Name: マウス生殖管粘膜からのリンパ球の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: 学ぶマウス生殖管粘膜からリンパ球を単離する手法。コラゲナーゼ消化とPercoll密度勾配遠心法を用いて、組織特異的リンパ球の挙動を解析し、生殖疾患の診断・治療研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は、資金助成R01-AI026328のためのNIH（KAK）およびR01-AI079004（KAK）に感謝。

1。生殖器の除去<ol><li>承認されたガイドラインを使用してマウスを安楽死させる。低正中切開を行い、皮膚を撤回。 </li><li>卵管から膣口に、全体の生殖管を分離し、削除します。 </li><li>ハサミで縦管全体を開きます。 </li><li>完全RPMI-10/EDTAとペトリ皿の中で細かい部分（&lt;約1mm）（下式参照）に微細手術用のハサミを持つ生殖器を切り取り、に設定マグネチックスターラー上で室温で125mlのフラスコ内の組織をかき混ぜる15分。この操作を2回繰り返し、その後上皮および他の残骸を含む上清は、破棄されます。 </li><li>セルストレーナー（40μmの）を通してフラスコの内容物を注ぐ。完全培地でのEDTAの残留物を洗い流してください。 熱不活化したRPMI 500ミリリットル（Gibco）を、10％ウシ胎児血清（FBS）、5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン、5mlの1M HEPES：完全RPMI/10。 完全RPMI-10/EDTA：10％5μMEとしたRPMI（同上）DTA </li></ol> 2。生殖器の組織を消化<ol><li> 20ミリリットル新鮮RPMI-10/collagenase持つ新しいフラスコ（下のレシピを参照してください）​​に組織片を移し、精力的に組織をかき混ぜるように設定マグネチックスターラーで1時間37℃で組織を消化。 完全RPMI-10/collagenase：使用前右、再構成するコラゲナーゼタイプVIII（σ; -20℃で保存するか、製造元の指示に従って）、450-500U/mlの最終濃度に完全RPMI/10に追加します。 </li><li>第一消化した後、氷上で細胞を維持し、100μmのセルストレイナーで上清を収集します。 </li><li>新しいフラスコに未消化の組織を移し、3つの別々の消化の合計のため新鮮な完全RPMI-10/collagenaseを使用して、ステップ2.1をさらに2回繰り返す。この時点で、目に見える組織片は、溶液中でないこと。 </li><li>プールのすべてのサンプルから一緒に清と100μm細胞ストレーナーを通して収集しています。 cをスピンダウンells。細胞ペレットをパーコール勾配を用いて分離されます。 </li></ol> 3。パーコール勾配を用いて生殖管細胞の分離<ol><li>使用前パーコールの各濃度を準備します。 <ul><li> 100パーセントアイソトニックパーコール：ミックス9時01株式パーコール（ファルマシアBiotch）対10倍のPBS。 HClを用いてpHを7.4にそれを。 </li><li> 40パーセントPercol液：100％等張パーコールと完全RPMI 60mlの混合40ミリリットル。 </li><li> 70％パーコール液：完全RPMI 30mlでミックス100パーセントアイソトニックパーコールを70ml。 </li></ul></li><li> 40％パーコールソリューションのステップ6から各細胞ペレットを再懸濁します。 70％パーコール等量の勾配を作るために使用されます。勾配管の設定には2通りの方法があります。 <ol><li>層の下で：慎重に下地層70％パーコールその後、最初の勾配管に40％パーコールと細胞懸濁液を追加します。 </li><li>上層：最初のチューブに70％パーコールを追加して、慎重にゆっくりと上のセルを含む40％パーコールを読み込むトップ。 </li></ol></li><li>グラデーションのサンプルは、ブレーキをオフにして20分間、@ 900×gで、室温で遠心分離されます。 </li><li>リンパ球は40％と70％パーコール層の間の界面層になります。慎重に、界面層を採取したRPMI午前1時03分で洗い、740 xgでスピンダウンします。リンパ球は、細胞ペレットにされ、さらに使用するために準備ができているでしょう。 </li></ol> 4。代表的な結果マウス生殖管及びフローサイトメトリー（FACS）分析からのリンパ球の分離の例を図1に示します。生殖器は7日、感染後膣内感染マウスクラミジアmuridarumから削除されました。二つの生殖器管をFACSによって、機能と表現型検査のための十分なリンパ球を持たせるために、一緒にプールした。上記で概説したように解剖した組織は、消化や離工程で処理された。単一細胞懸濁液は、様々な蛍光標識染色したマウスCD3、CD4およびCD8に対するモノクローナル抗体。図1は、CD3陽性Tリンパ球にゲートをCD8陽性T細胞に対するCD4陽性T細胞のドットプロットの表示を示しています。私たちの手順は、マウスモデルで異なる疾患で様々な免疫細胞の機能と表現型の特徴を評価するために、異なった疾患モデルの生殖器官から単離したリンパ球を調べることができます。これらには、樹状細胞などの多様な免疫細胞は、好中球、マクロファージ、NK細胞、NKT細胞、T細胞（抗原特異的T細胞）、B細胞等3月10日が含まれています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4391/4391fig1.jpg" /> 図1：リンパ球はここに示す方法を用いて、 クラミジアmuridarumに感染したマウスの生殖器官から単離した。完全分離手順の後、リンパ球を蛍光標識、CD3、CD4およびCD8で染色した。象限データは、CD3 +リンパ球にゲートをかけたCD4陽性を示す+とCD8 +とし、ゲート細胞の割合。

