Name: を経て製造複合抗生物質エリスロマイシンをフィーチャーロジック、実験の手順、および異種天然物合成の可能性 E大腸菌の (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学ぶエリスロマイシンAの異種生合成法。E. coliを宿主として遺伝子クラスターの導入と経路再構成を行い、抗菌活性を評価する手法を解説。創薬開発や天然物生産の基盤技術として応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、異種の生合成に特化プロジェクトを支援するための資金のためのNIH（AI074224とGM085323）とNSF（0712019および0924699）に感謝。

下のテキストは、エリスロマイシン抗生物質に特異的であるが、手順は、異種合成の候補として他の天然物に一般的に適用できるように設計されています。 1。エリスロマイシン遺伝クラスタ転送<ol><li>エリスロマイシン·S内のクラスタに関連付けられたすべての遺伝子を増幅するためのPCRプライマーを設計erythraea染色体。このステップでは、その遺伝子の塩基配列が決定されたこれらの自然の製品候補に固有のものです。あるいは、必要な遺伝子が新たに合成された遺伝子は、E.新しい内最適コドン使用のために設計されるという利点が（いくつかの商用ベンダーオプションを使用して）合成することができる大腸菌宿主。 DNA合成が追求されている場合は、現在の課題は、長さが10キロバイトを超える場合がありますmegasynthase遺伝子を生成しています。技術的には、合成が達成されますが、それは挑戦的で高価であることができます。それが懸念されている継続的なimprovem遺伝子合成技術の親は現在の欠点を解決し、更なる異種遺伝物質を提供するため、このアプローチを検証します。 </li><li>作りたてのSを使用して PCRを行い、テンプレートとしてerythraeaゲノムDNA。染色体DNAは、S.の培養物から調製することができるerythraeaまたは細菌の凍結ストックから（ 図3）25。 PCR反応は、ターゲットの高G+ C含量を考慮するためにDMSOの添加（50μlの反応で4μl）の恩恵を受ける可能性があり、S. erythraea遺伝子 。各増幅された遺伝子は、完全な遺伝子が取り​​出されたことと全く変異がPCRプロセスの間に導入されていないことを確認するために配列決定されるべきである。 </li><li>制限酵素消化およびライゲーションを通して、 大腸菌用に設計された発現ベクターに単離された遺伝子のそれぞれを挿入する大腸菌 （ 図3）。これは、適切な事後に消化し、ライゲーションを可能にするためのPCRプライマー内に制限部位を設計することによって開始されpressionベクター（例えば、 図3に含まれています）。我々はpET21とpET28ベク​​トルの両方を使用しています。 pET28ベク​​ターは、エリスロマイシンの場合に遺伝子発現を助けた5 &#39;リーダー配列を含めることができる。 RT-PCR法、SDS-PAGE分析（可溶性タンパク質画分を使用）、または便利な表現型アッセイ（ 図4）を介して個々の遺伝子の発現を確認してください。 </li><li>首尾よく、個々の発現プラスミド（ 図3）から発現された遺伝子に基づいオペロンを構築します。我々は伝統的に順次オペロンに遺伝子を変換するために互換性のある、まとまりの制限酵素（例えばXbaIおよびSPE私のような）24の組み合わせを使用していますが、オペロンの構築のために選ばれた制限部位は内に存在しなければなりません（または削除する必要があります）孤立を遺伝子配列（遺伝子合成が使用されていれば回避できる問題）。このステップは、 大腸菌の前に20エリスロマイシンの遺伝子を統合大腸菌 transformation。現在、我々は標準pETベクターへの外来DNAの20キロバイト（〜10キロバイトずつの2つの遺伝子）まで含めるには、このメソッドを使用している。さらに、我々は9遺伝子を含むオペロンを生成するには、このアプローチを使用している。それは不明である正確にどのように多くのDNAまたはどのように多くの遺伝子をpET-型プラスミドに組み込まれてもよいが、メトリックは、エリスロマイシンの生合成経路のような複雑なシステムのための基準を提供する上で引用。最後に、標準は in vitroライゲーションステップおよび後続の成功の変換ステップでオペロンおよびプラスミドサイズが大きくなるにつれて、ますます困難になる。ライゲーション温度（12から22℃）と時間（3月24日HR）多様であると電気の変換が最終プラスミドコンストラクトを作製するプロセスを支援するために使用されます。 </li><li> Eに新たに設計された合成プラスミドを形質転換大腸菌は 、電気の変換（ 図5）を使用して BAP1を痛める。手順は、順次または共同で導入されたプラスミドを用いて試みられるかもしれないmbination。