Name: 機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: 学ぶマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離法。高純度・高生存率の細胞を迅速に分離し、呼吸器疾患の機能・分子生物学研究に応用できます。

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我々は、バイオセーフティーレベル2のサンプルから一次マウスAECIIをソートする際に技術的な支援のためにM.ヘクスターに感謝したいと思います。 この作品は、ドイツ研究協会（DFG）からDB（SFB587、TP B12とBR2221/1-1）、ハノーバー医学研究科（DFG GSC 108）からAAへの奨学金への補助金によって支えられている。 DBは契約番号W2/W3-029下ドイツ研究センターのヘルムホルツ協会（HGF）は大統領のイニシアティブ及びネットワーキング基金によってサポートされています。

必要な試薬および材料に関する詳細は、下記のプロトコール末尾の表にリストされています。水浴中で37℃に作業を開始する前に、ディスパーゼ4mlを含む15 mlチューブを使って（マウス1匹あたり1）を準備し、事前暖かいそれら。加熱ブロックでは、まもなく95から1パーセント低融点アガロース（水中）の小アリコートを加熱℃で液化するまで、使用するまで45℃に続いてクール。 1。マウス肺の調製<ol><li> CO 2窒息によりマウスを生け贄に捧げる。注：正常に実行できませんが、そのような液体と肺のインストールとして、プロトコルの手順に従うように、これは気管を傷つけるように頸椎脱臼を実行しないでください。侵害受容性反射の消失を確認してください。 </li><li>エタノールでマウスをスプレーし、体の腹側正中線に沿って長いカットを行います。腹毛や皮膚を引き、その後も慎重にカットし、腹膜を削除します。 </li><li> Exsanguinate左と右の頚静脈（ 頸静脈 ）並びに腎動脈（ 腎動脈 ） を切断することによって、マウス。組織と流れる血液を除去する。 </li><li>慎重に穿刺してからリブを切り欠いて、心臓や肺を露出するようにダイヤフラムを取り外します。肺を傷つけないよう十分注意してください。 </li><li>緩衝生理食塩水（PBS）冷リン酸で満たさ26Gカニューレおよび10mlのシリンジを用いて、穿刺、心臓の右心室と血がなくなるまでPBSで肺を灌流。 </li><li>気管を露出するために唾液腺を切り取り、削除します。また、慎重に気管を周囲の筋肉を切った。 </li><li>気管に22Gの留置カニューレを挿入し、針を除去し、肺に向かってプラスチック製のカテーテルを押してください。気管およびカテーテルの周りに糸の小片を結合することにより、カテーテルを固定します。 </li></ol> 2。肺組織の酵素消化必要であれば、気管支肺胞洗浄液サンプルはできる次のステップに進む前に、PBSまたは培地で気管内に挿入されたカテーテルを介して肺を洗浄することによって調製した。 <ol><li> 2ミリリットルのシリンジを用いて、慎重にすべてのローブが完全に展開されるように、カテーテルを介して肺にディスパーゼの2ミリリットル（4 mlのアリコートから）の最大音量を植え付ける。液化アガロース0.5 mlを含む1mlシリンジで注射器を交換し、また肺に植え付ける。 </li><li>アガロースの逆流を防止し、すぐに実験室のティッシュペーパーと氷で肺をカバーするためにカテーテルにシリンジのままにしておきます。分のカップルのためのアガロースゲルをみましょう。 </li><li>胸から肺、心臓、胸腺、ティッシュペーパー、氷、注射器やカテーテルを取り外して気管を切断し、消費税。その後、PBSで皿に肺を洗浄し、心臓、胸腺、残りの気管を削除します。 </li><li>ディスパーゼの残りの2ミリリットルに肺を入れて、45分間室温でインキュベートする。 </li></ol> 3。肺の調製細胞懸濁液<ol><li>ディスパーゼから肺を外し、DMEM培地、100μlのDNaseでanti-CD16/32抗体の7ミリリットル（1μg/ mlの最終濃度）を含む皿に移す。 </li><li>ピンセットを用いて、それを完全に引き離すことにより肺組織を崩壊させ、穏やかに200rpmに設定ロッカーに揺らしながら室温で10分間インキュベートする。必要に応じて、細胞懸濁液は、その後、次のステップまで4℃で保存することができます。 </li><li> 100μmであり、その後で、70ミクロン、48ミクロン、30ミクロンの細孔を有する第一ナイロンメッシュを介して細胞懸濁液をろ過する。細胞の損失を最小限に抑え、歩留まりを最大化するために、各メッシュだけでなく、DMEMで徹底的にチューブや食器を洗うために世話をする。あなたがサンプルをプールしている場合、これはその後に同じフィルタを介して1つの群のマウス由来の細胞懸濁液を通過させることによってここに達成することができます。目詰まりした場合にフィルタを新たにする。 </li><li>ボリュームに応じて、1つまたは複数の50mlチューブにろ液を転送し、160×gで15分間、4℃で遠心分離上清を取り除きます。 </li><li> 2ミリリットル赤血球溶解バッファー（0.15M NH 4 Clを 、0.01M KHCO3、0.1mMのEDTA、pH7.2）中で細胞ペレットを再懸濁し、迅速DMEM培地13ミ ​​リリットルを添加して溶解を終了します。 15 mlのチューブと遠心分離機160×gで12分間、4℃に溶液を移す</li></ol> 4。フローサイトメトリー細胞選別のための抗体染色<ol><li>フローサイトメトリーに適した希釈でDMEM培地で調製した3ミリリットル一次抗体カクテル、中に細胞を再懸濁します。 （抗体は以前に100μlの体積で1×10 6脾臓細胞を染色することによって最適な作業希釈の滴定した。使用は5匹までからプールされた細胞のために使用される抗体のそれぞれについて、最適な濃度を含む一次抗体カクテルの3ミリリットル。より多くのマウスは1サンプルにプールされている場合は、ボリュームを調整してください）​​。 </li><li>染色のために、暗所で10分間細胞をインキュベート4℃ </li><li> 160×gで12分および4のDMEM培地、遠心分離にて15mlチューブを充填することにより、細胞を洗浄℃、 </li><li>ケースでは非結合またはビオチン化抗体が4.1で使用された：2で上清を除去し、細胞を再懸濁し - 3ミリリットル二次抗体カクテル。暗闇の中で10分間4℃で染色。 </li><li> 160×gで12分間、4℃でDMEMおよび遠心チューブを充填を介して細胞を洗う</li><li>セルソーティングのためのチューブにフィルターが50μmを通過DMEMおよびプレフィルター1mlに細胞を再懸濁する。オプション：肺の細胞懸濁液中の総細胞数を得るために、細胞をカウントする。 </li></ol> 5。セルソーティング<ol><li>並べ替えの前にボルテックスにより細胞を混ぜる。 AECIIのセルソーティングのために100μmのノズルを使用しています。シース液圧だけでなく、レーザー発光、検出波長は、フローサイトメトリー細胞選別ならびにantibで使用蛍光色素のために使用される機器に依存ODY染色法。 </li><li> DMEMを含むチューブに染色とソートに使用される蛍光色素に対して陰性であるSSCの高い細胞にゲート。 （SSC-）ウィンドウ（でゲーティング戦略の詳細を参照して任意のダブレットまたは細胞凝集体を除外するには、散布高さ（FSC-H）対面積（FSC-A）と側方散乱の高さ（SSC-H）対面積フォワードを使用図1）。 </li><li>選別された細胞は、20×gで280分、4℃で遠心分離収集するために、 </li><li>その後の分析の必要に応じて、文化培地または緩衝液で細胞を再懸濁します。 </li></ol>

