Name: で食欲連想嗅覚学習ショウジョウバエ幼虫 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学ぶショウジョウバエ幼虫を用いた食欲連想嗅覚学習の行動パラダイム。果糖報酬と嗅覚刺激を組み合わせた訓練法により、神経科学における学習・記憶の基礎メカニズムを解析できます。この手法は遺伝学的操作と組み合わせて神経回路の機能的役割を評価する際に有用です。

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我々は、特に彼らの実験設定と原稿のコメントに関する技術的な手順については、ガーバー·ラボのメンバーに感謝したいと思います。我々はまた、野生型カントン株式のフライケアとメンテナンスのためリュボフPankevychに感謝します。この作品は、DFG助成TH1584/1-1、SNFの助成31003A_132812 / 1およびコンスタンツ大学のZukunftskolleg（全ASTに）によってサポートされています。

1。準備<ol><li> ショウジョウバエの野生型幼虫は10分の14明/暗サイクルにおける℃、60％〜80％相対湿度は25で提起されています。幼虫の正確な年齢を制御するために、常に20人の女性は、標準的なフライ食品の約6mlを含む1バイアル（6cmの高さと直径2.5cm）に10人の男性に置かれます。ハエは12時間の卵を産むために許容されていて、二日目には新しいバイアルに移しています。 25℃で飼育し、現在行動実験のために使用することができれば産卵後5-6日幼虫は摂食第3齢期に達する。しかし、人はバイアルの側面から幼虫ではない食品に残っているため、幼虫だけを取ることを保証しなければならない。これらの幼虫は、すでに&quot;放浪第3齢段階&quot;に達している-まもなく蛹化前に-とその使用方法は、結果の解釈を複雑にします。 </li><li> 2.5％アガロースペトリ皿（他のラボは実験を通しても1％の寒天濃度を使用して、どのように準備これまでより低い濃度は、摂食第3齢幼虫）は基板に穴を掘ることができる場合があります。100ミリリットル蒸留H 2 Oで2.5グラムアガロースを溶かすそれは沸騰開始するまで電子レンジでソリューションを温める。慎重に溶液を攪拌し、すべてのアガロースが溶けるまで電子レンジに入れます。ペトリ皿の底が完全に覆われており、アガロース溶液は、滑らかな表面を形成するようなペトリ皿に熱いアガロース溶液を注ぐ。溶液を室温まで冷却し、蓋を閉じてみましょう。それが蓋に水の凝縮を可能にするであろうため、直ちに蓋を閉じないでください。 </li><li> 2M果糖ペトリ皿の調製：100mlの蒸留H 2 O（再び、1％寒天濃度の使用が可能であるが、それは第3齢幼虫は、基板に穴を掘るために供給できるようになる場合があります）に2.5グラムアガロースを溶かす。それは沸騰開始するまで電子レンジでソリューションを温める。慎重に溶液を撹拌し、マイクロに戻してくださいすべてアガロースまで波が溶解される。慎重に熱い溶液に果糖の35グラムを加える;砂糖を沸騰遅滞を避けるために、溶解するまでゆっくりと混合物をかき混ぜる。底が完全に覆われており、フルクトースアガロース溶液が滑らかな表面を形成するようなペトリ皿にホットフルクトースアガロース溶液を注ぐ。溶液を室温まで冷却し、蓋を閉じてみましょう。それが蓋に水の凝縮を可能にするであろうため、直ちに蓋を閉じないでください。 </li><li> 1 - オクタノール（10月）臭容器の調製：テフロン臭容器カスタムメイドに純粋10月10μlを記入し、臭気の蒸発を可能にするためにいくつかの小さな穴があります蓋をして閉じます。コンテナの詳細な説明はガーバーとストッカー2007に記載されている。 10月には3つの臭容器を準備します。臭容器は、挿入された化学物質の蒸発を可能にするが、幼虫が直接連絡することができないようにしてください。具体的にこのように、ここに記載された実験味覚副作用を乱すことなく、幼虫の嗅覚学習に取り組む。 </li><li>アミル（AM）の臭容器の準備：希釈は、パラフィン油で1:50 AM。カスタムメイドテフロン臭容器に希釈液10μlを記入し、臭気の蒸発を可能にするためにいくつかの小さな穴があります蓋をして閉じます。 AMの3臭容器を準備します。