マウス生殖管粘膜からのリンパ球の単離

マウス生殖管からリンパ球を分離するための効率的な方法が記載されている。この方法では、効率的な分離を可能にするために酵素消化し、パーコール勾配分離を利用しています。この手法は、他の種で使用するためにもに適応可能である

この手順の全体的な目標は、マウスの生殖管からリンパ球を分離することです。これは、最初に生殖管全体を取り除き、組織を細かく刻んでリンパ球を組織から解放することによって達成されます。細かく刻まれた組織は、コラゲナーゼ8で消化され、摂氏37度で組織を激しく攪拌します。

磁気攪拌により、リンパ球はコールごとの勾配によって単離されます。最終的に、リンパ球はフローサイトメトリーによって特徴付けることができます この技術の意味は、生殖疾患の診断と治療に拡張されます。この方法により、組織リンパ球の挙動を理解することができますが、これは循環系から単離されたリンパ球とは異なることがよくあります。

この方法は生殖粘膜系への洞察を提供しますが、腸や呼吸器粘膜などの他のシステムにも適用できます。雌マウスを安楽死させた後、手術用ハサミを使用して低い正中線切開を行い、皮膚を開きます。腸をそっと脇に動かし、ucsを特定し、次にucsから膣開口部まで生殖管全体を分離して除去します。

生殖管をペトリ皿に入れます。ハサミを使用して、トラクト全体を縦方向に開きます。次に、組織を完全なRPMI 10培地を備えたシャーレに移します。

次に、生殖管を細かく切り、完全なRPMI 10とEDTAが入ったフラスコに移します。フラスコをマグネティックスターに置き、組織を室温で15分間毎回2回攪拌して、最後の攪拌期間後の上皮細胞を取り除き、上清を捨ててから、組織片を40マイクロメートルのセルストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に注ぎます。EDTA残留物を完全なメディアで洗い流します。

次に、ろ過した組織片を新しいRPMI 10とコラゲナーゼを入れた新しいフラスコに移し、1時間後に組織を激しく攪拌するために設定されたマグネティックスターで摂氏37度で断片を消化し、上清を100マイクロメートルの細胞ストレーナーを介して新鮮な50ミリリットルの円錐管に注ぎ、ろ過した細胞懸濁液を氷上に保ちます。コラゲナーゼを含む新しいRPMI 10を元のフラスコに加え、毎回新鮮な完全なRPMI 10とコラゲナーゼを使用して組織をさらに2回攪拌します。3回目の消化後、目に見える組織片が溶液中に存在してはなりません。

次に、3つの消化物からの上清を一緒にプールします。細胞を410G、摂氏4度で5分間回転させ、上清を捨てます。まず、細胞ペレットを新鮮な40%/コール溶液で懸濁します。

細胞懸濁液を40%/コールでグラジエントチューブに加え、次に慎重に下敷きにし、新たに調製したものを等量で下敷きにします。 コールあたり70%。次に、グラジエントサンプルを室温で20分間遠心分離し、ブレークオフします。

遠心分離後、ペロール勾配間の界面層でリンパ球を慎重に採取します。次に、回収した細胞をRPMI 1〜3で室温で10分間洗浄します。最後に、sup natantを廃棄した後、所望の実験手順に従ってリンパ球を適切な溶液に再懸濁する。

このドットプロットは、クラミジア尿胚葉腚胚膣内感染マウスの生殖管から単離されたリンパ球集団の一例です。感染の7日後、単一細胞懸濁液をCD3陽性リンパ球上でゲーティングし、その発生後にCD4およびCD8を発現する細胞について分析した。この技術は、研究者が生殖リンパ球の機能と、ヒトの疾患を模倣するウイルスマウス疾患モデルの細胞特性を探求する道を開きました。