昆虫の触角葉でガスクロマトグラフィー - マルチユニットレコーディング（GCMR）を使用して、嗅覚揮発性物質の同定

この手順の目的は、マルハナバチの脳内での記録を通じて、複雑な香気成分の中から生物学的に有効な誘引物質を特定することです。まず、行動学的に有効な香気成分を収集し、次に、実験用のガスクロマトグラフおよび多チャンネル記録システムを準備します。3番目のステップでは、触角葉における神経記録のため、マルハナバチの脳の調製および解剖を行います。

次に、電極を触角葉に挿入して実験を行い、複合的な臭気およびその個々の構成成分に対する神経活動を分析することで、揮発性物質のパフ（噴霧）に対する反応を測定します。これにより、ガスクロマトグラフィーで得られた生物学的に活性な臭気物質を特定することが可能です。したがって、G-C-E-A-Gなどの他の手法と比較した本手法の主な利点は、触角荷重ニューロンの感度が高く、脳内のニューロンが特定の花の揮発性物質にどのように反応するかを特性評価できる点にあります。

電気生理学的記録の手法およびヘッドスペース揮発性物質の採取に必要な手順があるため、電気生理学的な分析と化学的な分析を組み合わせたステップを習得することは困難であり、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。この技術は、マルハナバチの嗅覚処理に関する知見を提供できるだけでなく、蚊やサシガメなどの疾患媒介因子や、アブラムシや蛾などの農作物害虫といった他の系にも適用可能です。本手順では、マイクロマニピュレーター上にタングステン線で作製した参照電極を用意してください。

マイクロマニピュレーターは、コイル状ワイヤー、テューブ、またはシリコン製マルチチャンネル電極などのマルチチャンネル電極を備えており、遮蔽BNCテーブルに出力端子を持つガスクロマトグラフを備えたプリアンプに接続されています。GC検出器の出力は、神経信号とGC信号の両方が同期するように、アンプおよびデータ収集システムにインターフェースされています。この例では、GCのキャリアガスにはヘリウムを使用し、DB-5 GCカラムを用いています。

GCは、温度を200 °Cに設定したスプリット方式の注入口を使用し、水素炎イオン化検出器の温度は230 °Cに設定されています。GC内でサンプルが加熱された後、カラムからの流出液はガラス製Y字コネクタを用いて、水素炎イオン化検出器とBアンテナに1:1の比率で分割されます。この例では、カリフォルニア原産の高山植物であるMimus lewisiiの花から動的吸着法で採取された揮発性成分を導入するためにGCが使用されています。

あるいは、gcを使用する代わりに、単一の揮発性化合物または化合物の混合物を空気パルスによって導入することも可能です。化合物が吸着したろ紙を挿入した別のガラス製シリンジを用いて射出します。空気パルスは、コンピュータで制御されるソレノイド作動バルブを用いて、一定の気流から分流されます。

1 mLピペットチップの先端から約1 cmを切り取り、準備を開始します。マルハナバチをピペットチップの基部に置き、頭部だけが露出するまで、チップの反対側へ向かってゆっくりと押し込みます。溶かした歯科用ワックスを用いて、露出した頭部の周りに型を作ります。

頭部を完全に固定するため、ワックスを複眼に密着させます。ただし、必要に応じて触覚に接触しないようにしてください。小さなピンを使用して触覚を固定します。次に、マイクロスカルペルなどの鋭利な刃を用いて、頭 capsule に正方形の窓状の切開を加えます。

触覚の直後かつ複眼のいずれかに隣接した部位から切開を開始します。両眼の間を直線的に切開します。次に、頭部カプセルが胸部へと湾曲するまで、背側に向かって切開します。

頭部カプセルの反対端まで切断を続けます。最後に、開始点まで切り戻し、正方形に切り出します。ピンセットを使用して、クチクラを除去します。

触覚に隣接する角質層を除去する必要があります。そうしないと、脳が露出した直後に電極の妨げになります。直ちに組織に昆虫用生理食塩水を灌流させてください。触角葉が十分に露出していることを確認してください。

次に、非常に精細なピンセットを使用して、触角葉の直上にある神経周囲鞘を慎重に除去します。ピンセットで蜂の脳を突き刺さないよう十分に注意してください。これで、蜂の標本が電気生理学的記録に供的に準備されました。

まず、準備したミツバチを磁気ベースに固定したクランプに取り付けます。フローコントローラーを備えたリザーバーから昆虫用生理食塩水を供給し、十分な灌流を維持してください。次に、対側脳組織に参照電極を刺入します。

次に、マルチチャンネル電極をミツバチの触角葉に挿入します。電極を配置した後、記録が安定するまで30分から60分間待ちます。

この間に、閾値処理を行うことでニューロンからの細胞外スパイクを準備します。記録チャンネルにノイズがある場合、一部のチャンネルでは個別に手動での閾値設定が必要になることがあります。次に、GCランの温度ランプが正しいことを確認してください。

この例では、温度を50 °Cで4分間保持した後、1分あたり10 °Cの割合で上昇させ、最終温度220 °Cに到達させるか、またはその温度で6分間保持します。記録チャンネル内のユニットの波形が一定になった時点で、神経記録が安定したとみなされます。安定後、シリンジに花のヘッドスペース香気を充填し、gcのヘッド注入ポートに香気を注入します。

その後、GCのランが終了したら直ちに電極からの記録を開始します。準備した試料を5分から15分間静置させます。次に、別のサンプルをGCに注入するか、単一の揮発性化合物または化合物の混合物を用いて試料を刺激します。

自発活動がいきなり停止または変化した場合は、生理食塩水の滴下状態を確認し、標本を15分間静置してください。その後、活動が以前の水準に回復しない場合は、その標本を廃棄してください。実験後、プローブを組織に挿入したまま脳を固定し、その後、脳を取り出して固定液を除去し、脱水処理を行います。

記録チャネルの位置は、共焦点顕微鏡を用いてmimus Luciの花の香気から特定できます。揮発性物質の総数は、GCで通常60から70種類の化合物が検出されます。

Mimus Luciの香りは、主にbeta myosinおよびalpha pinineを含むモノテルペノイドで構成されています。香りの残りの成分は、6炭素揮発性物質で構成されています。いくつかの調製物を、3 µLのMimus Lewis eye抽出液で刺激しました。

マルチチャネル電極で記録された8つの神経ユニットのうちの1つの記録は、ニューロンがいかに特定の揮発性物質に対して選択的に反応するかを示しています。この例では、その化合物としてジネ（dine）を示しています。ここでは、8つの神経ユニットの応答を示します。

アンサンブルの約半分は反応を示しませんでした。花のヘッドスペースから放出される揮発性化合物の多様性を考慮するとこれは意外な結果ですが、調製間で一貫しており、他の研究でも報告されています。反応したユニットの正規化発火率は、特定の匂い物質のグループに対して強い選択性があることを示しています。

矢印で強調された匂い物質が、最も強力な反応を引き出しました。これらはdemineとtrans beta osainです。このビデオを視聴したことで、実験に向けた昆虫の準備方法と、マルチチャンネル記録を伴うガスクロマトグラフィーを用いた実験の実施方法について、十分に理解できたはずです。

したがって、目的は複雑なブーケの中から行動に効果があると考えられる推定臭気物質を特定することです。この手法を習得し、本手順に従って適切に実施すれば、2〜3時間で完了させることができます。特定された臭気物質を用いた行動試験などの他の手法を行うことで、昆虫の行動反応を媒介させる揮発性物質の有効性を完全に決定することが可能です。