希釈には、2つの匂いとの間の相対的な嗜好の学習に依存する変化にマスクをかけるかもしれません他の上のいずれか臭気に対する強い選好を避けるために、すなわち、実用的な理由のために重要である。両方の臭いのために等しい魅力はナイーブな動物で後述するテスト（2.5）を適用することにより、実験前に実験室で確認する必要があるかもしれません。ここに示された値は、最近我々の研究室9,15,16によって再現されたガーバー·ラボのいくつかの出版物に基づいています。 </li><li>ペトリ皿の標識：行動実験の前にすべてのペトリ皿には、符号化されなければならない。ことを意味すること果糖を含むペトリ皿 &quot;Y&quot;または &quot;B&quot;の &quot;X&quot;又は &quot;A&quot;とアガロースのみペトリ皿に例のためにマークされなければならない。このコードは、すべてのデータが記録された後にのみ、実験者に明らかにされるべきである。 &quot;ブラインド&quot;の実験を行うことにより、実験者の期待は幼虫のパフォーマンスに影響を与えることができることは可能ではありません。我々は唯一の唯一のアガロースに提示された時に果糖ペトリ皿（+）または非報わに提示されたときのいずれか報われる条件刺激（CS1またはCS2）などの悪臭についてお話します、次の中で、幅広い読者の理解を容易にするためにシャーレ（ - ）。 </li></ol> 2。シュガー報酬訓練とテスト<ol><li>食品バイアルから30給第3齢幼虫を収集します。水道水を数滴を含む最初のペトリ皿に移し、慎重にブラシで前後に移動します。またタップWA数滴を含む第二のペトリ皿に移すTERは食料ペーストが幼虫のbodywallに残っていないことを確認してください、そうでない場合は幼虫が実験中に食品の匂いを体験することができるであろう。これはおそらく、テスト状況における学習過程とそのパフォーマンスを不明瞭になります。 </li><li>訓練は、次の政権が適用された食欲の砂糖キューと臭いを関連付けるために幼虫を育成する。含まれているので、果糖報酬（+）ペトリ皿（ &quot;ブラインド&quot;の実験では、詳細は1.6参照用） - &quot;X&quot;のマークされたの左側と右側に10月臭容器を置きます。ペトリ皿の真ん中に30給餌第3齢幼虫の集団を入れて、蓋を閉じて、動物が10月に晒されていながら、5分間待ちます。幼虫は水滴の中に閉じ込められていませんし、それの表面張力を克服できることを確認してください。その幼虫が自由にペトリ皿に移動して、嗅覚および/または味覚刺激を体験することができます。 </li><li>トレーニング：湿らせたブラシでシャーレから幼虫を取り出して、転送したがって、アガロースのみ- （ - ）ペトリ皿を含む- &quot;Y&quot;で標識された第2のペトリ皿の上メートル、その左側と右側にあり、AM臭容器を持っています。ふたを閉め、動物は、AMにさらされながら、5分間待ちます。 </li><li>トレーニング：二回繰り返し2.2）、2.3）、そのようなすべてのこと30幼虫の経験3トレーニングサイクル：CS1 /（+） - CS2 /（ - ）; CS1 /（+） - CS2 /（ - ）; CS1 /（+） - CS2 /（ - ）。この実験では、CS1は、AM用として10月とCS2のコードを表します。 </li><li>テスト：プレイスAM 1およびアガロース専用シャーレの反対のサイトで10月1臭容器。テストのペトリ皿の中央に訓練された動物を転送します。ふたを閉め、5分間待ちます。続いて左側、テストのペトリ皿の真ん中と右側に幼生の数を数えます。 </li><li> 30摂食第3齢幼虫の第二のグループで2.5）にステップ2.1）を繰り返しますが、AMと10月の動物は、次の訓練を受けることなどの実験的な役割を交換：CS2/（+） - CS1 /（ - ）; CS2 /（+） - CS1 /（ - ）; CS2 /（+） - CS1 /（ - ）。この実験では、CS1は、AM用として10月とCS2のコードを表します。 </li><li>トレーニングのための可能な配置。我々は10月/（+）のいずれかの3つのトレーニング試験の存在訓練を提示の上 - AM /（ - ）またはAM /（+）のも3訓練試行の逆数グループ内 - 10月/（ - ）。