昆虫の触角葉でガスクロマトグラフィー - マルチユニットレコーディング（GCMR）を使用して、嗅覚揮発性物質の同定
2013年2月24日
嗅覚は、昆虫の多くの異なった行動を媒介し、よく揮発性化合物の数十〜数百から構成される複雑な混合物である。昆虫の触角葉でマルチチャンネル録音でガスクロマトグラフィーを用いて、我々は、生物活性化合物の同定のための方法を説明します。
この手順の全体的な目標は、マルハナバチの脳内の記録を通じて、複雑な意味で生物学的に効果的な匂い物質を特定することです。これは、最初に行動効果の感覚を収集し、次に、実験用のガスクロマトグラフとマルチチャネル記録システムを準備することによって達成されます。3番目のステップは、工場葉のアンテナでの神経記録のためにマルハナバチの脳を準備し、解剖することです。
次に、アンテナローブに電極を挿入し、複雑感覚に対する神経活動とその個々の成分を解析することにより、膨らんだ揮発性物質に対する応答を測定することによって実験を行います。ガスクロマトグラフィーによって得られる生理活性な臭気物質を同定することができる。したがって、G-C-E-A-Gなどの他の技術と比較したこの技術の主な利点は、アンテナ負荷ニューロンの感度と、脳内のニューロンが特定の花の揮発性物質にどのように反応するかを特徴付ける能力です。
電気生理学的および化学的分析ステップの組み合わせは、電気生理学的調製記録技術とヘッドスペース揮発性物質の収集に必要なステップのために習得するのが難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。この手法は、マルハナバチの嗅覚処理に関する洞察を得ることができますが、蚊やキスバグなどの病気の要因や、アブラムシや蛾などの作物害虫など、他のシステムにも適用できます。この手順では、マイクロマニピュレータにタングステン線で作られた参照電極を2番目に準備しました。
マイクロマニピュレータは、コイル状ワイヤ、テデ、シリコンマルチチャネル電極などのマルチチャネル電極をプリアンプに接続し、シールドBNCテーブル上に出力を備えたガスクロマトグラフを備えています。GC検出器の出力は、ニューラル信号とGC信号の両方が同期するように、アンプおよびデータ収集システムとインターフェースされます。この例では、GC キャリア ガスはヘリウムで、DB 5 GC カラム内にあります。
GCは、温度が摂氏200度に設定されたスプリットリストインレットを使用し、火炎イオン化検出器の温度が摂氏230度に設定されています。サンプルがgcで加熱された後、カラムからの排水は、ガラスYコネクタを使用して、火炎イオン化検出器とBアンテナの間で1対1に分割されます。この例では、GCを使用して、カリフォルニア原産の高山の野花であるMimus Lewisの目の花から動的吸収によって収集された揮発性物質を送達します。
あるいは、gcを使用する代わりに、単一の揮発性化合物または化合物の混合物を空気パルスによって送達することができる。化合物が堆積した濾紙が入った別のガラスシリンジを通して撃ちます。エアパルスは、コンピュータによって制御されるソレノイド作動バルブを使用して、一定のエアストリームから迂回されます。
1ミリリットルのピペットチップの端から約1センチメートルを切り取ることから準備を始めます。マルハナバチをピペットチップの基部に置き、ヘッドだけが露出するまでチップの反対側の端に向かってゆっくりと押します。溶かしたデンタルワックスを使用して、露出した頭の周りに型を作ります。
ワックスは、頭を完全に固定するために複眼に付着する必要がありますが、必要に応じてアンテナに接触してはなりません。小さなピンを使用してアンテナを固定します。次に、マイクロメスなどの鋭利な刃を使って頭部カプセルに四角い窓のような切開をします。
アンテナのすぐ後ろ、複眼の1つに隣接して切断を開始します。目と目の間に直線を切ります。次に、頭部のカプセルが胸部に向かって湾曲するまで背側に切ります。
ヘッドカプセルの反対側の端までカットを続けます。最後に最初にカットバックして正方形を完成させます。鉗子を使用してキューティクルを取り除きます。
アンテナに隣接するキューティクルを取り除かないと、脳が露出するとすぐに電極が妨げられます。すぐに組織を昆虫食塩水と超融合させます。アンテナローブが十分に露出していることを確認してください。
次に、非常に細い鉗子のペアを慎重に使用して、アンテナローブのすぐ上にある神経周囲鞘を取り外します。鉗子で蜂の脳に穴を開けないように十分注意してください。これで、ミツバチの調製物を電気生理学的に記録する準備が整いました。
準備したミツバチを磁気ベースに固定されているクランプに取り付けることから始めます。フローコントローラー付きのリザーバーから供給される昆虫の生理食塩水と超融合させてください。次に、参照電極を反対側の脳組織に挿入します。
次に、マルチチャンネル電極をミツバチのアンテナローブに挿入します。電極が所定の位置にあるとき。録音が安定するまで30〜60分待ちます。
この間、閾値化も行うことにより、ニューロンからの細胞外スパイクに備えます。個々の録音チャンネル 録音チャンネルのノイズにより、一部のチャンネルでは手動しきい値設定が必要になる場合があります。次に、GC 実行の温度ランプが正しいことを確認します。
この例では、温度は摂氏 50 度から始まり、4 分間、1 分あたり 10 度上昇して摂氏 220 度の最終温度になるか、6 分間保持されます。記録チャネル内のユニットの波形形状が一貫していると、神経記録は安定していると見なされます。安定したら、シリンジにフローラルヘッドスペースの臭いをロードし、その臭いをgcのヘッド注入ポートに注入します。
その後、GCランが終了したらすぐに電極から記録を開始します。準備を5〜15分間休ませます。次に、別のサンプルをGCに注入するか、単一の揮発性化合物または化合物の混合物を使用して調製を刺激します。