<ol><li>M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+perinatal+immune+development+on+mucosal+homeostasis+and+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation.</a> Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%222010+Sexually+Transmitted+Diseases+Surveillance%22">2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).</li>
<li>Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+tandem+copies+of+conserved+gp41+epitopes+incorporated+in+gag+virus-like+particles+elicit+systemic+and+mucosal+antibodies+in+an+optimized+heterologous+vector+delivery+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen.</a> Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).</li>
<li>Tang, V. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravaginal+infection+with+herpes+simplex+virus+type-2+%28HSV-2%29+generates+a+functional+effector+memory+T+cell+population+that+persists+in+the+murine+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract.</a> J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).</li>
<li>Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+genital+herpes+infection+in+mice+immunized+under+different+hormonal+conditions+correlates+with+induction+of+vagina-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue.</a> J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).</li>
<li>Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+delivery+of+CpG+oligodeoxynucleotides+expands+functional+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+vagina%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina.</a> Immunology. 114, 213-224 (2005).</li>
<li>Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-cell-mediated+cross-clade+protection+in+the+genital+tract+following+intranasal+immunization+with+inactivated+human+immunodeficiency+virus+antigen+plus+CpG+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides.</a> J. Virol. 79, 393-400 (2005).</li>
<li>Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+require+type+I+IFN+receptor+for+antiviral+responses+during+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection.</a> Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).</li>
<li>Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+IL-15+in+TLR-mediated+innate+antiviral+immunity+against+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection.</a> Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).</li>
<li>Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+innate+and+adaptive+immune+responses+against+herpes+simplex+virus+type+2+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model.</a> J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).</li>
<li>Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+estrous+cycle+on+local+humoral+immune+responses+and+protection+of+intranasally+immunized+female+nice+against+herpes+simplex+virus+type+2+infection+in+the+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract.</a> Virology. , 224-487 (1996).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このプロトコルでは、マウスの生殖器管からのリンパ球を準備する方法を示されており、容易に習得されています。このプロセスの最も重要な点は、氷の上に細胞を保持することによって、細胞の生存率を維持することです。このメソッドから細胞収率は、スキル、マウスの感染状況（ナイーブまたは感染翌日）、病原体（細菌、ウイルス、真菌）及びマウス生殖器官検討のセクション（卵管、子宮を取り扱う、技術に依存膣のセグメントや全体の生殖管）。私たちのグループとその他のユーザーは5月7日マウス生殖管異なるリンパ球集団で様々な研究を発表しました。我々の手で、1ナイーブBALB / cマウスから、全体の生殖器は90％の生存率で2×10 6個の細胞を生成することができます。多くの場面では、リンパ球をさらに機能的および/ ​​またはフローサイトメトリー解析3月10日に使用されます。本手法により、一般的に使用される単離法11、CEとの比較でllの収率は10倍に増加しています。この手順では、比較的長いですが、それは孤立したリンパ球のさらなる用途に応じて簡略化することができます。細胞は、フローサイト...

