発現クローニングによりGrb2のシグナル伝達複合体を研究するために高コンテンツイメージングワークフロー
October 30th, 2012
有能な膜貫通型受容体のシグナリング小説を同定するためのハイコンテンツスクリーニング方法が記載されている。この方法は、大規模な自動化に適しているとの予測を可能にするタンパク質の結合および哺乳動物細胞におけるタンパク質複合体の細胞内局在。
次の実験の全体的な目標は、Grab twoとタグ付けされた緑色蛍光タンパク質のCDNA発現クローニングと変化の観察により、Grab twoの相互作用パートナーを特定することです。これは、まず第2のステップとして細菌ライセートからCD NAライブラリーを調製することで達成されます。CDNAはヒト胚性腎臓細胞にトランスフェクションされ、その結果、目的の遺伝子とともにレポーターコンストラクトが発現します。
次に、トランスフェクションされたプレートをオペラ顕微鏡で分析して、細胞全体のグラブ2つの局在の変化を視覚化し、上皮成長因子受容体が関与するGFPの動員を示す結果が得られます。蛍光顕微鏡法に基づいてエンドソームに2つをつかみます。これら2つのハイブリッドのような既存の方法と比較したこの技術の主な利点は、相互作用パートナーの細胞内分布を考慮に入れた生理学的状況で、グラブ2の相互作用パートナーを特定できることです。
しかし、この方法はGrab twoによるシグナル伝達の同定に使用することができます。また、目的の他のタンパク質などの他のシステムにも適用できます。CDNAライブラリーは、グリセロールストック中の単一の細菌クローンを提供します。
96ウェル形式で、Hudson Rapidピックライトのピッカーメニューにあるrerayコマンドを使用します。ソースプレートから細菌クローンを採取し、96ディープウェルプレートで1.5ミリリットルポンドアンペアに接種します。深井戸プレートをガス透過性シールで遅く密封し、シェーカーで摂氏37度で一晩インキュベートします翌日、細菌Aを含む深井戸プレートを2000RPMで20分間回転させます。
卓上型遠心分離機でプレートアダプターを使用して、細菌ペレットをそのままウェルから培地を吸引します。次に、Tecan Freedom Evo Automationワークステーションのデッキを次のように構成します。プラスミド調製用の溶液をトラフ1〜5に分配し、デッキに深いウェルプレートを置きます。
深井戸プレートのロードチップに隣接するalucian溶液を含むマルチウェルトラフをチップラックに配置します。バキュームマニホールドを組み立てます。プラスミド結合プレートはマニホールドの内側に配置され、プラスミドフィルタープレートはマニホールドResus懸濁ペレットの上に250マイクロリットルの溶液1
で配置されます。Resusサスペンションバッファーは、ピペッティングで上下します。ペレットが完全に再懸濁されていることを確認することは、この手順を成功させるために重要です。シェイカーは、上下にペッティングしてもペレットが完全に再懸濁しない場合に使用できます。
ペレットが完全に再懸濁されたら、溶解バッファーに250マイクロリットルの溶液を追加することで細菌が横たわっています。プレートをシールし、反転させて完全に混合できるようにします。タイマーを 2 分に設定します。
次に、350マイクロリットルの溶液3を追加します。中和バッファー。プレートをシールし、3倍のラインを反転させます。
細菌溶解物をプラスミドフィルタープレートに移します。真空を5分間加えます。フィルタープレートを取り外し、マニホールドの上にバインディングプレートを置きます。
真空を1分間かけます。500マイクロリットルの洗浄バッファーを追加し、2分間真空を適用します。900マイクロリットルの洗浄緩衝液4を加え、2分間真空を印加する。
その後、900マイクロリットルの洗浄緩衝液を再度4つ加え、15分間真空を適用します。DNAコレクションプレートをマニホールドの内側に置きます。100マイクロリットルのElucianバッファーを結合プレートに加え、2分間インキュベートします。
真空を10分間加えます。最後に、コレクションプレートを取り外し、NanoDrop 8, 000を使用してDNA濃度を測定します。典型的には、この手順を開始するために、この方法でマイクロリットル当たり約100ナノグラムの収率が期待できる。
hec 2 9 3細胞がtrypsされ、初期化され、カウントされます。自動ディスペンサーを使用して、Perkin Elmerの各ウェルに4つのセルに10回を2回分注します。View plate トランスフェクションのために、細胞を摂氏 37 度、二酸化炭素 5% で一晩インキュベートします。
自動リキッドハンドラーを使用して、丸底96、ウェルプレート100ナノグラムのGFPの各ウェルに次の混合物を調製する。25 μLの無血清培地中に100ナノグラムのCD NAを含む2つのプラスミドDNAをグラブします。次に、ウェルミックスごとに0.5マイクロリットルのトランスフェクションを含む25マイクロリットルの無血清培地を加え、タイマーを30分間開始します。
30分後、CDNAトランスフェクトで50マイクロリットルをミックスして細胞に移します。穏やかなディスペンス方法を使用します。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。
画像取得を開始するには、Opera ソフトウェアを起動します。設定タブを選択し、20倍の目的と正しいプレートタイプを選択します。カラーが対物レンズの正しい値に設定されていることを確認して、さまざまなプレートタイプで焦点を合わせることができます。
次に、顕微鏡タブを選択し、露光 1 を fite 4 88 レーザー、露光 2 を UV 365 レーザーとして定義します。両方の露出でUVフィルターをアクティブにし、露出を割り当てます。
1つはカメラに、1つは露出に。カメラ2に2。露出時間は、露出時間を 800 ミリ秒、露出は 1 ミリ秒と 40 ミリ秒に設定します。
2つは露出を選択し、1つはフォーカスハイトをゼロミクロンに設定します。ピントが合ったらフォーカスを選択します。カメラ1を露出します。
フォーカスの高さを調整して露出面を最適化し、[高さを撮影]をクリックします。露出パラメータを保存し、露出に対して繰り返します。2つ目は、実験定義タブを選択し、レイアウトとサブレイアウトを作成することです。
関連するレイアウト、露出、参照画像、傾斜、トリミングファイル、サブレイアウトをドラッグアンドドロップします。実験を保存します。自動実験タブを選択し、通常の条件下で画像を取得します。
グラブ 2 は、セル全体に局在しています。成長因子受容体を刺激すると、細胞膜に移行し、続いてエンドソームに取り込まれます。この図では、上面パネルにGFP grab twoで一過性にトランスフェクションしたCO Mの6個の細胞が示されており、予想通り、蛍光は細胞全体に分布しています。
しかし、GFPグラブ2と細胞表面受容体IT EGFRグラブ2を一過性にトランスフェクトした細胞では、底面パネルに示すようにエンドソーム様構造に再配置されます。このように、ゲノムワイドライブラリーを応用すると、新規なGrab 2つの結合細胞表面タンパク質を同定できると期待できます。この方法は、細胞表面タンパク質の検出に限定されません。
例えば、GPAのDYNAMIN twoは、grab twoを介したエンドサイトーシスに関与しており、grab twoの転座を誘導します。この実験では、GFPグラブ2をDNM 2とともにHEC 2 93 T細胞にコットトランスフェクションしました。GFPグラブ2からエンドソーム様構造への移動は、赤い円の中の細胞によって示されています。
この手順に続いて、免疫沈降や生化学的アッセイなどの他の方法を使用して、相互作用が直接的か間接的かなどのさらなる質問に答えることができます。このビデオを見れば、細胞内タンパク質の相互作用を同定するための発現クローニングの使用方法を十分に理解できるはずです。
概要
この記事では、大規模自動化に適した新しいシグナル伝達能を持つ膜貫通受容体を同定するための高含量スクリーニング法について説明します。この方法により、哺乳類細胞内でのタンパク質の結合とタンパク質複合体の細胞小器官局在の予測が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- シグナル伝達
背景
- タンパク質相互作用の理解は、細胞シグナル伝達経路の解明に不可欠です。
- 従来の方法は生理的条件を正確に反映していない可能性があります。
- 高含量スクリーニングにより、自動化された効率的な分析が可能になります。