訓練中に配列依存効果を避けるためにしかし、それは完全な実験の次の繰り返しで刺激の順序を変えることが重要です。 CS1またはCS2順序、また第一又は第二の提示板で報酬プレゼンテーションを変化させることによって、訓練試行のための4つの異なる配列が可能である： </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 最初のグループ </td><td> CS1 /（+） - CS2 /（ - ） </td><td> レシプロカル·グループ </td><td> CS2 /（+） - CS1 /（ - ） </td></tr><tr><td></td><td> CS1 /（ - ） - CS2 /（+） </td><td></td><td> CS2 /（ - ） - CS1 /（+） </td></tr><tr><td></td><td> CS2 /（+） - CS2 /（ - ） </td><td></td><td> CS1 /（+） - CS2 /（ - ） </td></tr><tr><td></td><td> CS2 /（ - ） - CS1 /（+） </td><td></td><td> CS1 /（ - ） - CS2 /（+） </td></tr></tbody></table>周囲の実験環境における刺激の系統的な影響を防止するためには、10月が左側に提示され、右側にAMれるように例の半分でテストを実行する必要があります。例他の半分で右に左にと10月に提示されるべきです。 3。タスクに関連した感覚運動学部のためのテスト上記の実験のデザインは独自に第3齢幼虫の餌野生型で臭気砂糖学習を分析することができます。嗅覚学習がパーに依存している場合しかし、毎日の生活のラボの研究者は、通常、比較するための幼虫の2以上の異なる実験群を使用ticular遺伝子、ニューロンの特定のセット、変異株、特別なダイエット食品、別の飼育条件、有毒な化学物質が幼虫の2以上の実験グループがテストされているすべてのケースでは1がやらなければならない、このようになど、開発時に追加された幼虫の異なるグループが適切な感覚運動acuitiesを示す場合、テストするために必須のコントロール実験のセット。潜在的な表現型が必ずしも砂糖を関連付ける臭気低減又は廃止の能力によるものではないので、これは必須になります。むしろ、潜在的な学習能力の欠陥が臭い及び/又は糖の処理における感覚運動回路のいずれかの工程での欠陥に基づくこ​​とができました。変異幼虫はセンス砂糖にできない場合、または他の言葉で、それは砂糖のメモリを確立することはできません。しかし、これは幼虫が学ぶことができないと結論することはできません。詳しくは下記の対照実験は、トランスジェニック幼虫の適切な10月、AMおよび果糖処理をテストするために行わなければならない。 1。ナイーブ10月prefeのためのテストrence 食品バイアルから30給第3齢幼虫を収集します。 2.1で説明したように水道水で丁寧に洗い流してください。アガロースペトリ皿の片側にシングル10月臭容器を入れ、ペトリ皿の真ん中に幼虫を追加蓋を閉じて、幼虫は10月に向かってシャーレや東洋にクロールできるように、5分間待つ臭気源。その後真ん中にし、テストのペトリ皿の右側に、左側に幼虫の数を数えます。 2。ナイーブAMの好みのためのテスト食品バイアルから30給第3齢幼虫を収集します。 2.1で説明したように水道水で丁寧に洗い流してください。アガロースペトリ皿の片側にシングルAM臭容器を入れ、ペトリ皿の真ん中に幼虫を追加蓋を閉じて、幼虫はAMに向かってシャーレや東洋にクロールできるように、5分間待つ臭気源。その後リットルの数を数える中間の場合、テストのペトリ皿の右側に、左側にarvae。 3。ナイーブ砂糖の好みのためのテスト食品バイアルから30給第3齢幼虫を収集します。 2.1で説明したように水道水で丁寧に洗い流してください。半分、残りの半分の2Mフルクトースアガロース混合物中に2.5％アガロースを含むペトリ皿を準備します。シャーレ上に幼虫を追加し、幼虫は果糖含有側に向かってシャーレや東洋にクロールできるように5分間、蓋を閉じて待つ。その後真ん中にし、テストのペトリ皿の右側に、左側に幼虫の数を数えます。 2分の1〜2分の1ペトリ皿の調製：セクション1.2で上記のように通常のアガロースプレートを準備します。