Name: 機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: 学ぶマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離法。高純度・高生存率の細胞を迅速に分離し、呼吸器疾患の機能・分子生物学研究に応用できます。

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我々は、バイオセーフティーレベル2のサンプルから一次マウスAECIIをソートする際に技術的な支援のためにM.ヘクスターに感謝したいと思います。 この作品は、ドイツ研究協会（DFG）からDB（SFB587、TP B12とBR2221/1-1）、ハノーバー医学研究科（DFG GSC 108）からAAへの奨学金への補助金によって支えられている。 DBは契約番号W2/W3-029下ドイツ研究センターのヘルムホルツ協会（HGF）は大統領のイニシアティブ及びネットワーキング基金によってサポートされています。

必要な試薬および材料に関する詳細は、下記のプロトコール末尾の表にリストされています。水浴中で37℃に作業を開始する前に、ディスパーゼ4mlを含む15 mlチューブを使って（マウス1匹あたり1）を準備し、事前暖かいそれら。加熱ブロックでは、まもなく95から1パーセント低融点アガロース（水中）の小アリコートを加熱℃で液化するまで、使用するまで45℃に続いてクール。 1。マウス肺の調製<ol><li> CO 2窒息によりマウスを生け贄に捧げる。注：正常に実行できませんが、そのような液体と肺のインストールとして、プロトコルの手順に従うように、これは気管を傷つけるように頸椎脱臼を実行しないでください。侵害受容性反射の消失を確認してください。 </li><li>エタノールでマウスをスプレーし、体の腹側正中線に沿って長いカットを行います。腹毛や皮膚を引き、その後も慎重にカットし、腹膜を削除します。 </li><li> Exsanguinate左と右の頚静脈（ 頸静脈 ）並びに腎動脈（ 腎動脈 ） を切断することによって、マウス。組織と流れる血液を除去する。 </li><li>慎重に穿刺してからリブを切り欠いて、心臓や肺を露出するようにダイヤフラムを取り外します。肺を傷つけないよう十分注意してください。 </li><li>緩衝生理食塩水（PBS）冷リン酸で満たさ26Gカニューレおよび10mlのシリンジを用いて、穿刺、心臓の右心室と血がなくなるまでPBSで肺を灌流。 </li><li>気管を露出するために唾液腺を切り取り、削除します。また、慎重に気管を周囲の筋肉を切った。 </li><li>気管に22Gの留置カニューレを挿入し、針を除去し、肺に向かってプラスチック製のカテーテルを押してください。気管およびカテーテルの周りに糸の小片を結合することにより、カテーテルを固定します。 </li></ol> 2。肺組織の酵素消化必要であれば、気管支肺胞洗浄液サンプルはできる次のステップに進む前に、PBSまたは培地で気管内に挿入されたカテーテルを介して肺を洗浄することによって調製した。 <ol><li> 2ミリリットルのシリンジを用いて、慎重にすべてのローブが完全に展開されるように、カテーテルを介して肺にディスパーゼの2ミリリットル（4 mlのアリコートから）の最大音量を植え付ける。液化アガロース0.5 mlを含む1mlシリンジで注射器を交換し、また肺に植え付ける。 </li><li>アガロースの逆流を防止し、すぐに実験室のティッシュペーパーと氷で肺をカバーするためにカテーテルにシリンジのままにしておきます。分のカップルのためのアガロースゲルをみましょう。 </li><li>胸から肺、心臓、胸腺、ティッシュペーパー、氷、注射器やカテーテルを取り外して気管を切断し、消費税。その後、PBSで皿に肺を洗浄し、心臓、胸腺、残りの気管を削除します。 </li><li>ディスパーゼの残りの2ミリリットルに肺を入れて、45分間室温でインキュベートする。 </li></ol> 3。肺の調製細胞懸濁液<ol><li>ディスパーゼから肺を外し、DMEM培地、100μlのDNaseでanti-CD16/32抗体の7ミリリットル（1μg/ mlの最終濃度）を含む皿に移す。 </li><li>ピンセットを用いて、それを完全に引き離すことにより肺組織を崩壊させ、穏やかに200rpmに設定ロッカーに揺らしながら室温で10分間インキュベートする。必要に応じて、細胞懸濁液は、その後、次のステップまで4℃で保存することができます。 </li><li> 100μmであり、その後で、70ミクロン、48ミクロン、30ミクロンの細孔を有する第一ナイロンメッシュを介して細胞懸濁液をろ過する。細胞の損失を最小限に抑え、歩留まりを最大化するために、各メッシュだけでなく、DMEMで徹底的にチューブや食器を洗うために世話をする。あなたがサンプルをプールしている場合、これはその後に同じフィルタを介して1つの群のマウス由来の細胞懸濁液を通過させることによってここに達成することができます。目詰まりした場合にフィルタを新たにする。 </li><li>ボリュームに応じて、1つまたは複数の50mlチューブにろ液を転送し、160×gで15分間、4℃で遠心分離上清を取り除きます。 </li><li> 2ミリリットル赤血球溶解バッファー（0.15M NH 4 Clを 、0.01M KHCO3、0.1mMのEDTA、pH7.2）中で細胞ペレットを再懸濁し、迅速DMEM培地13ミ ​​リリットルを添加して溶解を終了します。 15 mlのチューブと遠心分離機160×gで12分間、4℃に溶液を移す</li></ol> 4。フローサイトメトリー細胞選別のための抗体染色<ol><li>フローサイトメトリーに適した希釈でDMEM培地で調製した3ミリリットル一次抗体カクテル、中に細胞を再懸濁します。 （抗体は以前に100μlの体積で1×10 6脾臓細胞を染色することによって最適な作業希釈の滴定した。使用は5匹までからプールされた細胞のために使用される抗体のそれぞれについて、最適な濃度を含む一次抗体カクテルの3ミリリットル。より多くのマウスは1サンプルにプールされている場合は、ボリュームを調整してください）​​。 </li><li>染色のために、暗所で10分間細胞をインキュベート4℃ </li><li> 160×gで12分および4のDMEM培地、遠心分離にて15mlチューブを充填することにより、細胞を洗浄℃、 </li><li>ケースでは非結合またはビオチン化抗体が4.1で使用された：2で上清を除去し、細胞を再懸濁し - 3ミリリットル二次抗体カクテル。暗闇の中で10分間4℃で染色。 </li><li> 160×gで12分間、4℃でDMEMおよび遠心チューブを充填を介して細胞を洗う</li><li>セルソーティングのためのチューブにフィルターが50μmを通過DMEMおよびプレフィルター1mlに細胞を再懸濁する。オプション：肺の細胞懸濁液中の総細胞数を得るために、細胞をカウントする。 </li></ol> 5。セルソーティング<ol><li>並べ替えの前にボルテックスにより細胞を混ぜる。 AECIIのセルソーティングのために100μmのノズルを使用しています。シース液圧だけでなく、レーザー発光、検出波長は、フローサイトメトリー細胞選別ならびにantibで使用蛍光色素のために使用される機器に依存ODY染色法。 </li><li> DMEMを含むチューブに染色とソートに使用される蛍光色素に対して陰性であるSSCの高い細胞にゲート。 （SSC-）ウィンドウ（でゲーティング戦略の詳細を参照して任意のダブレットまたは細胞凝集体を除外するには、散布高さ（FSC-H）対面積（FSC-A）と側方散乱の高さ（SSC-H）対面積フォワードを使用図1）。 </li><li>選別された細胞は、20×gで280分、4℃で遠心分離収集するために、 </li><li>その後の分析の必要に応じて、文化培地または緩衝液で細胞を再懸濁します。 </li></ol>

