Name: 昆虫の触角葉でガスクロマトグラフィー - マルチユニットレコーディング（GCMR）を使用して、嗅覚揮発性物質の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶガスクロマトグラフィーとマルチユニットレコーディングを用いた昆虫触角葉での神経記録法。複雑な花の香りから生物学的に活性な臭気物質を同定し、ミツバチの嗅覚情報処理メカニズムを解明する手法です。

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この作品は、NSFの助成IOSの1121692で、ワシントンの研究財団の大学によってサポートされていました。

1。揮発性Follection <ol><li>この例では、Mから揮発性のサンプルを使用するlewisii花-カリフォルニア州に高山野草ネイティブ。揮発性物質をRiffell らに従って動的吸着法を用いて収集されます14。簡単に説明すると、このメソッドは花がテフロン袋に囲まれている閉ループ捕捉システムを採用しています。不活性の真空ポンプを使用して、花の周りの空気がPorapak Q行列でいっぱいパスツールピペットからなる &quot;トラップ&quot;を介して吸引される。ポンプからの戻り空気は活性炭によってフィルタリングされます。所定時間後、私たちの場合24時間で、Porapak Q行列は、濃縮された抽出物を収集するために、非極性溶媒、典型的にはヘキサンで溶出させる。抽出液を-80℃·分析まで保存されます。必要であれば、サンプルが窒素ガス気流下で、分析の前に濃縮することができる。サンプルは、既に十分に特徴付けられていない限り、それを介してのアリコートを実行サンプルを使用する前に、揮発性成分を識別するために、ガスクロマトグラフ質量分析計（GC-MS）。 </li></ol> 2。電気生理学的準備<ol><li>千μlのピペットチップの先端から約1cmを切った。ピペットチップのベースにマルハナバチ（ マルハナバチインパチェンス ） を配置し、頭だけが露出するまでそっと先端の反対側の端に向かって押します。 </li><li>歯科用ワックスを溶かすとセキュリティのための複眼の上にワックスが付着していることを確認して、露出した頭部のまわりでそれを成形し、完全に不動ハチの頭を作るために。ハチのアンテナの上に任意のワックスを取得しないようにしてください。 </li><li>ヘッドが固定されたら、カミソリの刃ブレーカまたはキューティクルをカットするメス適切なサイズを使用し、頭部カプセルに角、窓状、切り込みを入れる。ブレードブレーカを使用して、直ちにアンテナと複眼の1つに隣接後ろ、頭部カプセルの背側から開始します。カット1複眼から反対側の複眼に直線。反対複眼に直線をカットした後、その胸部に近い頭部カプセルカーブと終了するまで背側切開を作り始める。この時点で、頭部カプセルの反対側の端に向かってカットし始める。最後に、一度ラインが反対側の端にカットされており、初期の切開の開始位置に戻ってラインをカット。これは電極の挿入が妨げになるとして、それは、アンテナに隣接しているキューティクルを除去することが重要である。 </li><li>キューティクルがカットされたら、その後蜂の脳と、もっと重要なのは、触角葉を公開する必要があります蜂のキューティクルを除去するためにピンセットを使用しています。直ちに脳がdessicatedにならないように、昆虫生理食塩水で脳をsuperfusing始める。脳が露出した後、慎重に直ちに触角ローブの上に神経周囲シースを除去するために、非常に微細なピンセットを使用しています。非常に慎重にされないように鉗子で穿刺蜂の脳を。 </li></ol> 3。マルチチャンネル録音付きガスクロマトグラフィ<ol><li>蜂 &quot;準備&quot; - その脳が露出してチューブ内に固定 - 今電気生理学的記録の準備ができています。エアテーブル上に配置された磁気ベースに固定し、クランプで蜂を置きます。 </li><li>生理食塩水が継続的に脳をsuperfusesように、IVバッグ、フローコントローラ、チューブ（昆虫生理食塩水で満たされた）に配置します。 </li><li>蜂の目に、タングステン線で作られたマイクロマニピュレータ、insertareference電極を使用。 </li><li>独立したマイクロマニピュレータを使用して、このようなコイル状のワイヤーテトロード、またはシリコンマルチチャネル電極（Neuronexusテクノロジーズ）として、多チャンネル電極を挿入 ハチの触角葉に。この電極は、TDT系のZバスbioampプロセッサへのTDTのシステムのS-3のZシリーズのように、前置増幅器に接続されています。ガスクロマトからの出力シールドBNCケーブルを経由してクロマトグラムの検出器は、神経とGC信号の両方が同期されているアンプやデータ·アクイジション·システムと接続することができます。 </li><li>安定させるための神経録音の約30〜60分待ちます。自発的な活動と記録チャネルの単位の波形の形状が一貫になったら、蜂を刺激し、臭気に録音チャンネルの応答を観察するために臭気のシリンジを使用しています。 </li><li>個々の記録チャンネル上の信号の3.5から5シグマによる自動しきい値記録チャネルによってニューロンから細胞外スパイクを記録します。マニュアルしきい値処理は、電気的ノイズからの汚染を避けるために、いくつかのチャネルが必要な場合があります。ニューロンからの活動電位は記録チャネルの電圧スパイクとして表示されます。チャネルの電圧がしきい値を超えると、システムはそれによってターキン、しきい値への到達前と後数ミリ秒をバッファし、保存しますgaは波形のスナップショット、またはスパイク。 </li><li>直ちに空気テーブルの隣には、GCです。 GCに花のエキスを注入する前に、GC分析の温度上昇のための方法が正しいことを確認します。私たちの例では、10℃/分の速度で温度上昇が続く4分間50から始まる温度法°Cを使用します。 220℃我々は追加の6分のGCを保持し、その時点で、C。我々は、キャリアガスとしてヘリウムを、DB-5のGCカラム（J＆Wサイエンティフィック、フォルサム、カリフォルニア州、米国）を使用します。入口は、200℃に設定した温度と、スプリットレスです水素炎イオン化検出器の温度を230℃に設定されている</li><li> GCカラムに吸着した揮発性物質を解放するために、GCの加熱された注入口に花のヘッドスペースの抽出サンプルを注入します。カラムからの流出液は水素炎イオン化検出器（FID）とガラスの &quot;Y&quot;コネクター（J＆W Scientific）を用いたミツバチアンテナとの間に1:1に分割されます。 RECを開始は、GCにサンプルを注入するように電極からディング。 </li><li> GCの実行が終了した後、5〜15分間準備休止してください。次に、いずれかGCに別のサンプルを注入したり、単一の揮発性化合物又は化合物の混合物を使用して準備を刺激する。準備を刺激するこの後者の方法では、一定の空気の流れから空気のパルスは、化合物が堆積されている上に濾紙を入れたガラスシリンジを介して転送されます。匂い刺激は、ソフトウェアによって制御ソレノイド活性化バルブによってパルスした。 </li><li>ユニット活動が突然停止し、または変更された場合は、生理的食塩水の点滴をチェックして、15分間の準備休止してください。自発的な活動はその前のレベルを回復しない場合は可能であればその後の準備は破棄され、別の蜂が使用されるべきである。 </li><li>実験後、まだ組織内プローブを用いた20分間5％ホルマリンで脳を固定します。次に、消費税の脳そして4時間2％グルタルアルデヒドに置き、その後、段階的なエタノール脱水系列を行うとサリチル酸メチルと脳をクリアします。固定に基づいており、組織のクリア、電極が組織を穿刺アラバマ州の場所は、共焦点顕微鏡によって明確に識別する必要があります。 </li></ol> 4。データ解析<ol><li>記録された神経単位を分離し、同定するための実験の後に収集されたデータを分析します。このようなピークまたは谷振幅、ピーク半値幅などのスパイク形状、または減圧措置に基づいて別々の波形、または&quot;スパイク&quot;（主成分）17に代表的なソフトウェアプログラムを（オフラインソーター、MClust、そしてSClust）を使用し、18（ 図2）。三次元空間で分離された（PC1〜PC3）と、互いに統計的に異なっているスパイクのだけそれらのクラスタを使用して（多変量ANOVA、P &lt;0.05）（ 図2）、さらなる分析のため。を参照してくださいテトロード記録とスパイクソーティング方法論の完全な説明については、引用＃S 17から19。 </li><li>各クラスタ内のタイム·スタンプスパイク、ラスタープロットと発火率応答（ 図2、図3（a））を作成するためのMATLABまたはNeuroexplorer（NEXテクノロジーズウィンストンセーラム、ノースカロライナ州）を用いて、分析のためにこれらのデータをエクスポートします。 </li><li>同時に記録GCデータを用いて揮発性成分の保持時間を特定します。それらの時点でユニットの応答を調べるために、クロマトグラムからピークの頂点によって決定揮発性物質の保持時間を使用します。 </li><li> GC分析を介して個々のユニットの応答を調べるために、100ミリ秒間隔でスパイクの数をbinおよび揮発性物質を溶出する保持時間を参照して、速度応答を焼成の時間経過を調べる。 100ミリ秒間隔でスパイクのビニングは、GCから溶出​​する匂い物質への神経応答の時間経過について、十分な詳細、または信号を提供します。 </li><li> EXAに異なる溶出揮発性物質への人口応答を採掘、前、3秒のサンプリング·ウィンドウの上に1.5秒を個々のユニットの発火率応答を統合し、1.5秒後の保持時間揮発性（ 図3）。この期間は、GCから揮発性溶出の期間の典型です。我々は、色分けして（赤が高発射レート応答であり、青は低い応答です）によってユニットの速度応答を発射示し、（列）のGC排水にアンサンブル応答を表す各行が活性マトリックスとして、それらを配置する（ 図3）。 </li></ol>