アガロース埋めペトリ皿が冷却されると、慎重にメスで垂直軸に沿ってアガロースを切った。シャーレからアガロースの半分を削除します。 Aペトリ皿の空の半分にddはホットフルクトースアガロース溶液（製造については1.3を参照）。両半分が一致し、定義されたエッジを形成しないように注意してください-これは幼虫の選択行動に影響を与え、むしろ困難な行動分析をレンダリング4。 シャム訓練トランスジェニック給餌第3齢幼虫は10月と空気（3.1）、AMと空気（3.2）、砂糖、純粋なアガロース（3.3）、試験実験の追加セットの間に野生型レベルで区別することができるかどうかのテストにもかかわらず、最近になってきた（議論のためのガーバーやストッカー、2007を参照）を導入しました。これらの実験のための理論的根拠は以下の通りです。訓練中に巨大幼虫ハンドリングと連続匂いと砂糖の刺激を受けています。したがって、観測された学習の表現型は（ナイーブ臭気と砂糖知覚テストは、野生型のレベルにあるが！）誤解を招くことも可能である。確かに、それは可能ですので、トランスジェニック動物Dストレス抵抗性、動機、倦怠感、感覚適応、文脈学習、満腹の変化に対する野生型幼虫からiffer。したがって、ミケルスら （2005）が導入され与えられた変異体は、（1）あなたが報酬を省略して、単に両方にさらすことを除いて、トレーニング中にまったく同じように幼虫を扱う場合は、空臭容器対AM検出することが可能であるかどうか、そのテストを制御悪臭、（2）同じ政権の後10月を検出します。あなたが臭いを省略して、単に報酬を公開することを除き、訓練のような方法で幼虫を扱う場合、（3）、空臭容器対AM検出、および（4 ）同じレジメンの後に10月を検出します。包括的な議論とメソッドの詳細についてはミケルスら （2005）とガーバーとストッカー（2007）を参照してください。 4。シュガー報酬学習のためのデータ解析<ol><li>砂糖報酬学習プロトコルのデータを評価するために2つのレシプロのそれぞれについて、10月の選好指標（PREF OCT）を計算する的に訓練グループ： AM / - （ - ）10月/（+）は、受信した最初のグループのための研修： 左、右、中央のゾーン内のすべての幼虫の＃/ - PREF 10月（10月は+ / AM-）=（＃幼虫のAM側の＃10月側の幼虫） ： - 10月/（ - ）訓練のAM /（+）を受け取った2つ目のグループ PREF午前（AM + / 10月 - ）=（＃午前側の幼虫 - ＃10月側の幼虫）/＃すべての幼虫の左、右、中央のゾーン内</li></ol><ol start="2"><li> 4.1から2のPREF値に対する性能指標（PI））を計算します。 PIは臭いと罰被曝の摂動効果を打ち消すことによって連想的学習の時間及び取扱いの経過を表しています。 PI =（PREF 10月（10月は+ / AM）+ PREF午前（AM + / 10月））/ 2 したがって、PIは-1から1の範囲で指定できます。有意な正の値が食欲学習を記述するのに対し、有意な負の値は、嫌悪、学習表す。完全な実験は、通常10以上のPIで構成されます。データは、ボックスプロットincludinとして可視化される与えられた実験群のグラムは、すべての値。値の50％は、ボックス内に配置され、中央値性能指標は、ボックスプロット内の太線で示されている。 </li></ol> 5。タスクに関連した感覚運動学部のためのデータ解析<ol><li>適切な10月の臭気処理は次のように10月臭選好指標を計算するためにテストするときにデータを評価するには： 左、右、中央のゾーン内のすべての幼虫の＃/ - 臭気PREF 10月=（＃幼虫の反対側にある＃幼虫の10月側） </li><li>適切なAMの匂い知覚は次のように、AM臭選好指標を計算するためにテストするときにデータを評価するには： 臭気PREF AM =（＃午前側の幼虫 - ＃幼虫の反対側）/＃すべての幼虫の左、右、中央のゾーン内</li><li>適切な果糖知覚は次のように果糖選好指標を計算するためにテストするときにデータを評価するには： PREF果糖=（＃幼虫の果糖側 - ＃幼虫の反対側に）/＃左、右、中央のゾーン内のすべての幼虫の</li><li>偽訓練の詳細はミケルスらに与えられている。2005。 </li></ol>

