カーボンブラックインクの血管内灌流は脳血管の信頼性の高い可視化を可能に

本手順の全体的な目的は、マウスの脳血管解剖学を再現可能な方法で研究することです。まず、後のカーボンブラックインク染色との比較のために、脳血管を有色ラテックスで染色します。次に、カーボンブラックインクを混合し、左心室からPBS-PFAおよびカーボンブラックインク混合液を用いて動物に灌流を行います。

最終ステップにおいて、脳を回収し、染色された脳血管の比較および解析のための写真を撮影します。最終的に、Image Jソフトウェアを使用して、中大脳動脈と前大脳動脈の間の吻合点を解析します。この手法の意義は、血管密度や血管新生の解析に利用できるため、脳血管疾患、特に脳卒中の治療へと広がります。

この手法は、脳の血管系に関する知見を提供できるだけでなく、心臓、肝臓、または腎臓における微小血管の可視化など、他の器官の系にも適用可能です。EPチューブ内でラテックスとカーボンブラックインクを混合した後、ウォーターバスを用いて混合液を37 °Cで温めます。23〜25ゲージの針を使用し、温めたラテックスを2 mLシリンジに採取してください。

次に、12.5 mgのパピン塩酸塩粉末を1 mLの滅菌生理食塩水に溶解し、ボルテックスミキサーで撹拌後、得られた溶液をインスリン用注射器に回収します。続いて、別の滅菌インスリン用注射器から針を折って取り外し、切り離した針を長さ20 cmのPE 10チューブの端に取り付けます。その後、パピン塩酸塩溶液が入ったインスリン用注射器の針に、このPE 10チューブを接続します。

次に、さらに2本のインスリン用シリンジに1 mLの生理食塩水を充填し、麻酔前にすべてのシリンジと滅菌済み解剖器具を手術台へ運ぶ。マウスの体重を測定し、持続麻酔を施したマウスを仰向けに配置する。四肢を固定し、左大腿静脈上の皮膚を切開する。

次に大腿静脈を確認し、PE 10チューブを装着した針先を挿入します。その後、パパイン塩酸塩溶液を、投与量 50 mg/kg（体重）とし、約 100 µL/min の速度でゆっくりと注入します。注入後、腹腔を切開し、横隔膜を貫通させます。

次に、肋骨を切断して心臓を露出し、動脈鉗子で下行胸部大動脈を遮断します。続いて、右心房を鋭的に切開して静脈血を排出させます。その後、左心室に生理食塩水を2 mL注入します。

Profil溶液または混合インク内に空気が混入していると、脳の血管領域に染まっていない箇所が生じる可能性があります。確実に成功させるため、すべてのシリンジに気泡が完全にないことを入念に確認してください。次に、充填済みシリンジの内容物を、色付きラテックスを手動で注入するために1本ずつ、18〜20秒かけてゆっくりと投与し、その後、動物を5分間放置します。

次に、動物を断頭し、皮質や血管構造を傷つけないように注意しながら頭蓋骨と髄膜を除去し、全脳を慎重に採取します。脳を 4%PFA 6〜8 mL 入りの 60 millimeter 細胞培養ディッシュに入れ、手術顕微鏡に取り付けたカメラを用いて、ディッシュの下に定規を配置します。顕微鏡の対物レンズとペトリ皿が 90 度の角度になるようにし、脳の背面および腹面を 25 x の倍率で撮影します。

元の距離を定量化するため、まずカーボンブラックインク染色手順を開始し、2本の1.5 mL EPチューブに、herts stemple farbaインク（CB one）100 µLを2分注し、pelican scribal schwartzインク（CB two）900 µLを2分注して混合します。このインク混合液を、それぞれ別の1 mLインスリン用シリンジに回収します。次に、シリンジのキャップを閉め、生理食塩水1 mLを充填した別の2本のインスリン用シリンジと共に、37 °Cのウォーターバスに入れます。

先ほど実演した方法でマウスを処置した後、わずかな圧力をかけて、カーボンブラックインク溶液を両方とも左心室に注入します。注入速度は1 mLあたり18～20秒としてください。先ほど実演した方法で脳を摘出し撮影した後、脳を4% PFAに一晩浸し、その後、浮いている脳が完全に浸るまで段階的に濃度を上げたスクロース溶液でインキュベートします。このステップを開始する前に、一過性局所脳虚血を誘発させてください。