サイズ可能または多数のプラスミドを形質転換するとき、我々は伝統的に（などの化学変換とは対照的に）電気の変換を使用しています。一度プレートテトラサイクリン（5 mg / l）の、カルベニシリン（100mg / lの）、カナマイシン（50 mg / l）の、ストレプトマイシン（50mg / lの）、およびアプラマイシン（50mg / lのを含む固体LB培地上の細胞は、形質転換）プラスミドの維持のために選択します。それは、Eの6つの異なる選択抗生物質はポスト変換を使用するのは非常に異例のことだ大腸菌細胞が、これは単に最後のエリスロマイシンの生合成を可能にするために必要なプラスミドの総数を反映している。可能ですが、アプローチが培養回化合物の生産能力が制限されます（以下を参照してください）​​を開始しました。 </li></ol> 2、E.大腸菌の生合成再構成<ol><li>ひずみBAP1は生合成に必要な基質を提供し、翻訳後エリスロノリドBのmegasynthaseを変更するように設計されています。 erytの個々の遺伝子hromycin経路は、遺伝子発現および発現プラスミドにオペロンとしての連結のためにテストされています。このセクションでは、フルエリスロマイシン経路の協調的活動のためにテストするための培養条件に捧げられています。 </li><li>新たに変換BAP1の3つの別々のコロニーを取り、必要なプラスミドの選択抗生物質（同じ濃度で固体培地上で形質転換体を選択する上で示した）、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG含む1.5 mlのLB培養液接種し、100μMを）、アラビノース（2 mg / ml）の遺伝子発現を誘導するため、細胞内生合成前駆体の形成をサポートするためにプロピオン20mMのナトリウム。生が確認された後、大規模な文化は、製品の価をスケーリングし、最大化するための試みで行われてもよい。 </li><li> 24から48時間、22℃、250rpmで培養は、細胞。この場合には、抗生物質の選択は、必要なプラスミドは細胞培養の初期段階で維持されることを保証します。しかし、プラスミド選択抗生物質の濃度は培養時間の経過とともに変更されたとおりの、sは簡単に失われる可能性があります。そして、これは生産能力が制限されるプラスミドの不安定性（ すなわち 、培養中に1つまたは複数のプラスミドの損失）につながる可能性があります。互換性のないプラスミドを完全異種遺伝子クラスターを導入するために使用されたとき問題は悪化する。このような化合物は、エリスロマイシン（ 図5）の場合ですと本当にEから化合物を過剰に是正されなければならないでしょう大腸菌 。ただし、初期生産を実証する目的で、このような設計上の欠陥は、迅速に異種のアプローチの実現可能性を確立するために許容される。 </li><li>エッペンドルフマイクロフュージで10,000 rpmで遠心分離することにより文化を明らかにする。分析のために4の上清およびストア°Cを削除します。 </li><li>エリスロマイシンA、化合物生産の不足の場合pGro7を使用GroESの/ ELシャペロニン（を含めることによって対処されました具体的には（弱い発現/活性の疑い、それらの遺伝子のための）酵素の発現後）の活性の欠如に対処し、付加的な遺伝子コピーの包含する。同様の戦略は、他の異種天然産物の生産努力で必要になることがあります。 </li></ol> 3。製品分析<ol><li>形成を確認し、エリスロマイシンを定量化するために、LC-MSシステム（ 図6）に培養上清を注入します。市販エリスロマイシンは、生産を確認し、定量時の標準としてするために使用された。市販の規格のない症例では、LC-MS分析は、NMRと高分解能質量分析法による付加的な化学特性を必要とするであろう。 </li><li> BAP1変換から3コロニー/文化間の生産と比較してください。最高の生産者を選択し、コロニー·ソースからのグリセロールストックを準備します。この手順は、プロトコルセクションの生産文化と並行して行うことができますグリセロールストックを準備するために文化のごく一部を使って2。 -80℃の冷凍庫にグリセロールストックを保管してください。 </li><li>確認され、最も高い産生細胞株を用いて、独立した生産培養を開始し、酢酸エチルで2倍のボリュームとの最終的な上澄みを抽出します。抽出液を乾燥し、100μlのメタノール中に再懸濁するために真空蒸発システムを使用してください。滅菌フィルターディスク（〜1/4インチ径）にエキスを移し、ディスクが乾燥することができます。これとは別に、文化B.一晩LB液体で枯草 。 Bの20μlを添加し45℃の液体LB寒天20mlに菌の培養℃のプレート寒天固化することができます。 37°C（ 図7）で、プレートとインキュベートにフィルターディスクを挿入します。あるいは、抽出物をプレートリーダー（ 図7）を使用して、アクティビティを定量化するために、96ウェルプレート内で液体培養液に添加することができます。 </li></ol>