<ol><li>Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+olfactory%3A+converging+evidence+for+common+principles+across+phyla%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla.</a> Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).</li>
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<li>Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Year-to-year+variation+in+the+topology+of+a+plant-pollinator+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network.</a> Oikos. 117, 1796-1807 (2008).</li>
<li>Riffell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+consequences+of+innate+preferences+and+olfactory+learning+in+hawkmoth-flower+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions.</a> P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).</li>
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<li>Turner, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-prolonged+activation+of+CO2-sensing+neurons+disorients+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes.</a> Nature. 474, 87-91 (2011).</li>
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<li>Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+attractant+of+the+codling+moth%3A+characterization+with+electroantennogram+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique.</a> Science. 174, 297-299 (1971).</li>
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<li>Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+behavior+in+the+moth+Manduca+sexta+in+response+to+complex+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).</li>
<li>Raguso, R. A., Pellmyr, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+headspace+analysis+of+floral+volatiles%3A+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods.</a> Oikos. 81, 238-254 (1998).</li>
<li>Rodriguez-Saona, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivore-induced+blueberry+volatiles+and+intra-plant+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling.</a> J Vis Exp. , e3440(2011).</li>
<li>Nguyen, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+array+for+chronic+in+vivo+recording%3A+tetrode+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly.</a> J Vis Exp. , e1098(2009).</li>
<li>Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+large-scale+neuronal+ensembles+with+silicon+probes+in+the+anesthetized+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat.</a> J Vis Exp. , e3282(2011).</li>
<li>Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+representation+of+olfactory+mixtures+in+the+honeybee+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe.</a> European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).</li>
<li>Stökl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deceptive+pollination+system+targeting+drosophilids+through+olfactory+mimicry+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast.</a> Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).</li>
<li>Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elektrophysiologische+untersuchungen+von+chemo-+und+mechanorezeptoren+der+antenne+des+seidenspinners+Bombyx+mori+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%3A+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L.</a> Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).</li>
<li>Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroantennographic+detector%3A+a+selective+and+senstitive+tool+in+the+gas+chromatographic+analysis+of+insect+pheromones%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones.</a> Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).</li>
<li>Schneider, D., Boeckh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rezeptorpotential+und+nervenimpulse+einzelner+olfaktorischer+sensillen+der+insektenantenne%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%3A+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne.</a> Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).</li>
<li>Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennal+perception+of+oilseed+rape+Brassica+napus+%28Brassicaceae%29+volatiles+by+the+cabbage+seed+weevil+Ceutorhynchus+assimilis+%28Coleoptera%2C+Curculionidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).</li>
<li>Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+of+natural+stimuli+in+the+rodent+main+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb.</a> Neuron. 50, 937-949 (2006).</li>
<li>Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+patterns+and+their+functional+implications+in+the+antennal+lobe+of+the+tobacco+hornworm+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta.</a> PLoS ONE. 6, e23382(2011).</li>
<li>Syed, Z., Leal, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+olfactory+response+of+Culex+mosquitoes+to+a+human-+and+bird-derived+attractant%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

