で食欲連想嗅覚学習ショウジョウバエ幼虫

この手順の目的は、高次脳機能を分析することです。単純なモデルであるDFA幼虫を用い、食欲を介した連合嗅覚学習を解析します。まず、餌の入ったバイアルから、摂食中の3齢幼虫を30匹回収することでこれを行います。

次に、報酬としてフルクトースを配置し、両側に嗅覚刺激として1-octanolを含む臭気容器を置いたペトリ皿上で、幼虫を5分間トレーニングさせます。続いて、フルクトースの報酬を取り除き、両側に酢酸アミルを含む臭気容器を置いた皿上で、5分間の第2トレーニングフェーズを行います。これら2つのトレーニングフェーズを3回繰り返した後、報酬なしの状態で、対向する側に臭気容器を配置し、幼虫を5分間テストに供します。

最終的に、酢酸アマリルに対するあるオクタノールの相対的な臭い嗜好性は、ショウジョウバエの幼虫が嗅覚刺激と糖報酬との間に連合を形成できることを示しており、これは遺伝的に操作可能なシステムにおける連合学習の研究に利用できます。この手法を神経機能の遺伝的干渉と組み合わせることで、報酬を信号として伝えるニューロンはどれか、あるいは反復的な記憶の獲得または想起に必要または十分なニューロンはどれかといった、学習および記憶分野における重要な疑問への回答に寄与します。この手順を実演することは、術後の管理に役立つでしょう。

私の研究室の博士課程の学生が、まずフルクトースを含まない2.5% arosペトリ皿を作製します。フルクトース含有皿を調製するには、溶解したarosにフルクトースを加え、それをプレートに注ぎます。次に、実験者が盲検化されるよう、これらの各皿に異なる記号でラベルを貼ります。

フルクトースを含むシャーレを条件付け報酬とし、何も入っていないシャーレを非報酬とします。条件刺激として、10 µLの純粋な1-octanolを入れたカスタムメイドのテフロン製臭気容器を計3個用意します。蓋には、臭気が蒸発するように小さな穴が開いています。

次に、パラフィンオイルで50倍に希釈した酢酸アミルを10 µLずつ入れた臭気容器をさらに3つ用意します。この希釈液は、純粋な1-オクタノール10 µLと同等の誘引力を持ち、食物瓶から徘徊せずに餌付けされていた30匹を回収し始めます。

このプロトコルは、一日のどの時間帯でも実施可能です。概日リズムには依存しません。幼虫を数滴の水道水が入ったペトリ皿に移し、ブラシを使って慎重に前後に動かします。

次に、同様に水道水を数滴入れた2枚目のシャーレに幼虫を移します。幼虫の体壁に餌ペーストが付着していないか確認してください。これで、シャーレを実験装置に設置し、特定の糖の合図と匂いを関連付けるように幼虫を訓練します。

使用する2種類の刺激用ディッシュのうち、いずれか一方のディッシュの左側と右側ににおい容器を配置します。ここでは8角形のディッシュを使用していますが、実験者は報酬の内容を知らされていないため、選択は任意です。次に、幼虫のグループをディッシュの中央に配置します。

蓋を閉め、動物が刺激にさらされている間、5分間待ちます。幼虫が水滴の表面張力を乗り越え、閉じ込められることなく自由に探索できるようにしてください。新しい酢酸アマール溶液の容器を、新しいペトリ皿に置きます。

5分後、湿らせたブラシを用いて、左右に反対の刺激が配置された反対のタイプのシャーレに幼虫を移します。ここでは、臭気として酢酸アマイルを用います。幼虫を移したら蓋を閉め、5分間探索させます。

この時間が経過すると、第1ラウンドのトレーニングが完了となります。第1ラウンドと同様の方法で、さらに2ラウンドのトレーニングを実施します。湿らせたブラシを用いて動物を移動させ、各刺激と報酬の組み合わせに合計3回ずつさらします。

実験テストの際、各刺激の新鮮な臭気容器を、コーティングされていないアガロースのみのペトリ皿の反対側にそれぞれ配置します。訓練した動物を皿の中央に移動させます。蓋を閉め、5分間待ちます。

5分後、シャーレの下に、シャーレ内を左、右、中央の3つのゾーンに明確に分けるテンプレートを配置し、各ゾーンにいる幼虫の数を数えます。中央ゾーンは「非選択」のスコアとなり、これにより分析の制約が高まり、バイアスが生じにくくなります。最後に、実験を完了させるため、新たに3齢の給餌幼虫を30匹選び、報酬と刺激の組み合わせを反対にしてトレーニングとテストを繰り返します。

引き続き同じ臭気容器を使用します。トランスジェニック動物が報酬刺激に対して正常な臭気処理能力を有しているかを確認するために、いくつかの対照試験が必要です。ナイーブな臭気嗜好性の試験は、トレーニングおよびテストと同様に、30匹の幼虫を回収し、洗浄することから始まります。

次に、片側に刺激バイアルを1つだけ配置したアガロースシャーレに幼虫を載せます。蓋を閉め、5分間待ちます。その後、テンプレートを用いて、刺激に対するシャーレの近傍、中央、および遠方にいる幼虫の数を数えます。

ナイーブな糖嗜好性をテストするため、実験で使用した各刺激に対してこのテストを行います。シャーレの半分を切り出し、空いたスペースに別の種類の溶融アガロースを充填して、半分ずつのシャーレを準備します。両側の体積が一致し、明確な境界が形成されないように注意してください。

これには、室温で準備したハーフディッシュを用い、30匹の未処置で洗浄済みの個体を配置して練習する必要があるかもしれません。次に、ディッシュの中央に3齢幼虫を配置します。蓋を閉め、5分間待ちます。

続いて、テンプレートを用いて、両側および中央にいる幼虫の数をそれぞれカウントする。上述の手順を用いて、trenchgenic幼虫のトレーニングおよびテストを行った。例示された刺激を用いて、ペトリ皿の異なる領域にいる幼虫の数をデータとして集計した。

このデータ設定から5分後、指数を算出し、相互に訓練したグループからパフォーマンス指標を導き出しました。テストに使用した幼虫はトランスジェニックであったため、匂いの入った容器と空気の選択肢に加え、純粋なアロスと糖分を加えたアロスの選択肢も提示しました。算出された指標をボックスプロットで検討した結果、動物はフルクトースアロスを食欲増進剤として使用することで、1つのオクタルをML acetateから区別することを学習できたことが明らかになりました。

動物は両方の刺激を誘引剤として認識し、アロプレンよりもフルクトースのアロマに対して素朴な嗜好性を示しました。この実験パラダイムは、多種多様な嗅覚および視覚刺激、ならびに多種多様な報酬および処罰刺激を用いて成功を収めてきました。このパラダイムをショウジョウバエで利用可能な多くの強力な遺伝学的操作と組み合わせることは、神経ネットワークの解析に特に有用です。例えば、gal4の発現パターンによって定義される特定のニューロンセットを遺伝的に操作することで、食欲学習におけるそれらニューロンの機能的役割を評価することができます。

この手順に加え、神経機能の遺伝的干渉を併用することで、学習と記憶に関与する幼虫脳の神経ネットワークを解析することが可能です。幼虫の脳は構造が単純であるため、単一細胞レベルまで解析を行うことができます。