<ol><li>Adrio, J. L., Demain, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+improvement+of+processes+yielding+microbial+products%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Genetic improvement of processes yielding microbial products.</a> FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).</li>
<li>Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+an+industrial+strain+of+Saccharopolyspora+erythraea+for+stable+expression+of+the+Vitreoscilla+haemoglobin+gene+%28vhb%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb).</a> Microbiology. 144 (Pt. 9), 2441-2448 (1998).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modulation+of+the+overexpression+of+tailoring+genes+eryK+and+eryG+leading+to+the+improvement+of+erythromycin+A+purity+and+production+in+Saccharopolyspora+erythraea+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic modulation of the overexpression of tailoring genes eryK and eryG leading to the improvement of erythromycin A purity and production in Saccharopolyspora erythraea fermentation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 1820-1828 (2008).</li>
<li>McGuire, J. M., Bunch, R. L., Anderson, R. C., Boaz, H. E., Flynn, E. H., Powell, H. M., Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Ilotycin%2C%22+a+new+antibiotic%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiot+%26+Chemother%22%5BJournal%5D)">"Ilotycin," a new antibiotic.</a> Antibiot & Chemother. 2, 281-284 (1952).</li>
<li>Minas, W., Brunker, P., Kallio, P. T., Bailey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+erythromycin+production+in+a+genetically+engineered+industrial+strain+of+Saccharopolyspora+erythraea%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Improved erythromycin production in a genetically engineered industrial strain of Saccharopolyspora erythraea.</a> Biotechnol. Prog. 14, 561-566 (1998).</li>
<li>Zou, X., Hang, H. F., Chu, J., Zhuang, Y. P., Zhang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+uptake+rate+optimization+with+nitrogen+regulation+for+erythromycin+production+and+scale-up+from+50+L+to+372+m3+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale.</a> Bioresour. Technol. 100, 1406-1412 (2009).</li>
<li>Zhang, H., Boghigian, B. A., Armando, J., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+options+for+the+heterologous+production+of+complex+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prod.+Rep%22%5BJournal%5D)">Methods and options for the heterologous production of complex natural products.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 125-151 (2011).</li>
<li>Cortes, J., Haydock, S. F., Roberts, G. A., Bevitt, D. J., Leadlay, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusually+large+multifunctional+polypeptide+in+the+erythromycin-producing+polyketide+synthase+of+Saccharopolyspora+erythraea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea.</a> Nature. 348, 176-178 (1990).</li>
<li>Donadio, S., Staver, M. J., McAlpine, J. B., Swanson, S. J., Katz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+organization+of+genes+required+for+complex+polyketide+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis.</a> Science. 252, 675-679 (1991).</li>
<li>Salah-Bey, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+inactivation+for+the+elucidation+of+deoxysugar+biosynthesis+in+the+erythromycin+producer+Saccharopolyspora+erythraea%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Targeted gene inactivation for the elucidation of deoxysugar biosynthesis in the erythromycin producer Saccharopolyspora erythraea.</a> Mol. Gen. Genet. 257, 542-553 (1998).</li>
<li>Summers, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+and+mutagenesis+of+genes+from+the+erythromycin+biosynthetic+gene+cluster+of+Saccharopolyspora+erythraea+that+are+involved+in+L-mycarose+and+D-desosamine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production.</a> Microbiology. 143, 3251-3262 (1997).</li>
<li>Corre, C., Challis, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+natural+product+biosynthetic+chemistry+discovered+by+genome+mining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prod.+Rep%22%5BJournal%5D)">New natural product biosynthetic chemistry discovered by genome mining.</a> Nat. Prod. Rep. 26, 977-986 (2009).</li>
<li>McAlpine, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+understanding+and+use+of+the+genomic+base+of+microbial+secondary+metabolite+biosynthesis+for+the+discovery+of+new+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nat.+Prod%22%5BJournal%5D)">Advances in the understanding and use of the genomic base of microbial secondary metabolite biosynthesis for the discovery of new natural products.</a> J. Nat. Prod. 72, 566-572 (2009).</li>
<li>Nett, M., Ikeda, H., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+basis+for+natural+product+biosynthetic+diversity+in+the+actinomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prod.+Rep%22%5BJournal%5D)">Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes.</a> Nat. Prod. Rep. 26, 1362-1384 (2009).</li>
<li>Oliynyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+erythromycin-producing+bacterium+Saccharopolyspora+erythraea+NRRL23338%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338.</a> Nat. Biotechnol. 25, 447-453 (2007).</li>
<li>Wilkinson, B., Micklefield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+and+engineering+natural-product+biosynthetic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 379-386 (2007).</li>
<li>Gokhale, R. S., Tsuji, S. Y., Cane, D. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+and+exploiting+intermodular+communication+in+polyketide+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases.</a> Science. 284, 482-485 (1999).</li>
<li>Quadri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Sfp%2C+a+Bacillus+subtilis+phosphopantetheinyl+transferase+for+peptidyl+carrier+protein+domains+in+peptide+synthetases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Sfp, a Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase for peptidyl carrier protein domains in peptide synthetases.</a> Biochemistry. 37, 1585-1595 (1998).</li>
<li>Pfeifer, B. A., Admiraal, S. J., Gramajo, H., Cane, D. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+complex+polyketides+in+a+metabolically+engineered+strain+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli.</a> Science. 291, 1790-1792 (2001).</li>
<li>Lee, H. Y., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioassay-guided+evolution+of+glycosylated+macrolide+antibiotics+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotics in Escherichia coli.</a> PLoS Biol. 5, e45(2007).</li>
<li>Peiru, S., Menzella, H. G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+the+potent+antibacterial+polyketide+erythromycin+C+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).</li>
<li>Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolically+engineered+Escherichia+coli+for+efficient+production+of+glycosylated+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products.</a> Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).</li>
<li>Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+E.+coli+erythromycin+a+production+through+the+application+of+metabolic+and+bioprocess+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering.</a> Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).</li>
<li>Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+biosynthesis+of+erythromycin+A+and+designed+analogs+using+E.+coli+as+a+heterologous+host%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host.</a> Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).</li>
<li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKieser%2C+T+%22Practical+Streptomyces+Genetics%22">Practical Streptomyces Genetics</a>. , The John Innes Foundation. Norwich, UK. (2000).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