昆虫嗅覚媒介行動は、再生、ホストサイトの選択、適切な食糧資源の識別を含む多くの異なるプロセスを駆動する。これらのプロセスの研究では、光源から出射された揮発性物質と同様に、行動を媒介されるそれらの化合物を同定するための能力を識別する能力を必要とします。ややこしいことは臭いが一緒に個々の成分6,7,13,19,20とは異なる知覚される独特の香りを作成し、個々の化合物の数十〜数百から構成されているということです。最初は性フェロモンシステム12で、さらに最近では食品と産卵関連の匂い13,20で行われた研究では、混合物の行動の有効性は、混合物中のいくつかは、キーの揮発性物質の関数として存在し、ことが示されている混合物は、個々の成分よりも有意に大きい行動反応を引き出すこと。それらのキーを識別する成分は、このように現代の化学生態学ならびに嗅覚神経生物学の重要なコンポーネントです。 様々な技術は、昆虫の行動を駆動することを生物活性化合物の同定のための最後の50年の間に生じている。昆虫アンテナによる揮発性物質の検出のための主要な技術は...

<table border="1"><tbody><tr><td> アイテムの名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> PorapakタイプQ 80から100メッシュ</td><td>ウォーターズ</td><td> WAT027060 </td><td></td></tr><tr><td>レイノルズ·オーブンバッグ</td><td>レイノルズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> GC </td><td>アジレント</td><td> 7820A </td><td></td></tr><tr><td> GCカラム</td><td> J＆Wサイエンティフィック、フォルサム、カリフォルニア州、米国</td><td> DB-5（30メートル、0.25ミリメートル、0.25μm）を</td><td></td></tr><tr><td>分析ヘリウムキャリアガス</td><td> Praxair社</td><td> HE K </td><td> 1 cc /分</td></tr><tr><td> 16チャネルシリコン電極</td><td> Neuronexus Technologies </td><td> a4x4-3mm50-177 </td><td></td></tr><tr><td>細線たNiCr、0.012ミリメートルの直径） </td><td>サンドビックカンタルのHPリード</td><td> PX000004 </td><td>カスタム極管とstereotrodesを作るための</td></tr><tr><td>前置増幅器</td><td>タッカー·デイビスシステム</td><td> PZ-2 </td><td></td></tr><tr><td>アンプ</td><td>タッカー·デイビスシステム</td><td> RZ-2 </td><td></td></tr><tr><td>データ取得システム - OpenExのスイート</td><td>タッカー·デイビスシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オンラインスパイクソーティングソフトウェア - SpikePac </td><td>タッカー·デイビスシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オフラインスパイクソーティングソフトウェア - Mclustスパイクソーティングツールボックス</td><td>デビッドRedish、神経科学、大学の学科ミネソタ州の</td><td>無料でダウンロードできます<a href="http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html" target="_blank">http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html</a> </td><td> MATLABのツールボックス</td></tr></tbody></table>