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

フローサイトメトリーによるマウスAECIIの単離のための我々のプロトコルは、機能と分子生物学的研究の全体の範囲のためのマウス肺から初代培養細胞にアクセスするための迅速な方法を提供しています。説明する手順では、このようなRNAの単離（ 図2bを参照）、トランスクリプトーム研究などの直接その後の分析のための番号で十分ですAECIIの非常に現実的で純粋な集団が得られます。機能的なアプリケーションでは、AECII馴化培地または共培養実験の世代EGできるように、単離された細胞を培養することも可能です。特にこれらの機能研究のための利点として、ここで説明したように負の選択による初代培養細胞の単離は、抗体結合の対象とされていない手つかずの細胞が得られます。しかし、細胞株において行われるものを介してプライマリAECIIにおける研究の利点にもかかわらず、これらの一次細胞の使用に実用上の制限があります。数字の単なる制限の隣、大規模なスクリーニングを必要とする研究の要件を満たしていないことでしょうが、一次AECIIのみ我々は48時間の周りの平均に観察している限られた時間のための文化の中で生き残る。これらの短期...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>留置カニューレIntrocan 22G </td><td>ブラウン</td><td> REF 4252098B </td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ、100ミリリットル（5000カゼイン単位） </td><td> BD Biosciences社</td><td> 354235 </td><td> 15 mlチューブで4ミリリットルのアリコート、-20℃で保存</td></tr><tr><td> Biozymプラークアガロース</td><td> Biozym </td><td> 840101 </td><td> H 2 O中の1％w / vの</td></tr><tr><td>ウシ膵臓、2000クニッツ単位/バイアルからリボヌクレアーゼI </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D4263 </td><td>新たに300μlのDMEM中で1バイアルの内容物を溶解</td></tr><tr><td> DMEM </td><td>ギブコ</td><td> 22320-022 </td><td> （メーカが提供する低Gとして使用lucose、ピルビン酸、HEPES） </td></tr><tr><td>セルストレーナー（100μm以下、75μm以下） </td><td> BDファルコン</td><td> 352360、352350 </td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ（48ミクロン、30ミクロン） </td><td>バックマン社</td><td> 03-48/26-1020、03-30/18-108 </td><td></td></tr><tr><td> 50μmのフィルターCellTrics </td><td>パーテック</td><td> 04-0042-2317 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD16/CD32 </td><td> BioLegend </td><td> 101302 </td><td>クローン93;精製</td></tr><tr><td>抗マウスF4/80 </td><td> BioLegend </td><td> 123116 </td><td>クローンBM8; APC結合</td></tr><tr><td>抗マウスCD11bを</td><td> BioLegend </td><td> 101208 </td><td>クローンM1/70、PE結合</td></tr><tr><td>抗マウスCD11cは</td><td> BioLegend </td><td> 117310 </td><td>クローンN418; APC結合</td></tr><tr><td>抗マウスCD45 </td><td> BioLegend </td><td> 103102 </td><td>クローン30-F11;精製</td></tr><tr><td>抗マウスCD19 </td><td> eBioscience社</td><td> 12-0193-83 </td><td> EBIO 1D3、PE結合</td></tr><tr><td>ポリクローナルヤギ抗ラットIgG </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 550767 </td><td>ポリクローナル抗体、PE結合</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>代替の蛍光色素に結合された抗体は、使用可能なフローサイトメーターやレーザーに応じて、使用することができます。 </td></tr></tbody></table>

機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスii型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

最後に年間を通して、肺における免疫制御のさまざまな側面に肺胞II型上皮細胞（AECII）の寄与がますます認識されてきた。 AECIIは、炎症を起こした気道でのサイトカイン産生に参加しても感染やT細胞媒介性自己免疫1月8日の両方において抗原提示細胞として作用することが示されている。したがって、彼らはそのような外国人と自己抗原と同様に、直接または間接的にターゲットAECII感染に対する気道過敏性などの臨床の文脈でも、特に興味深いものです。しかし、健康な肺だけでなく、炎症で肺胞II型上皮細胞によって提供される詳細な免疫機能の我々の理解では、断片的なままである。 AECII機能に関する多くの研究が9月12日 、マウスやヒトの肺胞上皮細胞株を使用して実行されます。セルラインでの作業は確かにそのような大量の可用性oと、様々な利点を提供します詳細な分析のためのf細胞。しかし、我々は、プライマリマウスAECIIの使用は感染症や自己免疫炎症のような複雑なプロセスでこの細胞タイプの役割の理解を深めることができると信じています。プライマリマウスAECIIは、彼らが分析設定の役割を果たしているすべての追加の外的要因の影響を受けてきた意味、そのような呼吸器疾患を患っている動物から直接単離することができる。例として、実行可能なAECIIは鼻腔内に主に複製13のためにこれらの細胞を標的とするインフルエンザウイルスに感染したマウスから単離することができる。重要なのは、健康なマウスから単離しAECII の ex vivo での感染を介して、感染時にマウントされた細胞応答の研究は、さらに拡張することができます。 プライマリーネズミAECIIの単離のための私達のプロトコルは、CD11cのは、CD11b、F4/80に特異的な抗体で得られた細胞懸濁液を標識続いマウス肺の酵素消化に基づいているCD19、CD45およびCD16/CD32。粒状AECIIは次に高いラベルの付いていないと脇に散乱（SSC 高 ）細胞集団として同定されており、3を並べ、蛍光活性化細胞で区切られています。 マウス肺からプライマリ上皮細胞を単離する代替的な方法と比較して、負の選択によるAECIIのフローサイトメトリ分離のための我々のプロトコルは比較的短時間で手つかず、極めて現実的で純粋AECIIをもたらします。また、パンとリンパ球の減少による分離の従来の方法とは対照的に、抗体結合磁気ビーズ14,15の結合を介して、フローサイトメトリー細胞ソーティングは、細胞の大きさや細かさによって差別することができます。フローサイトメトリー細胞選別のための計装が使用可能であることを考えると、説明された手順は、比較的低コストで適用できます。このような磁気のような肺の崩壊のために標準的な抗体や酵素、追加の試薬の隣ビーズが必要です。単離された細胞は 、in vitro 培養およびT細胞刺激アッセイならびにトランスクリプトーム、プロテオーム、またはsecretome で分析3、4、機能および分子生物学的研究の広い範囲に適しています。