異種合成における重要なステッププロセス内の3つの手続きの各時点で発生している：1）遺伝的伝達、2）生合成の再構成、3）製品分析。いずれかの段階で問題は異種合成の確立を究極の目的を脱線させるでしょう。これは絶対に成功した解析を可能にするために必要とされているので、おそらくプロセスの最も困難な側面は、再構成された生合成を確立しています。しかし、再構成は、最終的な生合成を担う遺伝物質の慎重なデザインと転送に依存しています。同様に、設立され、高感度な分析方法（LC-MSのように）そうでなければ生産の不足として解釈されることがあり、小さな力価レベルを検出することができます。それは異種合成が困難になり、このような状況の集大成です。 エリスロマイシン例に関しては、PCRにより単離さ確認遺伝子配列が個別にEXPについて試験した事前の協調発現および天然産物の形成のための遺伝子を統合へression。製品分析における最初の試みの間に、中間体化合物は、最初シャペロニン（GroEL / ESが）必要な遺伝子クラスターと共発現させたときにのみ確認された。生合成の最後のステップ（eryK）の...

エリスロマイシンは、グラム陽性土壌細菌サッカerythraeaによって生成されるポリケチド抗生物質であり、現在の生産量は徐々に伝統的な変異誘発およびスクリーニングプロトコルの十年を通じて、より最近でプロセスの最適化スキーム〜1-6〜10グラム/ Lに向上しました。変異誘発およびスクリーニング戦略は培養及び/の難しさの結果として、または遺伝的にネイティブの本番ホストを操作し、容易に入手できるので、抗生物質活性や選択を支援するための改善された成長の表現型の抗生物質の天然製品開発では一般的である。エリスロマイシンA、Sの場合にはerythraea生産と新規な誘導体の生合成の急速な進歩を妨げ、したがって、遅い成長プロファイルとより直接的な遺伝子操作技術の欠如（ 大腸菌などの生物に比較して）によって制限されます。生産性の問題を認識し、diversificatiの鍵を開けたエリスロマイシンAのような化合物を用いた可能性について、研究コミュニティは異種合成（ 図1）7のアイデアを追求し始めた。これらの努力は、エリスロマイシン遺伝子クラスター8月11日のために利用可能な配列情報と一致した。それを配列決定し、複雑な天然物の遺伝子クラスターの数が大幅にエンコードされた薬効がある可能性にアクセスするための異種合成における継続的な努力のための原動力を提供し、12から16を拡大したことを強調すべきである。そのためには、異種の再構成は、新しいホストが特定の生合成経路のニーズを満たすことが必要です。E.大腸菌は、技術的な利便性、製品開発のための分子生物学的技術、代謝およびプロセスエンジニアリング戦略のワイドスパンセットを提供します。しかし、ネイティブの本番ホスト、 大腸菌と比較した場合、 大腸菌は、複雑な天然物の生産の同じレベルを示していない。したがって、Eかどうかは不明であった。大腸菌は、複雑な天然物の生合成のための実行可能な異種オプションとして役立つかもしれません。しかし、それは、 大腸菌と仮定した異種合成を達成することができれば、理想的な大腸菌宿主生物であろう。 念頭に置いてこのゴールで、初期の取り組みは、6 -デオキシエリスロノリドB（6dEB）Eを通じてポリケチドアグリコンの製造を開始大腸菌 。ただし、ネイティブE.大腸菌の代謝はプロピオニルCoAのかなりのレベルを提供し、（2S） -メチルマロニルCoAの前駆体は6dEB生合成をサポートするために必要なことができなかったり、新しいホスト·翻訳後エリスロノリドBシンターゼ（DEBS）酵素を変更する可能性があります。これらの問題を解決するには、ネイティブおよび異種酵素から成る代謝経路を大腸菌に組み込まれていたこの経路を完了するためにエンジニアリング時に、SFP遺伝子が目の中に入れた、外生的に供給されたプロピオン酸プロピオニル-CoAとその後（2S） -メチルマロニルCoAに細胞内で変換されたことなどの大腸菌Eの電子染色体BAP1と呼ばれる新しい株を産生する大腸菌 BL21（DE3）。 SFP酵素はDEBS酵素17,18に4&#39;-phosphopantetheine補因子を結合できるトランスフェラーゼphosphopantetheinylです。 3 DEBS遺伝子（それぞれ〜10キロバイト）を、誘導T7プロモーターを含む2つの別々に選択可能な発現ベクター上に置かれた。誘導後の温度（22℃）のキー調整した後、DEBS遺伝子が協調6dEB 19を生成することが可能なアクティブ状態でBAP1内で発現させた。 フルエリスロマイシンの追求が生合成その後スポラmegalomiceaから類似遺伝子クラスターまたはSからの遺伝子から構成されるハイブリッド経路の使用を開始しましたerythraea、S. fradiae、およびS.それぞれ中間エリスロマイシンCと6 -デオキシエリスロマイシンD、20から22を生産venezuelae。最近では、私たちのグループはerythromを生産することによって、これらの努力を拡張しましたE.を通じてycin A（エリスロマイシンの最も臨床的に意義のある形） 大腸菌 。前作とは対照的に、我々の戦略は、協調的に20元Sを表明ポリケチド生合成、デオキシ糖の生合成および添付ファイルは、追加仕立て、自己抵抗（ 図2）のために必要erythraea遺伝子 。合計では、26（ネイティブおよび異種）遺伝子を大腸菌を許可するように設計された4 mg / Lで23,24のエリスロマイシンを産生する大腸菌 。この結果は、 大腸菌を用いて複雑なポリケチド天然物の完全な生産を確立大腸菌やレバレッジ、この新しい制作オプションをするか、新しいものを追求するための基礎として役立つ。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> PCR装置</td><td>エッペンドルフ</td><td> Mastercycler個人</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td>フィッシャー</td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポ</td><td> BioRad社</td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td>フィッシャー</td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td>プロピオン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-アラビノース</td><td>シグマ</td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td>冷蔵シェーカー</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> MAXQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td>フュージ</td><td> Eppendorf </td><td>遠心分離機5415D </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td>タカラ</td><td>シャペロンプラスミドセット（3340） </td><td></td></tr><tr><td> pET21、pET28、PCDF-デュエット-1 </td><td> EMDケミカルズ</td><td> 69742から3、69864、71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 3200 Q-トラップ</td><td></td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>シグマ</td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>シグマ</td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td>真空遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>コンセントレータ5301 </td><td></td></tr><tr><td>ロータリーエバポレーター</td><td>ビュッヒ</td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