昆虫の触角葉でガスクロマトグラフィー - マルチユニットレコーディング（gcmr）を使用して、嗅覚揮発性物質の同定

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

すべての生物は、その環境への彼らの行動や生理的な応答を決定する感覚刺激に満ちた世界に生息しています。嗅覚はに反応し、間で、複雑な香りの刺激を区別するために彼らの嗅覚システムを使用して昆虫、特に重要である。これらの臭気はこのような再生や生息地の選択1月3日のようなプロセスを仲介する行動を誘発する。食用作物の受粉4-6、草食7、病気8,9の伝送を含む、農業と人間の健康のために非常に重要である昆虫を媒介行動によってさらに、化学センシング。嗅覚信号と昆虫行動における役割の同定は、生態学的なプロセスおよびヒューマン·食糧資源と幸福の両方を理解するためにこのように重要です。 現在までに、昆虫行動を駆動揮発性物質の同定は困難で、しばしば退屈であった。現在の技術には、ガスクロマトグラフィー結合electroantennogram記録（GC-EAG）、およびガスクロマトグラフィー-結合されたシングル感覚子の録音（GC-SSR）10-12。これらの技術は、生物活性化合物の同定に不可欠であることが判明した。 13,14、我々は、触角葉のニューロン（昆虫の主嗅覚中枢AL）からマルチチャンネルの電気生理学的記録（ &#39;GCMR &quot;と呼ばれる）に結合し、ガスクロマトグラフィーを用いた方法を開発しました。この最先端の技術は、私たちは匂いの情報は昆虫脳の中でどのように表現されるかを調べることが可能になります。嗅覚処理のこのレベルの匂いに対する神経反応がALニューロンへのアンテナの受容ニューロンの収束の度合いに非常に敏感なせいであるので、さらに、ALの録音は自然な臭気の活性成分の検出を効率的かつ高感度にできるようになります。ここでは、GCMRを説明し、その使用例を与える。 いくつかの一般的な手順はinvolアール生理揮発性物質と昆虫応答の検出にVED。揮発性物質は、最初に興味のある情報源から収集します（この例では、我々は属Mimulus（Phyrmaceae）から花を使用）および標準のGC-MS技術を14-16を使用して、必要に応じて特徴づけする必要があります。昆虫は記録電極が神経録音が始まる触角葉およびマルチチャネルに挿入された後、最小限の切開を用いた研究のために準備されます。神経データの後処理はその後、特定の匂い物質は、昆虫の神経系で重要な神経反応を起こしているか明らかにする。 ここでお見せする例では、受粉の研究に固有のものですが、GCMRは試験生物と揮発性ソースの広い範囲に拡大することができます。たとえば、このメソッドは媒介昆虫と作物の害虫を集めたり反発臭気物質の識別に使用することができます。また、GCMRはまた、POと益虫に対して誘引を識別するために使用することができますllinators。技術は同様に非昆虫被験者に拡張される可能性があります。

Mを使用GCMRアッセイでlewisiiフローラルの香りは、GCに抽出物の3μlを注入します。 GCを介して溶出する揮発性物質の総数は、一般的に60から70揮発性物質である。 Mの香りlewisiiは、主に 6 -炭素例えば、2 -ヘキサノールなどの揮発性物質、およびヘッドスペースの&lt;1％を含むセスキテルから成る香りの残りの部分とは、β-ミルセン（非環式）およびα-ピネンなど、モノテルペノイドで構成されています。 GCMRは触角葉ニューロンの感度だけでなく、生物学的に重要な揮発性物質の神経処理を利用しています。しかし、このような性質のマルチチャンネル録音は、実質的には、触角葉の神経細胞のランダムなサンプルを取る。異なる製剤間のプローブ位置の位置のわずかな変化が異なるニューロンをサンプリングするために記録配列を引き起こす可能性があるためです。また、正確な位置とMo記録は、細胞外であるため、記録されたニューロンのrphologiesは不明である。これら...

嗅覚は、昆虫の多くの異なった行動を媒介し、よく揮発性化合物の数十〜数百から構成される複雑な混合物である。昆虫の触角葉でマルチチャンネル録音でガスクロマトグラフィーを用いて、我々は、生物活性化合物の同定のための方法を説明します。

昆虫の触角葉でガスクロマトグラフィー - マルチユニットレコーディング（GCMR）を使用して、嗅覚揮発性物質の同定

すべての生物は、環境に対する行動的および生理的な反応を決定する感覚刺激に満ちた世界に生息しています。嗅覚は...