<ol><li>Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+epithelial+type+II+cell%3A+defender+of+the+alveolus+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited.</a> Respir. Res. 2, 33-46 (2001).</li>
<li>Folkerts, G., Nijkamp, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelium%3A+more+than+just+a+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Airway epithelium: more than just a barrier.</a> Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).</li>
<li>Gereke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+alterations+in+type+II+alveolar+epithelial+cells+in+CD4%2B+T+cell+mediated+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation.</a> Respir. Res. 8, 47(2007).</li>
<li>Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+type+II+epithelial+cells+present+antigen+to+CD4%28%2B%29+T+cells+and+induce+Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells.</a> Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).</li>
<li>Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+longer+an+innocent+bystander%3A+epithelial+toll-like+receptor+signaling+in+the+development+of+mucosal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation.</a> Mol. Med. 14, 645-659 (2008).</li>
<li>Herold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+epithelial+cells+direct+monocyte+transepithelial+migration+upon+influenza+virus+infection%3A+impact+of+chemokines+and+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules.</a> J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).</li>
<li>Knight, D. A., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+airway+epithelium%3A+structural+and+functional+properties+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease.</a> Respirology. 8, 432-446 (2003).</li>
<li>Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+distribution+in+lung+parenchyma+early+after+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).</li>
<li>Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal-+and+Strain-Specific+Host+MicroRNA+Molecular+Signatures+Associated+with+Swine-Origin+H1N1+and+Avian-Origin+H7N7+Influenza+A+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection.</a> J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).</li>
<li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae%2C+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).</li>
<li>Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetyl-L-cysteine+%28NAC%29+inhibit+mucin+synthesis+and+pro-inflammatory+mediators+in+alveolar+type+II+epithelial+cells+infected+with+influenza+virus+A+and+B+and+with+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV).</a> Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).</li>
<li>Zarbock, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surfactant+protein+C+mutation+A116D+alters+cellular+processing%2C+stress+tolerance%2C+surfactant+lipid+composition%2C+and+immune+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Pulm.+Med%22%5BJournal%5D)">The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation.</a> BMC. Pulm. Med. 12, 15(2012).</li>
<li>Taubenberger, J. K., Morens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+influenza+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The pathology of influenza virus infections.</a> Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).</li>
<li>Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of alveolar type II cells.</a> Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).</li>
<li>Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+murine+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).</li>
<li>Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+synthesis%2C+and+processing+of+surfactant+protein+SP-C+in+rat+lung+analyzed+by+epitope-specific+antipeptide+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies.</a> J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).</li>
<li>Phelps, D. S., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+pulmonary+surfactant+proteins+using+immunohistochemistry+and+tissue+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization.</a> Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+human+alveolar+type+II+cells+secrete+antiviral+IL-29+%28IFN-lambda+1%29+in+response+to+influenza+A+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection.</a> J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+to+influenza+A+virus+in+differentiated+human+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