を経て製造複合抗生物質エリスロマイシンをフィーチャーロジック、実験の手順、および異種天然物合成の可能性<em&gt; e大腸菌の</em

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

複雑な天然物の異種生産は現在の限界と今後の可能性に対処するために設計のアプローチである。それは治療的価値を有しているが、十分に生産または製造の改良型の恩恵を受けることはできませんこれらの化合物のために特に有用である。 2）異種の再構成、3）製品分析1）遺伝的伝達：関与の実験手順は、次の3つのコンポーネントに分割できます。各実験コンポーネントは課題を満たすとこの新興アプローチに関連する機会を予想する継続的な最適化の下にあります。 異種合成は、貴重な天然物の責任遺伝子配列の同定から始まる。異種宿主に、このシーケンスを転送は、製品の形成に関与する生合成経路の複雑さによって複雑になる。抗生物質のエリスロマイシンが良い例です。二十の遺伝子（）&gt; 50キロバイト、総額は最終的な生合成に必要とされています。さらに、これらの遺伝子の3つのサイズがmegasynthases、マルチドメイン酵素それぞれ〜300kDaのをエンコードします。この遺伝物質を設計し、 大腸菌に転送する必要があります再構成された生合成のための大腸菌 。 PCR産物の分離、オペロンの構築、マルチcystronicプラスミド、および電気変換の使用は、エリスロマイシンの大腸菌への遺伝的クラスタを転送することで説明される大腸菌 。 一度転送、 大腸菌大腸菌細胞は、最終的な生合成をサポートする必要があります。このプロセスは 、Eとの間の実質的な違いは与えられた挑戦している大腸菌や複雑な天然物の形成に関与する最も元ホスト。セルは、生合成をサポートし、協調的に活性な酵素を生成するために転送遺伝クラスタを表現するために必要な基質を提供する必要があります。エリスロマイシンA、Eの場合には大腸菌細胞は、2つの前駆体（PRを提供するように設計しなければなりませんでしたopionyl-CoAと（2S） - メチルマロニルCoA）生合成に必要。また、遺伝子配列の変更、プラスミドのコピー数、シャペロニン共発現、翻訳後修飾酵素、およびプロセス温度も最終エリスロマイシン形成できるようにする必要がありました。 最後に、成功した生産が評価されなければならない。エリスロマイシンのケースでは、我々は2つ​​の方法を紹介します。第一は、液体クロマトグラフィー - 質量分析（LC-MS）が生産を確認し、定量化することである。エリスロマイシンの生物活性はまた、抗生物質活性を枯草菌に対してテストされているバイオアッセイを使用することによって確認される。エリスロマイシン確立アセスメントアッセイEから生合成大腸菌や生産を改善したり、多様化する将来のエンジニアリング作業のために、このアプローチを使用して、新しい複雑な天然化合物の生産のための段階を設定します。

このアプローチの望ましい結果は、 大腸菌から完全に生理活性天然物の生産である異種宿主大腸菌 。これは最高の生産量（ 図6）と（ 図7）は、最終的な活性を確認するために使用される抗菌性バイオアッセイを確認し、定量化するために使用したLC-MSの結果によって表されます。異種合成の全体的なスキームでは、この結果は、成功を定義します。一度達成し、研究活動は、最適化（両方の携帯電話およびプロセススケールで）と分子工学に向ける。最終目標は、プロセスへの合理的な修正が高まったり広げ活性スペクトルの可能性と、元の化合物の変異体を産生するために行うことができることそのような異種システム上の元の化合物および制御のための経済的な生産プロセスを含む。 所望の化合物を生成するために失敗すると、その後数々のコンティンジェンシー·プラントンをトリガ成功した生合成を禁止されているアプローチのどの部分を評価するO。これらのトラブルシューティングメカニズムの多くは、上記のプロシージャ内に建てられています。我々の経験...

スルーエリスロマイシンの異種合成<em&gt; E大腸菌の</em2）異種の再構成、3）製品分析1）遺伝的伝達：&gt;以下のような実験の手順が含まれます。各ステップは、使用しての治療自然な製品の生産に意欲、可能性、そして課題の文脈で説明する<em&gt; E大腸菌の</em&gt;代理ホストとして。

を経て製造複合抗生物質エリスロマイシンをフィーチャーロジック、実験の手順、および異種天然物合成の可能性<em&gt; E大腸菌の</em

複雑な天然物の異種宿主による生産は、現在の限界を克服し、将来的な可能性を追求するために考案されたアプローチである。これは...