この手順の目的は、マルハナバチの脳内での記録を通じて、複雑な香気成分の中から生物学的に有効な誘引物質を特定することです。まず、行動学的に有効な香気成分を収集し、次に、実験用のガスクロマトグラフおよび多チャンネル記録システムを準備します。3番目のステップでは、触角葉における神経記録のため、マルハナバチの脳の調製および解剖を行います。次に、電極を触角葉に挿入して実験を行い、複合的な臭気およびその個々の構成成分に対する神経活動を分析することで、揮発性物質のパフ（噴霧）に対する反応を測定します。これにより、ガスクロマトグラフィーで得られた生物学的に活性な臭気物質を特定することが可能です。したがって、G-C-E-A-Gなどの他の手法と比較した本手法の主な利点は、触角荷重ニューロンの感度が高く、脳内のニューロンが特定の花の揮発性物質にどのように反応するかを特性評価できる点にあります。電気生理学的記録の手法およびヘッドスペース揮発性物質の採取に必要な手順があるため、電気生理学的な分析と化学的な分析を組み合わせたステップを習得することは困難であり、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。この技術は、マルハナバチの嗅覚処理に関する知見を提供できるだけでなく、蚊やサシガメなどの疾患媒介因子や、アブラムシや蛾などの農作物害虫といった他の系にも適用可能です。本手順では、マイクロマニピュレーター上にタングステン線で作製した参照電極を用意してください。マイクロマニピュレーターは、コイル状ワイヤー、テューブ、またはシリコン製マルチチャンネル電極などのマルチチャンネル電極を備えており、遮蔽BNCテーブルに出力端子を持つガスクロマトグラフを備えたプリアンプに接続されています。GC検出器の出力は、神経信号とGC信号の両方が同期するように、アンプおよびデータ収集システムにインターフェースされています。この例では、GCのキャリアガスにはヘリウムを使用し、DB-5 GCカラムを用いています。GCは、温度を200 °Cに設定したスプリット方式の注入口を使用し、水素炎イオン化検出器の温度は230 °Cに設定されています。GC内でサンプルが加熱された後、カラムからの流出液はガラス製Y字コネクタを用いて、水素炎イオン化検出器とBアンテナに1:1の比率で分割されます。この例では、カリフォルニア原産の高山植物であるMimus lewisiiの花から動的吸着法で採取された揮発性成分を導入するためにGCが使用されています。あるいは、gcを使用する代わりに、単一の揮発性化合物または化合物の混合物を空気パルスによって導入することも可能です。化合物が吸着したろ紙を挿入した別のガラス製シリンジを用いて射出します。空気パルスは、コンピュータで制御されるソレノイド作動バルブを用いて、一定の気流から分流されます。1 mLピペットチップの先端から約1 cmを切り取り、準備を開始します。マルハナバチをピペットチップの基部に置き、頭部だけが露出するまで、チップの反対側へ向かってゆっくりと押し込みます。溶かした歯科用ワックスを用いて、露出した頭部の周りに型を作ります。頭部を完全に固定するため、ワックスを複眼に密着させます。ただし、必要に応じて触覚に接触しないようにしてください。小さなピンを使用して触覚を固定します。次に、マイクロスカルペルなどの鋭利な刃を用いて、頭 capsule に正方形の窓状の切開を加えます。触覚の直後かつ複眼のいずれかに隣接した部位から切開を開始します。両眼の間を直線的に切開します。次に、頭部カプセルが胸部へと湾曲するまで、背側に向かって切開します。頭部カプセルの反対端まで切断を続けます。最後に、開始点まで切り戻し、正方形に切り出します。ピンセットを使用して、クチクラを除去します。触覚に隣接する角質層を除去する必要があります。そうしないと、脳が露出した直後に電極の妨げになります。直ちに組織に昆虫用生理食塩水を灌流させてください。触角葉が十分に露出していることを確認してください。次に、非常に精細なピンセットを使用して、触角葉の直上にある神経周囲鞘を慎重に除去します。ピンセットで蜂の脳を突き刺さないよう十分に注意してください。