健康なマウスから単離された肺の細胞懸濁液をソートする場合、AECIIゲートは通常は約42を占めることになるすべてのイベントの±10％。この割合は、初期の細胞懸濁液は、気道に補充リンパ球および他の免疫細胞のかなり高い割合が含まれていますように、このようなウイルス感染などの呼吸器疾患を持つマウスを使用する場合に著しく低くすることができる。 AECIIのために、私たちは約50％AECIIゲート内の細胞の頻度の減少を観察してきた3日目、次の感染にIAV感染肺から単離された。 選別された細胞の典型的なものとしてだけでなく、再分析は、 図1bおよび 1cに描かれている。示されるように、単離された細胞の純度はおよそ92±5％を占めています。 図2aに 、私たちは純粋な細胞集団の分離が成功したことにより排他的に発現されている界面活性タンパク質Cのために染色することによって確認することができる表示AECII 16、17。 我々は、単一の動物ごとに分離されA...

我々は、フローサイトメトリーのネガティブ選択による一次マウスII型肺胞上皮細胞（AECII）の迅速な単離を記述している。これらAECIIは高い生存率と純度を示し、そのような自己免疫疾患や感染症などの呼吸器疾患におけるそれらの役割に関する機能と分子生物学的研究の広い範囲のために適しています。

機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離

ここ数年、肺における免疫調節のさまざまな側面に対する肺胞II型上皮細胞（AECII）の寄与が...