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<li>Tully, T., Cambiazo, V., Kruse, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+through+metamorphosis+in+normal+and+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Memory through metamorphosis in normal and mutant.</a> 14, 68-74 (1994).</li>
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<li>Saumweber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+synaptic+plasticity+are+impaired+upon+lack+of+the+synaptic+protein+SAP47%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Behavioral and synaptic plasticity are impaired upon lack of the synaptic protein SAP47.</a> J. Neurosci. 31, 3508-3518 (2011).</li>
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<li>Rosenzweig, M., Kang, K., Garrity, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+TRP+channels+are+required+for+warm+and+cool+avoidance+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Distinct TRP channels are required for warm and cool avoidance in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 14668-14673 (2008).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

<html> ショウジョウバエの幼虫の記載されているセットアップは比較的初歩脳内で連想嗅覚学習の調査を行うことが可能。アプローチでは、実験室で確立するために、シンプルな安い、簡単ですし、ハイテク機器9を必要としません。我々は、果糖の報酬11によって補強食欲連想学習を研究するために、実験のバージョンを提示します。記載されているセットアップを総合的に訓練試行の数の変化、質量分析対単一のアッセイ、保持時間、使用臭気および臭気濃度とジェンダー9,15,34,35を調査パラメトリック一連の研究に基づいています。このように、描か行動セットアップは、 ショウジョウバエの高次脳機能を研究するための、非常に再現性のあるアプローチでこの情報を統合しています。最終的には、そのシンプルなセットアップに基づいて任意の溶解性物質のやりがいや罰する効果が簡単にこのアッセイを用いて試験することができる。 ve_content &quot;&gt;また、パラダイムのいくつかの変種が最近幼虫23,36の連想視覚学習（ガー...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> CAS番号 </td></tr><tr><td>果糖</td><td>シグマ</td><td> 47740 </td><td> 57-48-7 </td></tr><tr><td> NaClを</td><td>フルカ</td><td> 71350 </td><td> 7647-14-5 </td></tr><tr><td>アガロース</td><td>シグマ</td><td> A5093 </td><td> 9012-36-6 </td></tr><tr><td> 1 - オクタノール</td><td>シグマ</td><td> 12012 </td><td> 111-87-5 </td></tr><tr><td>アミル</td><td>シグマ</td><td> 46022 </td><td> 628-63-7 </td></tr><tr><td>灯油</td><td>シグマ</td><td> 18512 </td><td> 8012-95-1 </td></tr></tbody></table>