フローサイトメトリーによるマウスAECIIの単離のための我々のプロトコルは、機能と分子生物学的研究の全体の範囲のためのマウス肺から初代培養細胞にアクセスするための迅速な方法を提供しています。説明する手順では、このようなRNAの単離（ 図2bを参照）、トランスクリプトーム研究などの直接その後の分析のための番号で十分ですAECIIの非常に現実的で純粋な集団が得られます。機能的なアプリケーションでは、AECII馴化培地または共培養実験の世代EGできるように、単離された細胞を培養することも可能です。特にこれらの機能研究のための利点として、ここで説明したように負の選択による初代培養細胞の単離は、抗体結合の対象とされていない手つかずの細胞が得られます。しかし、細胞株において行われるものを介してプライマリAECIIにおける研究の利点にもかかわらず、これらの一次細胞の使用に実用上の制限があります。数字の単なる制限の隣、大規模なスクリーニングを必要とする研究の要件を満たしていないことでしょうが、一次AECIIのみ我々は48時間の周りの平均に観察している限られた時間のための文化の中で生き残る。これらの短期...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>留置カニューレIntrocan 22G </td><td>ブラウン</td><td> REF 4252098B </td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ、100ミリリットル（5000カゼイン単位） </td><td> BD Biosciences社</td><td> 354235 </td><td> 15 mlチューブで4ミリリットルのアリコート、-20℃で保存</td></tr><tr><td> Biozymプラークアガロース</td><td> Biozym </td><td> 840101 </td><td> H 2 O中の1％w / vの</td></tr><tr><td>ウシ膵臓、2000クニッツ単位/バイアルからリボヌクレアーゼI </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D4263 </td><td>新たに300μlのDMEM中で1バイアルの内容物を溶解</td></tr><tr><td> DMEM </td><td>ギブコ</td><td> 22320-022 </td><td> （メーカが提供する低Gとして使用lucose、ピルビン酸、HEPES） </td></tr><tr><td>セルストレーナー（100μm以下、75μm以下） </td><td> BDファルコン</td><td> 352360、352350 </td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ（48ミクロン、30ミクロン） </td><td>バックマン社</td><td> 03-48/26-1020、03-30/18-108 </td><td></td></tr><tr><td> 50μmのフィルターCellTrics </td><td>パーテック</td><td> 04-0042-2317 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD16/CD32 </td><td> BioLegend </td><td> 101302 </td><td>クローン93;精製</td></tr><tr><td>抗マウスF4/80 </td><td> BioLegend </td><td> 123116 </td><td>クローンBM8; APC結合</td></tr><tr><td>抗マウスCD11bを</td><td> BioLegend </td><td> 101208 </td><td>クローンM1/70、PE結合</td></tr><tr><td>抗マウスCD11cは</td><td> BioLegend </td><td> 117310 </td><td>クローンN418; APC結合</td></tr><tr><td>抗マウスCD45 </td><td> BioLegend </td><td> 103102 </td><td>クローン30-F11;精製</td></tr><tr><td>抗マウスCD19 </td><td> eBioscience社</td><td> 12-0193-83 </td><td> EBIO 1D3、PE結合</td></tr><tr><td>ポリクローナルヤギ抗ラットIgG </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 550767 </td><td>ポリクローナル抗体、PE結合</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>代替の蛍光色素に結合された抗体は、使用可能なフローサイトメーターやレーザーに応じて、使用することができます。 </td></tr></tbody></table>

機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスii型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

最後に年間を通して、肺における免疫制御のさまざまな側面に肺胞II型上皮細胞（AECII）の寄与がますます認識されてきた。 AECIIは、炎症を起こした気道でのサイトカイン産生に参加しても感染やT細胞媒介性自己免疫1月8日の両方において抗原提示細胞として作用することが示されている。したがって、彼らはそのような外国人と自己抗原と同様に、直接または間接的にターゲットAECII感染に対する気道過敏性などの臨床の文脈でも、特に興味深いものです。しかし、健康な肺だけでなく、炎症で肺胞II型上皮細胞によって提供される詳細な免疫機能の我々の理解では、断片的なままである。 AECII機能に関する多くの研究が9月12日 、マウスやヒトの肺胞上皮細胞株を使用して実行されます。セルラインでの作業は確かにそのような大量の可用性oと、様々な利点を提供します詳細な分析のためのf細胞。しかし、我々は、プライマリマウスAECIIの使用は感染症や自己免疫炎症のような複雑なプロセスでこの細胞タイプの役割の理解を深めることができると信じています。プライマリマウスAECIIは、彼らが分析設定の役割を果たしているすべての追加の外的要因の影響を受けてきた意味、そのような呼吸器疾患を患っている動物から直接単離することができる。例として、実行可能なAECIIは鼻腔内に主に複製13のためにこれらの細胞を標的とするインフルエンザウイルスに感染したマウスから単離することができる。重要なのは、健康なマウスから単離しAECII の ex vivo での感染を介して、感染時にマウントされた細胞応答の研究は、さらに拡張することができます。 プライマリーネズミAECIIの単離のための私達のプロトコルは、CD11cのは、CD11b、F4/80に特異的な抗体で得られた細胞懸濁液を標識続いマウス肺の酵素消化に基づいているCD19、CD45およびCD16/CD32。粒状AECIIは次に高いラベルの付いていないと脇に散乱（SSC 高 ）細胞集団として同定されており、3を並べ、蛍光活性化細胞で区切られています。 マウス肺からプライマリ上皮細胞を単離する代替的な方法と比較して、負の選択によるAECIIのフローサイトメトリ分離のための我々のプロトコルは比較的短時間で手つかず、極めて現実的で純粋AECIIをもたらします。また、パンとリンパ球の減少による分離の従来の方法とは対照的に、抗体結合磁気ビーズ14,15の結合を介して、フローサイトメトリー細胞ソーティングは、細胞の大きさや細かさによって差別することができます。フローサイトメトリー細胞選別のための計装が使用可能であることを考えると、説明された手順は、比較的低コストで適用できます。このような磁気のような肺の崩壊のために標準的な抗体や酵素、追加の試薬の隣ビーズが必要です。単離された細胞は 、in vitro 培養およびT細胞刺激アッセイならびにトランスクリプトーム、プロテオーム、またはsecretome で分析3、4、機能および分子生物学的研究の広い範囲に適しています。