本手順の目的は、その後の機能的および分子的な解析を行うために、純度が高く生存可能な一次ニューロン型2肺胞上皮細胞を単離することです。まず、犠牲にしたマウスの肺と気管に、ディスペイズ溶液、次いでアガロースを注入します。その後、ディスペイズによる肺の消化を待ち、肺を取り出します。組織を手動で分散させます。得られた懸濁液を、孔径が段階的に小さくなる一連のメッシュでろ過します。その後、フローサイトメトリーによるネガティブセレクションを用いて、染色されたタイプII肺胞上皮細胞を単離します。最終的に、単離された2型肺胞上皮細胞を用いて機能的および分子的なアッセイを行い、呼吸器感染症や自己免疫疾患におけるそれらの役割を研究することができます。本手法は、特に自己免疫介在性肺疾患やウイルス感染症の文脈において、肺の免疫反応に関する分野の重要な疑問を解決するのに役立ちます。臓器および細胞懸濁液の調製は習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。このプロトコルの全体的な成功は、これらのステップにおけるいくつかの重要な詳細に依存します。実験に使用するマウスごとに、4 mLのDYSバッファーを含む15 mLチューブを37 °Cのウォーターバスで予熱します。水に溶解させた1% Low Melting Agaroseの小分け分を、液状になるまで95 °Cのヒーティングブロックで加熱してください。その後、45 °Cまで冷却し、次に使用するまでこの温度を維持します。マウスの肺を調製するために、CO2窒息法で安楽死させたマウスをエタノールでスプレーします。体の腹側正中線に沿って長く切開します。次に腹側の皮膚を引っ張り、腹膜を慎重に切除します。マウスを失血させた後、横隔膜を慎重に穿刺して除去し、肋骨を切除します。心臓と肺を露出させる際、冷たい液体を満たした10 milliliterシリンジと26 gaugeカニューレを使用し、肺を損傷させないよう細心の注意を払ってください。PBSを用いて心臓の右心室を穿刺し、肺から血液がなくなるまでPBSで灌流します。唾液腺を切除して取り除き、気管を露出させます。また、気管周囲の筋肉を慎重に切除します。次に、22ゲージの留置カニューレを気管に挿入します。針を抜き、プラスチックカテーテルを肺の方へ押し込みます。気管とカテーテルの周りに短い毛糸を縛り付けて、カテーテルを固定します。必要に応じて、気管に挿入したカテーテルを用いてPBSまたは培地で肺を洗浄し、気管支肺胞洗浄液サンプルを調製します。洗浄液は、次以降の解析まで氷上で保存してください。本手順において最も困難な点は、消化および組織の崩壊です。本プロトコルの成功を確実にするためには、組織消化後のすべての肺葉にDispaが完全に満たされていることを確認する必要があります。組織を崩壊させるため、2 mLシリンジを使用して、あらかじめ調製したDispaを最大2 mLまでカテーテル経由で肺に慎重に注入し、すべての肺葉を完全に拡張させます。次に、シリンジを液状化したAros 0.5 mLが入った1 mLシリンジに交換し、その内容物を肺に注入します。エアロジェルの逆流を防ぐため、シリンジをカテーテルに装着したままにし、直ちに肺をラボ用ティッシュペーパーと氷で覆います。エアロジェルを数分間静置します。その後、ティッシュペーパー、氷、シリンジ、およびカテーテルを取り除きます。次に、気管を切断し、胸部から肺、心臓、および胸腺を摘出します。準備した臓器をディッシュ内でPBSで洗浄します。その後、肺から心臓、胸腺、および残りの気管を切り離して廃棄します。肺を、残りの2 mLのディスプレイを含むチューブに入れ、室温で45分間インキュベートします。染色の手順前に、食細胞のFC受容体を効率的にブロッキングするために、このインキュベーションを行います。肺をディスプレイから、1 µg/mLのanti CD 1632抗体と100 µLのDNAsを含む7 mLのDMEMを入れたディッシュに移し、2本のピンセットを用いて肺組織を引き裂き、完全に分散させます。その後、必要に応じて200 RPMに設定したロッカースタッカーを用い、室温で10分間インキュベートします。その後、細胞懸濁液は次のステップまで4 °Cで保存可能です。細胞懸濁液を一連のナイロンメッシュに通してピペッティングします。まず、50 milliliterチューブの上に設置した100 micronフィルターに懸濁液を注ぎます。サンプルをプールする場合は、同じグループのマウスから得られた細胞懸濁液を同じフィルターに通してください。フィルターが詰まった場合は、新しいものと交換してください。この工程を70 µmのメッシュフィルターで繰り返します。細胞の損失を最小限に抑え、回収率を最大化するために、各メッシュおよびチューブとディッシュをDMEMで十分に洗浄してください。次に、ここで示すように、懸濁液を48 µmのメッシュフィルターに通し、プラスチック製またはガラス製のリングの上に広げます。フロースルーをペトリ皿に回収します。次に、この工程を30 µmのメッシュを用いて繰り返します。液量に応じて、ろ過液を1本または数本の50 mLチューブに移し、4 °Cで160 ×gで15分間遠心分離します。