ナチュラルキラーT細胞の細胞（AAPC）媒介活性化と増殖を提示する人工抗原

本手順の全体的な目的は、NKT細胞を増殖させるためのCD1Dベースの人工抗原提示細胞（aAPC）を作製することです。まず、磁気ビーズを機能化するためにタンパク質を添加し、次に、末梢血から得られた初期のNKT細胞集団を濃縮させることでこれを達成します。

次に、濃縮したT細胞をA A PCと共培養します。最終ステップとして、A A PC細胞集団の表現型および機能を評価します。最終的に、拡張されたT細胞サブセットの純度はフローサイトメトリー解析によって決定できます。樹状細胞を利用する現在の手法と比較してAPCsの主な利点は、樹状細胞ではドナー間の個体差が大きくなる可能性がある点です。

人工抗原提示細胞（APCs）は、NK T細胞を増殖させるための再現可能で市販の、かつ標準化された手法を提供します。この手法を着想したのは、私がジョンズ・ホプキンス大学でSchneck博士およびoaky氏と共に研究していた時でした。彼らは、古典的なCD8 T細胞サブセットの増殖に人工抗原提示複合体を利用するという分野を切り拓いた先駆者です。

本手順の実演は、博士研究員のDr.James Eastと、私の研究室のリサーチアソシエイトであるDr.Wendyの息子が行います。まず、1 mLのDynaBead M-450 Epoxyビーズを5 mLの透明ホウケイ酸ガラス製ねじ口バイアルに移します。次に、別の1.5 mLマイクロ遠心チューブ内で、ビーズを3 mLの滅菌ホウ酸バッファーで洗浄します。

100 µgのヒトCD 1D IGダイマーと20 µgの目的の共刺激分子を、1 mLのカルシウムおよびマグネシウムフリーPBSに加えます。次に、ビーズが入ったガラスバイアルをマグネットに設置し、ホウ酸緩衝液を吸引除去します。その後、タンパク質混合液をガラスバイアルに加え、キャップを締め直します。

バイアルを反転させてすぐに溶液を混合し、キャップをパラフィルムで密閉した後、4 °Cのローテーターで一晩静置します。翌日、ガラスバイアルを再び磁石の上に置き、ビーズに触れないよう注意してタンパク質混合物を除去します。3 mLのビーズ洗浄バッファーを加え、4 °Cのローテーターで5分間インキュベートする操作を3回繰り返し、ビーズを洗浄します。

タンパク質がビーズ上に安定してロードされていることを確認するため、ビーズの一分画を抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析します。次に、5×10⁷個のビーズを小型の1.5 mLガラスバイアルに移し、1 mLの滅菌PBSでビーズを洗浄します。その後、使用する48〜72時間前に準備してください。

ビーズを抗原でコーティングしている間に、洗浄済みビーズを1 mLの滅菌PBSを用いて抗原でロードします。まず、ヘパリン処理したドナー血液を室温で等量のPBSで希釈してPBMCを回収します。次に、室温のPHI 15 mLを50 mLコニカルチューブに加え、希釈した血液混合液25 mLをPHIの上にゆっくりと重層します。

サンプルを室温で700 ×gで30分間、ブレーキオフで遠心分離します。パステールピペットを使用して、リンパ球界面を慎重に新しい50 mLコニカルチューブに移します。次に、リンパ球を50 mLのPBSで洗浄し、上清を除去して、同一ドナーからのチューブを1本のチューブにまとめます。

PBMCをさらに20 millilitersのPBSで洗浄した後、細胞数を計測し、max bufferを用いて5 × 10⁷ cells/milliliterの濃度で再懸濁します。T細胞画分を単離するために、EP human T-cell enrichment kitのPAN T-cell enrichment solution 100 microlitersを2 millilitersのPBMCに加え、室温で10分間インキュベートします。その後、磁気ビーズ100 microlitersを加え、室温でさらに10分間インキュベートします。

溶媒の最終容量を2.5 millilitersにし、チューブをマグネットに設置します。5分後、CD3陽性画分を速やかに15 milliliterコニカルチューブに注ぎ出します。次に、5 millilitersの冷えたmax bufferで細胞を洗浄し、生存細胞数をカウントします。

まずCD 1 61陽性細胞を選択するため、ファクト染色用に分注して取り出します。濃縮したT細胞を980 µLの氷冷max bufferに再懸濁し、その後、10 µgの抗CD 1 61モノクローナル抗体と共に4°Cで10分間インキュベートします。細胞を洗浄した後、ペレットを800 µLのmax bufferおよび200 µLの抗US IgG 1マイクロビーズで再構成します。