異種生物合成は、ある生物の生合成経路を、遺伝子の協調的な発現を通じて別の宿主生物で再現させる手法です。本実験では、抗生物質であるエリスロマイシンAを大量に生産することを最終目的として、その生合成経路を大腸菌（E. coli）宿主システムに導入します。まず、エリスロマイシン合成を担う遺伝子クラスターを元の細菌宿主から単離します。その後、外来遺伝物質をオペロン形式で再設計し、E. coliにおける完全な酵素経路の協調的発現を実現させます。異種エリスロマイシン経路を保持するE. coli株を培養して増殖させると、最終的にエリスロマイシン化合物が産生されます。この化合物の抗生物質活性は、Bacillus solus機能アッセイを用いて試験することができます。これは、元の生物を用いて複雑な天然物を産生させる手法とは対照的なアプローチです。E. coliを用いた異種生物合成は、プロセスの迅速化とエンジニアリングの可能性を提供します。この概念は約10年から15年前に始まりましたが、さまざまな技術的突破口や技術向上により、ようやく最近になって、E. coliを用いた天然物の複雑な生産において真の成功例が見られるようになりました。まず、染色体内のクラスターに関連するすべての遺伝子を増幅するためのPCRプライマーを設計し、注文します。ポリメラーゼ連鎖反応には、テンプレートとして調製したばかりのゲノムDNAを使用してください。S eryriのエリスロマイシンAクラスターのように、標的遺伝子のGC含量が高い場合は、50 µLの反応系に4 µLのDMSOを添加します。シーケンシングによりPCR産物の同一性を確認してください。その後、PCR遺伝子産物をE. coli発現系にクローニングします。本研究では、末端リーダー配列の導入によってタンパク質の過剰発現が促進されたため、特定の遺伝子に対してpET-28aを発現ベクターとして使用しました。次に、機能的なタンパク質調製物の発現を確認します。RT-PCR-SDS-PAGE解析または簡便な表現型アッセイを用いて、個々の発現プラスミドから正常に発現した遺伝子に基づいたオペロンを構築します。可能であれば、適合する粘着末端制限酵素を組み合わせて設計し、遺伝子を順次変換させます。オープンコンストラクションの過程では、使用する制限酵素が個々の配列を切断しないことを確認する必要があります。もし切断される場合は、遺伝子合成を検討する必要があります。付属の手稿に詳細に記載された要因を考慮した上で、20種類のエリスロマイシンA遺伝子を発現プラスミドに組み込む操作に進んでください。次に、新しく設計した生合成プラスミドを、順次または組み合わせて E. coli BAP1 株に形質転換し、プラスミドの保持を選択するために、複数の抗生物質を含む LB 固形培地に細胞をプレートします。E. coli の形質転換において 6 種類の異なる抗生物質選択を用いることは非常に珍しいことですが、これは E. coli で エリスロマイシン A を全合成するために 6 つのプラスミドが必要であるためです。このセクションでは、エリスロマイシン A パスウェイ全体の協調的な活性のための培養条件を確立します。Gen BP oneは、cin（バイオ合成）に必要な基質の提供、およびIDEメガ合成の翻訳後修飾を行うために設計されました。新しく形質転換したBAP oneから個別のコロニーをピックアップし、必要なプラスミド選択抗生物質、100 µM IPTG、2 mg/mL アラビノース（遺伝子発現誘導用）、および20 mM プロピオン酸ナトリウムを含む1.5 mLのalb培地を用いて、3つの培養液を接種してください。細胞内での生合成前駆体の形成を促進するため、細胞を22 °C、250 RPMで24から48時間培養します。増殖中のプラスミド安定性を解析するため、定期的に培養液をサンプリングしてください。10,000 RPMで遠心分離を行い、培養液を清澄化します。