発現クローニングによりGrb2のシグナル伝達複合体を研究するために高コンテンツイメージングワークフロー

本実験の全体的な目的は、cDNA発現クローニングおよび緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きGrab twoの変動観察により、Grab twoの相互作用パートナーを同定することです。これは、まず第2ステップとして細菌溶解物からcDNAライブラリーを調製することで達成されます。これらのcDNAをヒト胚性腎細胞にトランスフェクションすることで、目的遺伝子とともにレポーター構築物が発現します。

次に、細胞全体におけるGrab2の局在の変化を可視化するため、トランスフェクションしたプレートをOpera顕微鏡で解析します。蛍光顕微鏡観察に基づき、上皮成長因子受容体（EGFR）を介してGFPタグ付きGrab2がエンドソームにリクルートされるという結果が得られます。酵母ツーハイブリッド法などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、相互作用パートナーの細胞内分布を考慮した生理的な状況下で、Grab2の相互作用パートナーを同定できることです。

この手法はGrab 2によるシグナル伝達の同定に使用できますが、他の目的タンパク質などの他の系にも適用可能です。cDNAライブラリーは、グリセロールストック保存された単一の細菌クローンとして提供されます。

Hudson Rapid pick lightのピッカーメニューにあるre rayコマンドを使用し、96ウェル形式で操作を行います。ソースプレートから細菌クローンをピックアップし、96ディープウェルプレート内の1.5 milliliters lb ampに接種します。ディープウェルプレートをガス透過性シールで密封し、シェーカーを用いて37 degrees Celsiusで一晩インキュベートします。翌日、細菌を含むディープウェルプレートを2000 RPMで20分間遠心分離します。

卓上遠心分離機にプレートアダプターを使用し、細菌ペレットをそのまま残してウェルから培地を吸引します。次に、Tecan Freedom Evo Automationワークステーションのデッキをここに示すように構成します。プラスミド調製用の溶液をトラフ1〜5に分配し、デッキにディープウェルプレートを配置します。

アルキアン溶液を満たしたマルチウェルtroughをディープウェルプレートの隣に配置し、チップラックにチップを装着します。真空マニホールドを組み立てます。プラスミド結合プレートをマニホールド内部に配置し、プラスミドフィルタープレートをマニホールドの上に配置します。250 µLの溶液1を用いてペレットを再懸濁します。

ピペッティングによりResus懸濁バッファーを混ぜ合わせます。ペレットが完全に再懸濁されていることを確認することが、本手順を成功させるための重要なポイントです。ピペッティングでペレットを完全に再懸濁できない場合は、シェーカーを使用してください。

ペレットが完全に再懸濁されたら、250 µLの溶解バッファーを加えて細菌を溶解させます。プレートを密閉し、反転させて完全に混合させます。タイマーを2分間に設定します。

次に、溶液3（中和バッファー）を350 µL加えます。プレートを密閉し、3回反転させて混ぜ合わせます。

細菌溶解物をプラスミドフィルタープレートに転移させます。5分間真空吸引を行います。フィルタープレートを取り外し、バインディングプレートをマニホールドの上に設置します。

1分間真空吸引を行います。さらに500 µLの洗浄バッファーを加え、2分間真空吸引を行います。900 µLの洗浄バッファー溶液4を加え、2分間真空吸引を行います。

その後、洗浄バッファー溶液4を再び900 µL加え、15分間真空吸引を行います。DNA回収プレートをマニホールドにセットします。結合プレートに100 µLの溶出バッファーを加え、2分間インキュベートします。

10分間真空吸引を行います。最後に、回収プレートを取り出し、NanoDrop 8,000を用いてDNA濃度を測定します。通常、本手順を開始するために本手法で得られる収量は、1 µLあたり約100 ngと期待されます。

hec 2 9 3 細胞をトリプシン処理して単一細胞にし、計数します。自動ディスペンサーを用いて、Perkin Elmer の View plate の各ウェルに 2×10⁴ cells ずつ分注します。細胞を 37 °C、5% CO2 条件下で一晩インキュベートし、トランスフェクションに備えます。

自動液体ハンドラーを使用して、ラウンドボトム96ウェルプレートの各ウェルに以下の混合液を調製します。100 ngのGFPプラスミドDNAと100 ngのCD NAを、25 µLの無血清培地で混合します。次に、0.5 µLのトランスフェクチンを含む無血清培地25 µLを各ウェルに添加し、30分間のタイマーを開始します。

30分後、CDNAトランスフェクションミックス50 µLを、穏やかに分注する方法で細胞に添加します。細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。

画像取得を開始するには、Operaソフトウェアを起動します。構成タブを選択し、20倍対物レンズと適切なプレートタイプを選択してください。異なるプレートタイプでフォーカスを合わせられるよう、対物レンズのカラーリングが正しい値に設定されていることを確認してください。

次に、顕微鏡タブを選択します。露光1をfite 4 88レーザー、露光2をUV 365レーザーに設定します。両方の露光でUVフィルターを有効にし、露光を割り当てます。

1をカメラ1の露光に、2をカメラ2に設定します。露光時間を、露光1は800 millisecondsに、露光2は40 millisecondsに設定してください。

次に、露光を選択し、フォーカス高さを0 µmに設定します。ピントが合った後、フォーカスを選択します。カメラ1で露光します。

焦点高さを調整して露光面を最適化し、「take height」をクリックします。露光パラメータを保存し、露光2についても同様に繰り返します。「experiment definition」タブを選択し、レイアウトおよびサブレイアウトを作成します。

関連するレイアウト、露光設定、リファレンス画像、スキュー、クロップファイル、およびサブレイアウトをドラッグ・アンド・ドロップします。実験設定を保存します。自動実験タブを選択し、通常条件下で画像を収集します。

Grab twoは細胞全体に局在しています。成長因子受容体の刺激を受けると、これは細胞膜へと移行し、その後エンドソームへと内部移行します。この図の上パネルでは、GFP grab twoを一過性に導入したCO M six細胞を示しており、予想通り、蛍光は細胞全体に分布しています。

しかしながら、GFP-Grab2と細胞表面受容体であるEGFRを一過性に共 transfection した細胞では、下パネルに示されるように、Grab2がエンドソーム様構造へと移行します。したがって、ゲノムワイドライブラリーを適用することで、新規のGrab2結合性細胞表面タンパク質を同定できると期待されます。本手法は、細胞表面タンパク質の検出に限定されるものではありません。

例えば、Grb2介在性エンドサイトーシスに関与するGAPのDYNAMIN 2は、Grb2の移行を誘導します。本実験では、GFP-Grb2とDNM2をHEK 293T細胞に共導入しました。赤色の円で囲まれた細胞により、GFP-Grb2がエンドソーム様構造へと再局在していることが示されています。

この手順に続き、共沈降法や生化学的アッセイなどの他の手法を用いて、相互作用が直接的なものであるか間接的なものであるかといったさらなる疑問を明らかにすることができます。このビデオを視聴することで、細胞内でのタンパク質間相互作用を特定するための発現クローニングの使用方法について、十分に理解できたはずです。