これで、蜂の標本が電気生理学的記録に供的に準備されました。まず、準備したミツバチを磁気ベースに固定したクランプに取り付けます。フローコントローラーを備えたリザーバーから昆虫用生理食塩水を供給し、十分な灌流を維持してください。次に、対側脳組織に参照電極を刺入します。次に、マルチチャンネル電極をミツバチの触角葉に挿入します。電極を配置した後、記録が安定するまで30分から60分間待ちます。この間に、閾値処理を行うことでニューロンからの細胞外スパイクを準備します。記録チャンネルにノイズがある場合、一部のチャンネルでは個別に手動での閾値設定が必要になることがあります。次に、GCランの温度ランプが正しいことを確認してください。この例では、温度を50 °Cで4分間保持した後、1分あたり10 °Cの割合で上昇させ、最終温度220 °Cに到達させるか、またはその温度で6分間保持します。記録チャンネル内のユニットの波形が一定になった時点で、神経記録が安定したとみなされます。安定後、シリンジに花のヘッドスペース香気を充填し、gcのヘッド注入ポートに香気を注入します。その後、GCのランが終了したら直ちに電極からの記録を開始します。準備した試料を5分から15分間静置させます。次に、別のサンプルをGCに注入するか、単一の揮発性化合物または化合物の混合物を用いて試料を刺激します。自発活動がいきなり停止または変化した場合は、生理食塩水の滴下状態を確認し、標本を15分間静置してください。その後、活動が以前の水準に回復しない場合は、その標本を廃棄してください。実験後、プローブを組織に挿入したまま脳を固定し、その後、脳を取り出して固定液を除去し、脱水処理を行います。記録チャネルの位置は、共焦点顕微鏡を用いてmimus Luciの花の香気から特定できます。揮発性物質の総数は、GCで通常60から70種類の化合物が検出されます。Mimus Luciの香りは、主にbeta myosinおよびalpha pinineを含むモノテルペノイドで構成されています。香りの残りの成分は、6炭素揮発性物質で構成されています。いくつかの調製物を、3 µLのMimus Lewis eye抽出液で刺激しました。マルチチャネル電極で記録された8つの神経ユニットのうちの1つの記録は、ニューロンがいかに特定の揮発性物質に対して選択的に反応するかを示しています。この例では、その化合物としてジネ（dine）を示しています。ここでは、8つの神経ユニットの応答を示します。アンサンブルの約半分は反応を示しませんでした。花のヘッドスペースから放出される揮発性化合物の多様性を考慮するとこれは意外な結果ですが、調製間で一貫しており、他の研究でも報告されています。反応したユニットの正規化発火率は、特定の匂い物質のグループに対して強い選択性があることを示しています。矢印で強調された匂い物質が、最も強力な反応を引き出しました。これらはdemineとtrans beta osainです。このビデオを視聴したことで、実験に向けた昆虫の準備方法と、マルチチャンネル記録を伴うガスクロマトグラフィーを用いた実験の実施方法について、十分に理解できたはずです。したがって、目的は複雑なブーケの中から行動に効果があると考えられる推定臭気物質を特定することです。この手法を習得し、本手順に従って適切に実施すれば、2〜3時間で完了させることができます。特定された臭気物質を用いた行動試験などの他の手法を行うことで、昆虫の行動反応を媒介させる揮発性物質の有効性を完全に決定することが可能です。

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学ぶガスクロマトグラフィーとマルチユニットレコーディングを用いた昆虫触角葉での神経記録法。複雑な花の香りから生物学的に活性な臭気物質を同定し、ミツバチの嗅覚情報処理メカニズムを解明する手法です。

昆虫の触角葉でガスクロマトグラフィー - マルチユニットレコーディング（GCMR）を使用して、嗅覚揮発性物質の同定

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