健康なマウスから単離された肺の細胞懸濁液をソートする場合、AECIIゲートは通常は約42を占めることになるすべてのイベントの±10％。この割合は、初期の細胞懸濁液は、気道に補充リンパ球および他の免疫細胞のかなり高い割合が含まれていますように、このようなウイルス感染などの呼吸器疾患を持つマウスを使用する場合に著しく低くすることができる。 AECIIのために、私たちは約50％AECIIゲート内の細胞の頻度の減少を観察してきた3日目、次の感染にIAV感染肺から単離された。 選別された細胞の典型的なものとしてだけでなく、再分析は、 図1bおよび 1cに描かれている。示されるように、単離された細胞の純度はおよそ92±5％を占めています。 図2aに 、私たちは純粋な細胞集団の分離が成功したことにより排他的に発現されている界面活性タンパク質Cのために染色することによって確認することができる表示AECII 16、17。 我々は、単一の動物ごとに分離されA...

我々は、フローサイトメトリーのネガティブ選択による一次マウスII型肺胞上皮細胞（AECII）の迅速な単離を記述している。これらAECIIは高い生存率と純度を示し、そのような自己免疫疾患や感染症などの呼吸器疾患におけるそれらの役割に関する機能と分子生物学的研究の広い範囲のために適しています。

機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離

ここ数年、肺における免疫調節のさまざまな側面に対する肺胞II型上皮細胞（AECII）の寄与が...

本手順の目的は、その後の機能的および分子的な解析を行うために、純度が高く生存可能な一次ニューロン型2肺胞上皮細胞を単離することです。まず、犠牲にしたマウスの肺と気管に、ディスペイズ溶液、次いでアガロースを注入します。その後、ディスペイズによる肺の消化を待ち、肺を取り出します。組織を手動で分散させます。得られた懸濁液を、孔径が段階的に小さくなる一連のメッシュでろ過します。その後、フローサイトメトリーによるネガティブセレクションを用いて、染色されたタイプII肺胞上皮細胞を単離します。最終的に、単離された2型肺胞上皮細胞を用いて機能的および分子的なアッセイを行い、呼吸器感染症や自己免疫疾患におけるそれらの役割を研究することができます。本手法は、特に自己免疫介在性肺疾患やウイルス感染症の文脈において、肺の免疫反応に関する分野の重要な疑問を解決するのに役立ちます。臓器および細胞懸濁液の調製は習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。このプロトコルの全体的な成功は、これらのステップにおけるいくつかの重要な詳細に依存します。実験に使用するマウスごとに、4 mLのDYSバッファーを含む15 mLチューブを37 °Cのウォーターバスで予熱します。水に溶解させた1% Low Melting Agaroseの小分け分を、液状になるまで95 °Cのヒーティングブロックで加熱してください。その後、45 °Cまで冷却し、次に使用するまでこの温度を維持します。マウスの肺を調製するために、CO2窒息法で安楽死させたマウスをエタノールでスプレーします。体の腹側正中線に沿って長く切開します。次に腹側の皮膚を引っ張り、腹膜を慎重に切除します。マウスを失血させた後、横隔膜を慎重に穿刺して除去し、肋骨を切除します。心臓と肺を露出させる際、冷たい液体を満たした10 milliliterシリンジと26 gaugeカニューレを使用し、肺を損傷させないよう細心の注意を払ってください。PBSを用いて心臓の右心室を穿刺し、肺から血液がなくなるまでPBSで灌流します。唾液腺を切除して取り除き、気管を露出させます。また、気管周囲の筋肉を慎重に切除します。次に、22ゲージの留置カニューレを気管に挿入します。針を抜き、プラスチックカテーテルを肺の方へ押し込みます。気管とカテーテルの周りに短い毛糸を縛り付けて、カテーテルを固定します。必要に応じて、気管に挿入したカテーテルを用いてPBSまたは培地で肺を洗浄し、気管支肺胞洗浄液サンプルを調製します。洗浄液は、次以降の解析まで氷上で保存してください。本手順において最も困難な点は、消化および組織の崩壊です。本プロトコルの成功を確実にするためには、組織消化後のすべての肺葉にDispaが完全に満たされていることを確認する必要があります。組織を崩壊させるため