任意の時点で自発的な活動が突然停止または変化した場合は、生理食塩水の点滴を確認し、準備を15分間休ませます。その後、アクティビティが以前のレベルに戻らない場合は、準備を破棄します。実験後、プローブを組織内に残したまま脳を固定し、脳を切除し、固定液を取り除き、脳を脱水します。
その後、記録チャネルの位置は、mimus Luciフローラルの香りから共焦点顕微鏡で特定できます。略奪している揮発性物質の総数。GCは通常、60〜70の化合物です。
Mimus Luciの香りは、主にベータミオシンやアルファピニンなどのモノテルペノイドで構成されています。残りの香りは、6つの炭素揮発性物質で構成されています。いくつかの製剤を3マイクロリットルのMimus Lewis眼抽出物で刺激した。
マルチチャネル電極によって記録された8つの神経ユニットの1つからのこの記録は、ニューロンが特定の揮発性物質に対してどれほど選択的に競合するかを示しています。この例では、dine が示されている化合物です。これが8つの神経ユニットの応答です。
アンサンブルの約半数は反応がなかった。これは、花のヘッドスペースから示唆される揮発性化合物の多様性を考えると驚くべきことですが、これは製剤間で一貫しており、他の研究によって報告されています。応答性ユニットの正規化された発火率は、匂い物質のグループに対して強い選択性があることを示しています。
矢印で強調表示された匂い物質は、最も強い反応を引き出しました。これらはデミンとトランスベータオサインです。したがって、このビデオを見た後、実験のために昆虫を準備する方法と、マルチチャンネル記録を備えたガスクロマトグラフィーを使用して実験を行う方法について十分に理解しているはずです。
そこでの目標は、複雑な花束に含まれる推定される行動的に効果的な匂い物質を特定することです。一度習得すると、この手順に従って適切に行えば、このテクニックは2〜3時間で実行できます。特定された匂い物質を使用した行動試験などの他の方法は、昆虫の行動反応を媒介する揮発性物質の有効性を完全に判断するために実行できます。
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概要
この研究は、特にマルハナバチの脳における記録を通じて、昆虫の生物学的に効果的な臭気物質を特定することに焦点を当てています。この方法は、行動に関連する香りを収集し、これらの複雑な混合物に対する神経反応を分析することを含みます。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 行動生物学
- 嗅覚研究
背景
- 昆虫は様々な行動に嗅覚的手がかりを使用します。
- 嗅覚的手がかりはしばしば揮発性化合物の複雑な混合物です。
- これらの手がかりを理解することで、昆虫の行動に関する洞察が得られます。
- ガスクロマトグラフィーは、これらの化合物を分析するための重要な技術です。
研究の目的
- 複雑な香りの中から生物学的に活性のある臭気物質を特定すること。
- 特定の花の揮発性物質に対する神経活性を測定すること。
- 昆虫が嗅覚情報をどのように処理するかについての理解を深めること。
使用された方法
- 行動に効果的な香りの収集。
- ガスクロマトグラフと多チャンネル記録システムの準備。
- 神経記録のためのマルハナバチの脳の解剖。
- 反応を測定するために触電を触角葉に挿入すること。
主な結果
- ガスクロマトグラフィーによる生物学的に活性のある臭気物質の特定。
- 触角葉ニューロンの感度の実証。
- 複雑な香りに対する神経反応の特徴付け。
- この技術を他の方法と比較し、その利点を強調すること。
結論
- この方法は昆虫の行動に影響を与える臭気物質を効果的に特定します。
- 神経記録は嗅覚処理に関する貴重な洞察を提供します。
- このアプローチは嗅覚研究のさらなる研究に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Identifying bioactive volatiles that drive insect behavior is critical for agricultural biotechnology and vector control programs. The GCMR technique enables high-sensitivity detection of behaviorally active compounds by linking chemical analysis with neural responses in the insect brain. This supports target validation and assay development for pest management and pollinator attraction strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying volatiles that elicit significant neural responses in the antennal lobe.
- Operational Value: Provides biological de-risking through functional validation of odorant activity in a disease-relevant system.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing behaviorally active compounds from inactive constituents in complex mixtures.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (bumblebee antennal lobe) for downstream screening of volatile libraries.