この溶液を4°Cでさらに10分間インキュベートします。細胞をマイクロビーズとともにインキュベートしている間に、3 mLのMax Bufferを加えてLSカラムを平衡化します。この細胞画分を洗浄した後、3 mLのMax Bufferに懸濁させた細胞をゆっくりとカラムにピペットで分注します。

次に、3 mLの新鮮なmax bufferでカラムを3回洗浄します。その後、さらに3 mLの新鮮なmax bufferをカラムに加え、カラムを15 mLコニカルチューブに移します。精製されたCD161陽性CD3陽性細胞を押し出し、NKT細胞濃縮画分の数をカウントします。

濃縮したCD161陽性CD3陽性T細胞10⁶個とaAPC 10⁶個を、16 mLの完全培地プレートで共培養することから開始します。共培養物を、低蒸発蓋を備えた組織培養処理済みポリスチレン製96ウェルU底プレートに、1ウェルあたり160 µLずつ分注します。12〜14日目に細胞を回収し、計数します。フローサイトメトリー分析により細胞集団を解析し、その後、再プレートして共培養を行います。

先ほど示した通り、増殖させたNKT細胞のうち、2回目の増殖後に余ったNKT細胞を凍結保存します。aAPC細胞の機能を試験するため、まず96ウェルU底プレートを用い、完結培地で最終容量200 µLとなるように、1ウェルあたり5×10⁴個のNKT細胞と5×10⁵個のaAPCを共培養します。24〜48時間後、ELISA分析用に細胞培養上清を回収します。こちらの図1は、ここで示すように、CD1d-Igタンパク質が磁気ビーズの表面に安定して固定化されていることを示しています。

このグラフに示されているように、CD 1D IGとanti CD 28抗体の両方が磁気ビーズの表面に発現しています。V alpha 14陽性マウスNK T細胞ハイブリドーマDN 30 2D threeを、溶媒可溶性のalpha galera抗原非負荷A A PC、またはalpha gal負荷A A PCのいずれかと共培養しました。その後、培養上清を回収し、ELISAでIL twoの産生量を測定しました。これにより、抗原提示細胞の各バッチを試験するための簡便な方法が提供されます。本実験では、ヒトCD 1 61陽性CD three陽性末梢血T細胞を磁気ビーズ分離法により濃縮しました。

その後、細胞をalpha galera負荷A A PCで14日間、週1回刺激し、V alpha 24およびV beta 11の発現を解析した。重要な点として、初期のNKT細胞集団が0.03%という比較的低い割合であっても、細胞を約67%のV alpha 24陽性V beta 11陽性集団まで増殖させることが可能であることが判明した。ここでは、C one R CD 1D細胞を、Alpha Gal SER抗原の存在下または不在下で、指示された比率でNKT細胞とともに96ウェルU底プレートで20〜24時間インキュベートした。

その後、クロム放出試験により、NKT細胞によるB細胞リンパ腫細胞株の細胞溶解能を評価した。PCで増殖させたNKT細胞は、このリンパ腫細胞株を溶解させることができた。α-ガラクトシルセラミドの存在下または不在下において、健康なボランティアおよびがん患者の両方のPBMCからNKT細胞を増殖させ、α-ガラクトシルセラミドを負荷した。

PCを用いて、両群からNKT細胞集団を増幅させることができました。200万個のCD161陽性CD3陽性T細胞を初期集団として使用した場合、2回の増幅サイクル後に10⁷個以上の細胞を得ることができます。ここで示したように、増幅させたNKT細胞は機能研究に使用可能です。

ex vivo で増殖させた NKT 細胞は、Alpha GAL 刺激に対して応答性を維持しており、IL 17 A、TNF alpha、および interferon gamma の強力な産生細胞となります。なお、初期の T 細胞濃縮集団が少なく、2 回目の CD 1 61 濃縮ステップが実施できない場合、A A PC 介在性の増殖では期待した結果が得られない可能性があることに注意してください。しかし、循環 NKT 細胞の割合が 0.1% より高い場合は、不変 NKT 細胞の有意な増殖を依然として得ることができます。

総括すると、これらのデータは、CD 1DベースのA A PCを用いて、一次ヒトNK T細胞を効果的に増殖および刺激できることを示しています。この手順に続き、NK T細胞の活性化キネティクスはどうであるかといったさらなる疑問を解決するために、QPCRなどの他の手法を実施することができます。本手法は、肝臓学分野の研究者が脂肪肝疾患におけるNK T細胞の役割を探索するための道を切り開くものです。