ヘルパーウイルスが我々を支援する第一世代のavirであることを念頭に置くことが重要です。in vivoへの適用においては、コンタミネーションを最小限に抑える必要があります。

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マウスで大網に膵島移植法

ここでは、テブフェノジド処理による pEUI(+) 特異遺伝子スイッチを用いた遺伝子発現の調節のためのプロトコルを提案する.

脱皮ホルモン受容体を介した特異遺伝子スイッチ意図的な堅牢性、可逆性、ごくわずかな水漏れしたためと遺伝子発現の

マウス モデルにおける膵島の門脈内移植

短いヘアピンRNA(shRNA)を運ぶレンチウイルスによってトランスネクションされた分散ヒトイストレット細胞から遺伝子改変ヒト擬似を作成するプロトコルが提示される。このプロトコルは、容易に入手可能な酵素および培養容器を利用し、容易に行うことができ、機能的および形態学的研究に適した遺伝子改変ヒト擬似性を産生する。...

低アタッチメントプレートで調製されたヒト擬似スイスレットにおけるレンチウイルス媒介遺伝子サイレンシング

このプロトコルは、非肥満糖尿病(NOD)重症複合免疫不全マウスにNIT-1細胞を移植およびイメージングするための簡単で低侵襲な方法を説明しています。...

マウスにおける自己免疫性糖尿病の養子移植モデルにおける移植片生存の生物発光モニタリング

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内...

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

学ぶヘルパー依存型アデノウイルスベクターを用いた糖尿病マウスの肝臓におけるネオ・膵島形成の手法。Ngn3とBtc遺伝子導入により高血糖を正常化し、膵島移植の代替治療としての可能性を示す。

ヘルパー依存型アデノウイルスベクターによる遺伝子導入による糖尿病マウスの肝臓におけるネオ·膵島形成

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