膣洗浄、クリスタルバイオレット染色、およびマウス発情周期ステージング識別のための膣細胞学的評価を行う

この研究で実施されたすべての手順は、オタワ大学アニマルケア委員会とカナダ動物ケア評議会によって定められたガイドラインと規制に従って実施されました。生殖状態とげっ歯類を迅速に評価する手段は、生殖機能障害の研究だけでなく、新しい疾患モデルマウスの作製や、病理学的課題後の組織変性または再生のホルモン制御の研究にも必要である。ここでは、膣塗抹標本に存在する主要な細胞タイプの単純で非侵襲的な細胞学的評価により、任意の日の雌マウスの生殖周期の段階を特定する方法について説明します。

ミラーリング生殖またはエストロサイクルは、4つの段階に分けられます。PROEs es、metes、およびdriskは、卵巣ステロイド、17ベータエストラジオールおよびプロゲステロン、ゴナドトロピン、黄体形成ホルモン、および卵胞刺激ホルモン、およびこれらの生殖段階を通じた黄体非トロピックホルモンプロラクチンシグナル遷移の循環レベルの変動を定義します。エスラ周期の発情前期は、月経周期のヒトの卵胞期に対応し、循環17ベータエストラジオールレベルの排卵前の増加、およびプロラクチンのわずかな急増によって定義されます。

17ベータエストラジオールの増加は、循環黄体形成ホルモンと卵胞刺激ホルモンレベルの上昇に続いています。卵胞刺激ホルモンレベルのピークは、排卵とESへの侵入を知らせます。ESストレス中、17ベータエストラジオールレベルはプロラクチンレベルに低下します。

met estroへのピークエントリーは、循環卵胞刺激ホルモンレベルの小さな急増と一致し、ヒト黄体期の始まりに対応します。プロゲステロンのレベルは上昇し始め、17のベータエストラジオールのレベルに2番目の小さな急増があります。コーパスに応答して、悲惨なマウスへのリウムの活性化エントリは、循環プロゲステロンレベルがピークに達し、ヒトに対応するときに発生します。

黄体後期。黄体の退行は、その後のプロゲステロンレベルの急激な低下とプロテへの侵入につながります。細胞の類型の変化は、上皮細胞の相対的な比率におけるこれらの根底にある内分泌イベントを反映しています。

膣塗抹標本で検出された定量化された細胞と白血球を使用して、各エスラステージを同定できます。こんにちは、私の名前はアシュリー・マクリーンです。私はオタワ大学のステファニー・ベネット博士の指導の下、神経再生研究室の研究者です。

そして、私はニコラス・バレンズエラです。私はオタワのカールトン大学のカールトンイマーシブメディアスタジオでスティーブンファイ博士と一緒に働いています。このビデオでは、ESTエクストラサイクルステージの決定に使用できる簡単なプロトコルについて説明します。

このプロトコルでは、主要な細胞類型と膣塗抹標本を評価することにより、発情促進、Esおよびd Esteの4つのマウス生殖段階を区別する方法を詳しく説明します。それでは始めましょう。このプロトコルでは、オートクレーブ、二重蒸留水、0.1%クリスタルバイオレット溶液の2つのアイテムを準備する必要があります。

染色液は、必要になるまで室温で密閉容器に保存できます。まず、滅菌された200マイクロリットルの先端にラテックス球根を置き、約100マイクロリットルの滅菌二重蒸留水を汲み上げます。先端のグラデーションはボリュームの目安としてお使いください。

マウスをホッパーに置き、彼女の後端があなたの方を向くようにします。彼女の尻尾をしっかりとつかみ、後端をそっと持ち上げます。マウスは前足を使ってホッパーをつかみます。

この時点で、マウスは排尿することがあります。その場合は、別のチップから二重蒸留水でその領域を洗い流します。二重蒸留水で満たされた先端の端を膣管の開口部に置きます。

球根をそっと押し下げ、水の量の4分の1から半分を膣管に排出します。次に、電球にかかる圧力をゆっくりと解放し、液体を先端に戻します。同じ先端バルブと液体を使用して、この前の手順を4〜5回繰り返します。

バルブに液体が吸い込まれるのを防ぐために、圧力を急激に解放しないでください。この目的には、フィルターチップが役立つ場合があります。マウスをケージに戻し、液体をスライドガラスに排出します。

スライドを室温で完全に乾かします。乾燥すると、これらのエステの余分な塗抹標本はすぐに、または後日染色することができます。風乾スライドをクリスタルバイオレットステインに1分間置きます。

スライドを二重蒸留水で1分間洗浄します。繰り返して、軽量ティッシュワイパーで余分な二重蒸留水をスライドから取り除きます。汚れた塗抹領域を避けるために、パイプには塗抹標本とカバースリップの上に約20マイクロリットルのグリセロールがありました。

された塗抹標本は、時間の経過とともにグリセロールマウント中の細胞から拡散するため、できるだけ早く光学顕微鏡で調べる必要があります。まず、塗抹標本全体を低倍率で調べます。代表領域を選択し、より高い倍率に移動します。

Pro Astraの段階では、細胞はほぼ独占的に有核上皮細胞です。追加の段階では、目にする細胞は主に扁平上皮の角化上皮細胞であり、通常は密集したクラスターを形成します。これらの細胞は不規則な形をしており、目に見える核はありません。

メットエストロ期では、まれな角化扁平上皮細胞が依然として観察されますが、現在では、より小さく、より暗く染色された白血球が優勢です。悲惨な段階では、扁平上皮化した扁平上皮細胞は、あったとしてもほとんどありません。残りの白血球は大量に存在します。

有核上皮細胞が観察され、単一細胞としてもクラスターとしても見られます。あなたが遭遇する可能性のある問題の1つは、尿があなたの塗抹標本を汚染することです。これが発生した場合は、塗抹標本を破棄し、ステージングに使用しないでください。

膣洗浄の方法をお見せしました。サンプルを採取し、これらのサンプルを染色し、細胞の類型を評価して、分析時の雌マウスのest追加サイクルの段階を決定します。要約すると、PROEの排卵前期には、循環する17のベータエストラジオールレベルのピークは、膣塗抹標本サンプル中の整形成された有核上皮細胞の優位性に反映されます。

卵胞刺激ホルモンレベルのその後のピークは、排卵とエストロ角化扁平上皮細胞への侵入を信号し、塗抹標本で優勢です。メトスの間、プロゲステロンレベルは上昇します。この時点の膣塗抹標本に存在する細胞型は、断片化された角質化した上皮細胞と、より小さく、より暗く染色された白血球です。

dsteでは、プロゲステロンがピークに達すると、有核上皮細胞が出現し始めます。白血球はまだ存在しています。雌マウスが定期的にサイクリングしていることを確認し、エストロサイクルの長さを確立するために、これらの評価は毎日実行する必要があり、2つの完全なサイクルにわたって評価することは、異なるマウスで拡張された悲惨な段階とエスラの段階を見るのが普通です。

これがあなたの性別とホルモンに焦点を当てた研究に役立つことを願っています、そしてあなたの実験に幸運を祈ります。