遠心分離後、上清を除去し、細胞ペレットを2 mLのエリスロサイト溶解バッファーで再懸濁します。次に、13 mLのDMEM培地を添加して、速やかに溶解反応を停止させます。溶液を15 mLチューブに移し、160 ×g、4 °Cで12分間遠心分離します。CD11c、CD11b、F4/80、CD19、CD163、およびCD45に対する抗体を含む3 mLの一次抗体カクテルで細胞を再懸濁します。細胞を4 °Cまたは氷上で、暗所にて10分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブにDMEMを満たして細胞を洗浄し、4 °C、160 ×gで12分間遠心分離します。細胞を1 mLのDMEMで再懸濁し、50 µmのフィルターでろ過してセルソート用のチューブに回収します。細胞数を計測し、肺懸濁液中の総細胞数を算出します。EC2のセルソート直前に、100 µmのノズルを使用してください。細胞懸濁液をボルテックスミキサーで攪拌します。流体圧、レーザー照射および検出波長は、フローサイトメトリーによる細胞分取に使用する装置および抗体染色に使用する蛍光色素によって異なります。まず、側方散乱光（SSC）強度対蛍光のプロットを作成し、染色に使用した蛍光色素に陰性で、側方散乱光強度の高いすべての細胞をゲートで囲みます。次に、サイドスキャッター面積（SSC-A）対フォワードスキャッター面積（FSC-A）、フォワードスキャッター高さ（FSC-H）対フォワードスキャッター面積（FSC-A）、およびサイドスキャッター高さ（SSC-H）対サイドスキャッター面積（SSC-A）のプロットを作成し、ダブレットや細胞凝集塊を除外するためのゲートを設定し、DMEMを含むチューブに分取します。健康なマウスから単離した肺細胞懸濁液を分取する場合、通常、EC2ゲートは全イベントの約42±10%を占めます。分取した細胞を回収するために、280×g、4°Cで20分間遠心分離します。後続の解析に合わせて、2型肺胞上皮細胞（AEC2）を培養液または緩衝液で再懸濁します。マウス初代2型肺胞上皮細胞は、本ビデオで説明したフローサイトメトリーによるネガティブセレクションで単離されており、ここでは分取した細胞の解析結果を示します。単離された細胞の純度は約92±5%であった。分取したA EC2をサーファクタントプロテインCで染色し、左に位相差像を、右に免疫蛍光像を示す。ほぼ100%の細胞がサーファクタントプロテインC陽性であることが確認され、純粋な細胞集団の単離に成功したことが証明された。in vivoでのインフルエンザAウイルス感染の影響を評価するため、リン酸緩衝生理食塩水またはインフルエンザAウイルスPR8 A/34を1、2、または3日前に経鼻投与したC57BL/6マウスからA EC2を単離した。これらのプロットは、非感染および感染後3日目のC 57 black six雄マウスから採取した肺細胞懸濁液を示しており、感染肺への免疫細胞の集積に伴い、ソーティングのために染色が行われています。非感染マウスと比較して、感染後3日目のマウスから調製した細胞懸濁液では、蛍光陰性かつサイドスキャッター（側方散乱光）強度が高い細胞の割合が大幅に減少しています。ソーティングされたInfluenza A virus nuclear protein発現細胞（A2）は、核タンパク質特異的抗体を用いた細胞内染色により解析されました。ヒストグラムは、in vivoで感染させたマウスから単離した AEC2 が、インフルエンザAウイルス核タンパク質の細胞内染色後に特異的な蛍光信号を示すことを表しています。表は、インフルエンザAウイルス感染マウスから単離した AEC2 の核タンパク質染色の平均蛍光強度を示しており、細胞内核タンパク質染色によって生成される信号強度は、ウイルス感染期間に伴い増加します。これは、正常なマウスから単離した AEC2 の生存能を実証し、インフルエンザAウイルス感染に対する感受性を検証するためです。ここでは、ex vivoで感染させた単離細胞におけるインフルエンザウイルス核タンパク質の発現解析結果を示します。感染から6時間後、EC2の相当な割合がウイルス核タンパク質を発現しています。これらのデータをここにまとめます。ウイルス核タンパク質の細胞内染色の陽性率（EC2）は、ex vivo感染実験に使用したウイルスの投与量に依存します。これらの結果は、単離した一次ニューロン（EC2）が生存しており、ウイルスタンパク質の発現として評価されるウイルス感染および複製に対して感受性を持つことを示しています。この手順を行う際は、すべての組織消化および分散ステップを慎重に実施することが非常に重要です。また、蛍光陰性分画およびサイドスキャター高値の細胞に対して、厳格にゲーティングを行うことが非常に重要です。この手順に従ってソートを行った後、分子生物学的研究や機能解析などの他の手法を用いることで、ウイルス感染や自己免疫性肺疾患における肺のII型肺胞上皮細胞の役割を排除することが可能です。

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