- GFPタグ付けにより、タンパク質局在の視覚的な洞察が得られます。
研究目的
- CDNA発現クローン法を用いてGrab2の相互作用パートナーを同定する。
- 刺激に対するGrab2局在の変化を観察する。
- タンパク質相互作用の生理的文脈を提供することで、既存の方法を改良する。
使用した方法
- 細菌溶解物からのCDNAライブラリの調製。
- 報告子構築を用いたヒト胚腎細胞のトランスフェクション。
- 蛍光顕微鏡を用いたトランスフェクト細胞の分析。
- プラスミド調製および細胞トランスフェクションプロセスの自動化。
主要な結果
- GFPタグ付きGrab2は細胞全体に局在し、刺激時に質膜へ移行します。
- 上皮成長因子受容体との相互作用により、エンドソームへの内在化が起こります。
- この方法は生理的文脈におけるタンパク質相互作用を成功裏に同定します。
- 結果は他の関心タンパク質への潜在的な応用を示しています。
結論
- 高含量スクリーニング法は、タンパク質相互作用の研究に有効です。
- このアプローチはGrab2以外にも様々なシグナル伝達経路に適用できます。
- 自動化により、スクリーニングプロセスの効率性と拡張性が向上します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-content imaging of Grb2 signaling complexes via expression cloning enables direct visualization of protein-protein interactions in mammalian cells, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. This workflow provides quantitative and spatially resolved data on signaling complex formation, enhancing predictive confidence at the discovery-to-lead inflection point. The approach is broadly applicable for portfolio triage and prioritization of signaling pathway targets in oncology and cell signaling research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping Grb2 interaction networks in a physiological context.
- Supports biological de-risking by visualizing subcellular localization and complex formation in live mammalian cells.
- Facilitates functional target validation through quantitative assessment of protein recruitment and relocalization.
- Improves predictive confidence for advancing signaling pathway targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for high-content screening of protein-protein interactions.
- Standardizes assay conditions for reproducible, quantitative imaging outputs across cDNA libraries.
- Enables scalable, genome-wide identification of novel Grb2-binding proteins for downstream evaluation.
- Supports reliable compound or genetic perturbation screening by providing robust localization readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant signaling pathways by modeling Grb2 recruitment in mammalian cells.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling follow-up biochemical confirmation.
- De-risks mechanistic assumptions prior to in vivo model investment.
- Facilitates identification of translational biomarkers linked to Grb2 signaling dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This high-content imaging workflow integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and unbiased screening strategies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by visualizing Grb2 complex formation in response to diverse stimuli.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for high-throughput identification of interaction partners.
- Analytics: Delivers quantitative localization and recruitment metrics to compare experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and mechanistic continuity into preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and expression cloning platform adaptable to other signaling proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales protein interaction screening in mammalian systems.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by prioritizing validated targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and triage of signaling pathway assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high-content imaging, cell culture, and molecular cloning.
- Needs access to automated liquid handling, fluorescence microscopy, and image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data interpretation criteria.
- Adaptable to various mammalian cell lines and signaling proteins with appropriate construct design.
- Dependent on robust image acquisition and quantitative analysis pipelines for reliable outputs.