上清を除去し、ペレットを4 °Cで保存して分析に用います。エリスロマイシンAの生成を確認および定量するため、培養上清をLC-MSシステムに注入します。また、市販のエリスロマイシンAの標準サンプルも同様に分析します。市販の標準品がない場合についても同様です。この化合物については、NMRおよび高分解能質量分析によるさらなる化学的特性解析が必要となります。3つの調製間で生産量を比較し、最も生産性の高い株を特定してください。そのエリスロマイシン生産量の最大株を用い、コロニー源からグリセロールストックを作成し、-80 °Cで保存してください。別途E. coli生産培養を開始し、最終上清を2倍量の酢酸エチルで抽出します。次に、抽出物をスピードバックで乾燥させ、ペレットを100 µLのメタノールで再懸濁します。その後、抽出物を滅菌フィルターディスクに移し、個別に風乾させます。B. subtilisをLB液体培地で一晩培養し、45 °Cに調整した20 mLのLB液体アガーにB. subtilis培養液を20 µL添加してプレートを作成します。次に、アガーを含むB. subtilis固体培地上にエリスロマイシンAのフィルターディスクを配置し、37 °Cでインキュベートします。この例では、S. urethra由来のエリスロマイシン遺伝子クラスターをE. coliに導入し、E. coli異種宿主からのエリスロマイシンAの生産を行います。生物活性産物は、天然のS ETH 3A染色体において解析されます。エリスロマイシン遺伝子クラスターは、発現後の合計55 KBのDNAに構成されており、細胞内前駆体ならびにポリケチド合成酵素および修飾酵素を必要とする複雑な生合成経路を経て、遺伝子導入のためのエリスロマイシンAが生成されます。まず、個々の遺伝子をPCRによって単離します。次に、エリスロマイシンAの合成に必要な遺伝子について、第一に、タンパク質の産生と活性をSDS pageおよび表現型アッセイで確認するために、各遺伝子を個別に発現ベクターにクローニングしました。第二に、最終的にパスウェイ全体をe coliへ転移させるため、これらの遺伝子をオペロンとして統合しました。一部の遺伝子の発現には、pET 28発現ベクター由来の5'リーダー配列が必要でしたが、他の遺伝子では必要ありませんでした。個々の遺伝子の発現は、まずSDS pageによって解析しました。この結果は、エリスロマイシンA耐性に関わるERME遺伝子の表現型評価を示すものです。固体培地中のエリスロマイシンAを用いて、ERMEエリスロマイシンA耐性遺伝子を持つプラスミドを保持するe coli株と、保持しない株のアッセイを行いました。ERMEの発現により、細胞の増殖が明らかに回復しています。次に、GroELシャペロン用のプラスミドおよびURI Kの追加コピーを含むプラスミドを含む、完全なエリスロマイシンA経路をe coliに導入します。これらのプラスミドをe coliに導入するためには、エレクトロポレーション法を用います。その後、最終的な菌株についてプラスミドの安定性を評価します。LCMSの結果により、エリスロマイシンの産生が確認および定量されました。重要な機能性は、B subtlest細菌のラインにおいて阻止円を形成させる、あるいはエリスロマイシンAの連続希釈においてB subtlesの培養増殖を制限させる抗菌バイオアッセイによって確認されます。このように、天然物の複雑なヘテロバイオシスに関する本ビデオデモンストレーションを通じて、完全なヘテロログス天然物を合成するために必要な個々の実験ステップを設計、実施、および分析する能力が身についたはずです。様々な前駆体および導入パスウェイの最適化のためにe coli細胞に代謝工学を適用することで、本日お話ししたエリスロマイシンや、その他の医薬的価値がある、あるいは生産が困難な化合物の産生を最大化することが可能です。