で食欲連想嗅覚学習<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

以下では、 ショウジョウバエの幼虫の食欲連想嗅覚学習の方法論の詳細について説明します。セットアップでは、遺伝的干渉との組み合わせで、シンプルな幼虫の脳に特異的に連想学習の神経細胞と分子のファンダメンタルズを分析するためのハンドルを提供します。 生物が存在する動作を調整するために過去の経験を使用することができます。潜在的な行動のような買収は、メモリ·トレース1〜4として学習し、これらのポテンシャルの物理的な拠点として定義することができます。神経科学者は、これらのプロセスは、昆虫から脊椎動物5,6に至るまでモデル生物での様々な方法を用いて脳内の分子やニューロンの変化の観点でどのように構成されるかを理解しよう。そのような努力のためにそれは簡単で、実験的にアクセス可能なモデルシステムを使用すると便利です。 ショウジョウバエの幼虫はに基づいて、これらの要求を満たすことが判明しました7-10：堅牢な行動アッセイ、トランスジェニック技術の多様性と唯一の約10,000ニューロン（認知限界、いくつかの行動オプション、および疑わしい経験の豊かある程度の譲歩とはいえ）を含む神経系の基本組織の存在の可用性。 ショウジョウバエの幼虫は臭いと砂糖11月14日のような食欲の味覚補強の間のアソシエーションを形成することができる。 B.ガーバーの研究室で確立された標準的アッセイでは、動物は、二臭逆数訓練を受ける：幼虫の最初のグループは、味覚の補強材（砂糖の報酬）と一緒に臭気にさらされ、その後臭気にさらされている補強なしの9のB。補強なし臭気が発生し、その後、（砂糖報酬）補強臭気Bにさらされながら、一方で幼虫の2番目のグループは、相互の研修を受ける。以下では、両グループはTESアール2悪臭の間に自分の好みのためのテッド。パフォーマンス指標（PI）として提示 - 報わ臭気のために比較的高い嗜好は連想的学習を反映しています。パフォーマンス·インデックスの連想性質に関する結論がバラバラに臭いや味物質、そのような臭気と報酬の露出、時間と処理の経過2グループ9の間に違いはありませんなどの他のパラメータの間に不測の事態からあるので、説得力がある。

図1Aは、幼虫の嗅覚連合学習の実験手順の概要を示しています。砂糖報酬幼虫を2提示臭いのいずれかを組み合わせることで報われない匂いに比べて報わ匂いに向かって魅力的な応答を表現する潜在的な動作を取得します。幼虫の2つのグループが常にどちら臭気10月またはAMと強化子を組み合わせることで訓練されています。性能指標（PI）は相互に訓練されたグループ間の嗜好の違いとして、連想機能を測定します。 連想機能がトランスジェニック幼虫で分析される場合には、基本的な感覚​​·運動能力のテストが必要です。これは、それらを埋め臭容器と空気との間の選択肢を提供することによって、または純粋なアガロースおよびアガロースプラス砂糖の間に行われます。 （模造の訓練はここでは示していません）。幼虫の最後の分布が特定のデータシートに記載されている（ 図2）と可視れるボックスプロット（ 図3）としてualized。陽性結果は選好指標とパフォーマンス指標の場合食欲学習のための魅力的な選択行動を示しています。負の値は、計算...