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JoVE Journal

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免疫学と感染症

マウス肺樹状細胞の高度に精製された調製物が記載されている。特定の重点は、従来の樹状細胞サブセットの分離に与えられます。...

マウス肺樹状細胞の分離

ここでは、単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞（のTEC）を精製するための効率的な方法を記載する。プロトコルは、通常のT細胞の発生、胸腺機能不全、およびT細胞再構成のための胸腺機能の研究のために利用することができる。...

単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞の精製

肺の健康状態は、肺の細気管支に存在する免疫細胞のタイプおよび数によって反映される。私たちは、気管支肺胞洗浄技術を説明し、非接着性細胞およびマウスの下気道からの可溶性因子の単離および研究を可能にする。...

炎症性細胞の浸潤を分析するための肺胞の気管支肺胞洗浄

この研究は、骨格筋からのI型およびII型周皮細胞の容易かつ同時の単離を可能にするFACSベースのプロトコールを記載する。...

マウス骨格筋からのI型およびII型ペリクルの単離

この通信は、人間から肺胞大食細胞の分離と培養の方法論や実験用マウスのモデルについて説明します。...

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

本稿では、ヒト肺の近位領域および遠位領域からの生存上皮細胞の濃縮を可能にする組織解離および細胞分画アプローチの詳細な方法論を提供する。本明細書では、これらのアプローチは、3Dオルガノイド培養モデルの使用を通じて肺上皮前駆細胞の機能解析に適用される。...

オルガノイド培養のためのヒト肺上皮前駆細胞の単離と濃縮

この記事では、新生児マウスから初代肺内皮細胞を単離し、培養しました。...

初代マウス肺内皮細胞の単離

このプロトコルは、インフルエンザ感染後のマウス肺からの生存免疫集団および非免疫集団の定常状態からの分離を詳述しています。また、上皮細胞および骨髄系細胞サブセットを同定するためのゲーティング戦略も提供します。...

マウス肺からの生きた骨髄系および上皮細胞集団の単離

このプロトコルは、新生児、幼獣、成体のマウス肺(感染者・非感染者問わず)から生存可能な肺胞タイプII上皮細胞(AECII)を分離するためのフローサイトメトリー法を提示します。このアプローチにより、AECIIの分子および/または機能的研究が下流で、肺の炎症や感染におけるその役割を特定することが可能になります。...

感染性実験環境に適応可能な新生児、若年、成体のマウス肺から肺胞II型上皮細胞の単離

本論文では、大動脈の免疫成分を調査するために、フローサイトメトリーベースの方法を提示。本稿では、また別々に周囲の外膜と血管壁を調べることができる追加のテクニックを示しています。このメソッドは、大動脈白血球の表現型解析を実行し、アテローム性動脈硬化症の研究のためにいくつかの免疫学的アッセイを適用する可能性を開きます。...

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

学ぶマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離法。高純度・高生存率の細胞を迅速に分離し、呼吸器疾患の機能・分子生物学研究に応用できます。

機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離

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