中大脳動脈の管腔内閉塞の標準プロトコルに従い、再灌流期間の終了時に、先ほど示した通りCB oneおよびCB twoインクで血管を染色し、次いで脳全体を37 °Cの2% TTC溶液で5〜10分間染色します。梗塞体積を特定する場合、梗塞領域は白く残り、非虚血領域は赤色に染まります。脳の染色面の画像を開き、先ほど示した方法で画像を収集して、脳血管の肉眼解剖学的構造を解析します。

Image Jソフトウェアを用いると、着色ラテックスで灌流した脳の腹側表面において、血管染色の程度にばらつきが見られる場合があります。一方、CB oneおよびCB twoによる灌流では、腹側と背側の両表面にあるすべての血管が染色されます。スケールをミリメートルに設定し、前大脳動脈（ACA）と中大脳動脈（MCA）の間の吻合点をマークして、これらのすべての吻合点を結ぶ仮想線を作成します。

次に、吻合線から正中線までの距離を、脳の前極から4mmおよび6mmの部位で測定します。動物1頭につき3〜4枚の画像を解析し、平均値を算出してください。異なる動物群の間で値を比較し、脳血管解剖学的な個体差を確認します。

C 57 black six J動物において、a CAとMCAの間の吻合線は、前頭極から6 mmよりも4 mmの部位において、より正中線に近い位置に追跡することができます。一方、APO lipoprotein eノックアウトマウスでは、この点において有意な差は見られません。対照的に、血管解剖学的に分析すると、SV 1 29マウスの吻合線は、前頭極から4 mmおよび6 mmのいずれの部位においても、正中線からより離れ、かつより平行に位置しています。虚血条件下では、代謝活性のある組織を示す赤色の組織縁と、壊死組織を示す白色の組織縁を梗塞境界として特定し、脳の前頭極から4 mmおよび6 mmの部位において、正中線から梗塞境界までの距離を測定してください。

ここで説明するプロトコルは、従来のラテックスを用いたげっ歯類の大脳血管可視化における技術的な限界を克服するものです。着色ラテックスの灌流後を示す最初の画像にあるように、腹側の表面にある太い血管のみが染色され、背側の表面全体は未染色のままとなります。対照的に、CB oneとCB twoの灌流を行うことで、細い血管と太い血管の両方が均等に十分に充填されます。

染色は7日間、品質の変化なく安定して保持されます。Image Jプログラムを用いて、インク灌流により局所的な血管解剖学的構造の差異を評価した各マウス群において、A CAとMCAの吻合点から正中線までの距離を分析することが可能です。POEをノックアウトしてもC 57 black six Jマウスの脳血管の解剖学的構造に影響はありませんが、C 57 black six J系統とSV 1 29系統の間には有意な差が認められます。

齧歯類を用いた実験的な脳卒中モデルにおいて、TTC染色 isInfarction volume（梗塞体積）を可視化するために広く用いられています。また、虚血条件下ではCB oneおよびCCB two染色を適用することで、血管系の構造的変化を観察することが可能であり、TTC染色と併用した際にも高い安定性を示します。異なる脳虚血時間および再灌流時間によって誘発された虚血脳における、脳血管と梗塞体積の同時可視化について記述します。

45分または90分の虚血後、1日または5日の再灌流期間を組み合わせた条件で、a cとMCAの吻合点の解析を行ったところ、予想通り、正中線と吻合点との間の平均距離にグループ間での有意な差は見られませんでした。さらに、平均距離は非虚血動物と同等の範囲内でした。しかしながら、正中線から梗塞境界までの距離はグループ間で有意に異なっており、これは虚血再灌流障害の程度が高くなるにつれて梗塞体積が増加することを反映しています。

この手法は、マウス脳内の血管領域を探索する実験的脳卒中分野の研究者にとって、道を切り拓く可能性を秘めています。このビデオを視聴することで、ラテックスまたはカーボンブラックインクを脳に灌流させることにより、マウスの脳血管解剖学を研究する方法と、Image Jソフトウェアを用いて得られた染色脳組織を解析する方法について、十分に理解できるはずです。