ショウジョウバエの幼虫は味覚報酬で匂い刺激を関連付けることができます。ここでは、食欲の連想嗅覚学習の分析を可能にする単純な行動パラダイムを記述します。

以下に、ショウジョウバエ幼虫における食欲性連合嗅覚学習の作法上の詳細を記述します。このセットアップを……と組み合わせることで、

本手順の目的は、高次脳機能を分析することです。単純なモデルとして、食欲を用いたDFA幼虫の連合嗅覚学習を分析します。まず、餌入りのバイアルから、摂食中の3齢幼虫を30匹収集することでこれを実施します。次に、報酬としてフルクトースを、嗅覚刺激として各側に1-octanolを含む臭気容器を配置したペトリ皿上で、幼虫を5分間学習させます。その後、報酬のフルクトースをなくし、各側の臭気容器に酢酸アマミールを入れた状態で、5分間の第2学習フェーズを行います。これら2つの学習フェーズを3回繰り返した後、報酬なしの状態で、対向する側に臭気容器を配置し、5分間のテストに幼虫をさらします。最終的に、あるオクタルに対する酢酸アマールの相対的な臭好性は、ショウジョウバエの幼虫が嗅覚刺激と糖報酬の間の連合を形成できることを示しており、これは遺伝的な操作が容易なシステムにおいて連合学習を研究するために利用可能です。この手法を神経機能の遺伝的干渉と組み合わせることで、「報酬を信号として伝えるニューロンはどれか」、あるいは「反復的な記憶の獲得または想起に必要十分なニューロンはどれか」といった、学習と記憶の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手順を実証することは、術後の評価に寄与します。私の研究室の博士課程の学生が、まずフルクトースを含まない2.5%arosペトリ皿を作成します。フルクトース入りプレートを調製するには、溶解したarosにフルクトースを添加し、プレートに分注します。次に、実験者が識別できないように、これらの各プレートに異なる記号を書き込んでラベル付けします。フルクトースを含むディッシュを条件付け報酬とし、何も入っていないディッシュを非報酬とします。条件刺激として、10 µLの純粋な1-オクタノールを入れたカスタムメイドのテフロン製臭気容器を計3個準備します。蓋には、臭気を揮発させるための小さな穴が開いています。次に、パラフィンオイルで1:50に希釈した酢酸アミルを10 µL入れた臭気容器をさらに3つ用意します。この希釈液は、純粋な1-octanolを10 µL用いた場合と同等の誘引性を持ち、遊走せず摂食している個体を30匹集めることで開始します。第三に、餌 vial から取り出します。このプロトコールは、一日のどの時間帯でも実施可能です。概日リズムには依存しません。larvaを水道水が数滴入ったペトリ皿に移し、筆を使って慎重に前後に動かします。次に、数滴の水道水を入れた2枚目のペトリ皿に幼虫を移します。幼虫の体壁に餌ペーストが付着していないか確認してください。その後、ペトリ皿を実験装置にセットし、特定の糖の合図と臭いを関連付けるよう幼虫を訓練します。使用する2種類の刺激用ディッシュのうち、いずれか1つのディッシュの左側と右側に、におい容器を配置します。ここでは8方向の例を示していますが、実験者は報酬の内容を把握していないため、選択は任意です。次に、幼虫のグループをディッシュの中央に配置します。蓋を閉め、動物を刺激にさらしながら5分間待機します。幼虫が水滴の表面張力に抗して、閉じ込められることなく自由に探索できるようにしてください。新しいAmal acetateの容器を新しいシャーレの上に置きます。5分後、湿らせた筆を使用して、左右に反対の刺激が配置された反対のタイプのシャーレに幼虫を移します。ここでの臭気は酢酸アミルです。幼虫を移した後、蓋を閉め、動物を5分間探索させます。この時間が経過した時点で、第1ラウンドのトレーニングが完了します。第1ラウンドと同様の手順で、さらに2ラウンドのトレーニングを実施します。動物を湿らせたブラシで誘導し、各刺激と報酬の組み合わせに合計3回ずつさらします。実験テスト場所として、各刺激の新鮮な臭気容器を、コーティングされていないアガーのみのペトリ皿の反対側に1つずつ配置します。訓練した動物を皿の中央に移動させます。蓋を閉め、5分間待ちます。