the-logic-experimental-steps-potential-heterologous-natural-product

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

体系的、大規模合成遺伝子（遺伝子遺伝子またはエピスタシス）対話画面が遺伝的冗長性と経路のクロストークを探索するために使用することができます。ここで、我々は上位性の関係を解明するとの遺伝的相互作用ネットワークを探索するために開発されeSGAと呼ばれるハイスループット定量合成遺伝子配列のスクリーニング技術を記述...

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

この5日間のプロトコルは、すべての手順、機器、およびベースの効率的な内在大腸菌ゼロからTX-TLの無細胞発現系を作成し、実行するために必要な追加ソフトウェアの概要を説明します。試薬を用いて、プロトコルは8セットアップ時間以下の反応、収集、およびプロセスデータをとる。...

実装するためのプロトコルエシェリヒア·コリに基づくTX-TLの無細胞発現系

ここでは、抗生物質活性を有する天然物の識別、（B）化合物の精製、（C）は、その生合成の最初のモデル、（D）ゲノムシーケンシング/ -miningと（（A）の詳細なプロトコルを提示しますE）生合成遺伝子クラスターの検証。...

からPolyketomycinを使用したデモンストレーション：天然物からの生合成遺伝子クラスターへストレプトミセスdiastatochromogenesTü6028

この研究は、pMGXプラスミド系を用いて、 大腸菌（Escherichia coli）における単一のプラスミドからの複数の遺伝子のT7媒介性同時発現のための方法を記載する。...

誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

ここでは、エシェリヒア大腸菌またはニコチアナ・ベンタミアナにおける生合成酵素の組み合わせ発現を通じて、ジテルペノイド代謝物を製造および精製するためのプロトコルを簡単に提示し、クロマトグラフィー製品を提供します。浄化。得られた代謝産物は、分子構造特性解析、酵素機能研究、生理活性アッセイを含む様々な研究に適しています。...

ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製のためのカスタマイズ可能なアプローチ

質量分析誘導ゲノムマイニングプロトコルが確立され、ここに記載されています。ゲノム配列情報とLC-MS/MS解析に基づき、複雑な微生物や植物抽出物からの分子の同定を容易にすることを目的としています。...

新しい天然物を発見するためのツールとしての質量分析誘導ゲノムマイニング

このプロトコルは、 ストレプトマイセスベネズエラ 細胞非転写変換(TX-TL)システムから組み換えタンパク質の高収率を合成するための強化された方法を詳述する。...

合成生物学と天然物アプリケーションのための高収量スト レプトマイス 転写翻訳ツールキット

細菌細胞間でDNAを移動するバクテリオファージの能力は、それらを細菌宿主の遺伝子操作のための効果的なツールにします。ここで紹介するのは、...

ライム病スピロヘータ・ボレリア・ブルグドルフェリのファージ媒介遺伝子操作

本プロトコルは、カチオン性ペプチドMel4およびペプチド模倣RK758の抗菌活性および細胞毒性の産生および評価方法を記述しています。化学合成、組換え発現、標準化された機能的アッセイを統合することで、ペプチドおよび小分子模倣者の生産と試験の効率的なワークフローを提供します。...

抗菌ペプチドおよびその模倣体の生産と試験

ヒートショック法による大腸菌へのプラスミドDNAの形質転換

学ぶエリスロマイシンAの異種生合成法。E. coliを宿主として遺伝子クラスターの導入と経路再構成を行い、抗菌活性を評価する手法を解説。創薬開発や天然物生産の基盤技術として応用可能です。

を経て製造複合抗生物質エリスロマイシンをフィーチャーロジック、実験の手順、および異種天然物合成の可能性

さらに動画を探す