- Quantitative Outputs: Delivers measurable neural activity readouts that enable compound comparison and hit selection.
- Platform Reuse: Supports scalability across insect models including disease vectors and crop pests.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to identification of attractants or repellents for vector insects such as mosquitoes and kissing bugs.
- Translational Continuity: Bridges discovery through neural response confirmation to preclinical evaluation of volatile efficacy.
- Mechanistic De-risking: Clarifies how specific volatiles are processed in the olfactory center, reducing ambiguity in behavioral outcome prediction.
Pipeline & Workflow Integration
The GCMR method fits within the discovery continuum from early target identification to lead optimization, particularly for behavior-modulating compounds in agricultural and public health applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking volatile exposure to neural activation patterns in the antennal lobe.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility through synchronized GC and multi-channel neural recording.
- Analytics: Provides spike sorting and thresholding outputs that allow quantification of unit-specific responses to individual volatiles.
- Translational Research: Connects neural response data to behavioral relevance in pollination, herbivory, and disease transmission contexts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening volatile libraries across multiple insect species and ecological contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by detecting responses at the level of convergent neural processing.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized brain preparation, saline perfusion, and electrode stabilization protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by prioritizing volatiles with robust neural responses, reducing investment in inactive compounds.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of lead volatiles based on neural efficacy and behavioral correlation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect dissection, electrophysiology, and gas chromatography synchronization.
- Dependent on multi-channel electrode systems, pre-amplifiers, and data acquisition capable of simultaneous GC and neural signal capture.
- Necessitates cross-team standardization for electrode placement, thresholding, and odor delivery consistency.
- Adaptation across model systems may require adjustments in brain exposure techniques and saline composition.
- Practical limitations include preparation stability duration and susceptibility to spontaneous activity loss during prolonged experiments.