5分後、ディッシュの下に、左、右、中央の3つのゾーンを明確に定義するテンプレートを敷き、各ゾーンの幼虫の数を数えます。中央ゾーンは「非好みのスコア」として扱い、これにより解析の制約を高め、バイアスを軽減させます。最後に、実験を完了させるため、新たに30匹の3齢期の餌付けされた幼虫を選び、報酬と刺激の組み合わせを反転させてトレーニングとテストを繰り返します。引き続き同じ匂い容器を使用します。形質転換動物が報酬刺激に対して正常な匂い処理能力を持っているかを確認するため、いくつかの対照試験が必要です。未経験の匂いに対する好みの試験は、トレーニングおよびテスト時と同様に、30匹の幼虫を回収して洗浄することから始めます。次に、一方の側に刺激バイアルを1つだけ配置したアガロースシャーレに幼虫を載せます。蓋を閉め、5分間待ちます。その後、テンプレートを用いて、刺激に対するシャーレ内の近接側、中央、および遠位側にいる幼虫の数をカウントします。ナイーブな糖嗜好性を検証するため、実験で使用する各刺激についてこのテストを行います。シャーレの半分を切り取り、空いたスペースに別の種類の溶融アガロースを満たすことで、ハーフ＆ハーフのペトリ皿を準備します。両側の体積が一致するように注意し、明確な境界線が形成されないようにしてください。この操作には、室温で準備し、給餌後30分が経過して洗浄済みのハーフディッシュを用いて練習が必要な場合があります。3匹のスターラーバをディッシュの中央に配置します。蓋を閉め、5分間待ちます。続いて、テンプレートを用いて、両側および中央にある幼虫の数を数えます。この手順を用いて、trenchgenic幼虫のトレーニングとテストを行いました。例示した刺激を用い、ペトリ皿の異なる領域に存在する幼虫の数をデータとして集計しました。このデータ嗜好から5分後に指数を算出し、相互にトレーニングした群からパフォーマンス指数を導き出した。テストした幼虫はトランスジェニックであったため、臭気容器（充填済み）と空気の選択肢に加え、純粋な香気と香気＋糖の選択肢も提示した。算出した指数を箱ひげ図で検討した結果、動物はフルクトース香気を報酬として、1-オクテン-3-オールと酢酸メチルの区別を学習できることが明らかになった。動物は両方の刺激を誘引剤として認識し、エアロよりもフルクトースエアロを好むという素朴な嗜好性を示しました。この実験パラダイムは、多種多様な嗅覚・視覚刺激、および多種多様な報酬・罰刺激を用いて成功を収めてきました。このパラダイムをショウジョウバエで利用可能な多くの強力な遺伝学的操作と組み合わせることで、神経ネットワークの解析に特に有用となります。例えば、gal4発現パターンによって定義される特定のニューロン群を遺伝学的に操作することで、食欲学習におけるそれらニューロンの機能的な役割を評価することが可能です。この手順を、ニューロン機能の遺伝学的干渉と併せて用いることで、学習と記憶に関与する幼虫脳の神経ネットワークを解析することができます。幼虫の脳は構造が単純であるため、単一細胞レベルでの解析が可能です。

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神経科学

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この研究は、成体果実ハエにおける回避的な連想学習の分析を可能にする単純な行動パラダイムを記述する。この方法は、特定の環境コンテキストと感電との間に形成された関連付けによる自然負のジオタキシス行動を抑制することに基づいています。...

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インビボ 麻酔をかけていない ショウジョウバエ の成虫の神経活動のイメージング

学ぶショウジョウバエ幼虫を用いた食欲連想嗅覚学習の行動パラダイム。果糖報酬と嗅覚刺激を組み合わせた訓練法により、神経科学における学習・記憶の基礎メカニズムを解析できます。この手法は遺伝学的操作と組み合わせて神経回路の機能的役割を評価する際に有用です。

で食欲連想嗅覚学習

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