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>シグマライフサイエンス</td><td> C2139-1G </td><td></td></tr><tr><td>パーコール</td><td> GEヘルスケアバイオサイエンス</td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td>ライフテクノロジーズギブコ</td><td> 11875 </td><td></td></tr></tbody></table>

マウス生殖管粘膜からのリンパ球の単離

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

、消化器泌尿生殖器、及び気道では、このようなウイルスや細菌などの病原体1のエントリのポータルを提供するなど、粘膜表面。粘膜は、腸管内Peyersのパッチや気道における鼻関連のリンパ網内系組織などの病原体に対する免疫を生成するために、ホストの誘導サイトです。このユニークな機能は、生体防御システムの重要なプレーヤーとしての粘膜免疫をもたらします。多くの研究は、消化器、呼吸器の粘膜部位に焦点を当てている。しかし、生殖粘膜部位の少し調査があった。生殖器の粘膜は、細菌やウイルス感染などの性感染症（STD）のための一次感染のサイトです。性感染症は、今日の世界が直面する最も重要な健康課題の一つです。疾病管理予防センターは、米国で19万人が新たに感染毎年があると推定している。 STDsは毎年2米国の医療システムを170億ドルを費用、および即時、生涯健康への影響のコスト個人一層。この課題に立ち向かうためには、生殖粘膜免疫のより深い理解が必要とされ、リンパ球を分離し、これらの研究の重要なコンポーネントです。ここでは、再現性、他の種への適応のために変更することができる免疫学的研究のためのマウス雌の生殖器官からのリンパ球を単離するための方法を提示する。以下に説明する方法は、1つのマウスに基づいています。

マウス生殖管からリンパ球を分離するための効率的な方法が記載されている。この方法では、効率的な分離を可能にするために酵素消化し、パーコール勾配分離を利用しています。この手法は、他の種で使用するためにもに適応可能である

胃腸管、尿生殖器管、呼吸器管を含む粘膜表面は、ウイルスなどの病原体の侵入口となります。

この手順の全体的な目的は、マウスの生殖器管からリンパ球を単離することです。まず、生殖器管全体を取り除き、組織を細かく切り刻むことで、組織からリンパ球を遊離させます。細かく刻んだ組織をcollagenase eightで消化し、37 °Cで激しく撹拌します。磁気撹拌を行い、その後パーコール密度勾配遠心法によってリンパ球を分離します。最終的に、これらのリンパ球をフローサイトメトリーで解析することが可能です。この手法の応用は、生殖器疾患の診断および治療にまで及びます。本法を用いることで、循環系から分離されたリンパ球とは異なることが多い、組織リンパ球の挙動を理解することができるためです。この手法は生殖粘膜系の知見を得るためのものですが、腸管や呼吸器などの他の粘膜系にも適用可能です。雌マウスを安楽死させた後、外科用ハサミを用いて下腹部の正中線に切開を加え、皮膚を開きます。腸管を慎重に脇に寄せ、UCS（子宮角）を確認し、UCSから膣口までの一連の生殖管全体を単離して摘出します。生殖管をペトリ皿に置きます。はさみを使用して、管全体を縦方向に切り開きます。その後、組織を完全RPMI 10培地を入れたペトリ皿に移します。次に、生殖管を細かく切断し、完全RPMI 10およびEDTAを含むフラスコに断片を移します。フラスコを磁気攪拌機に載せ、室温で15分間の攪拌を2回行い、上皮細胞を除去します。最後の攪拌後、上清を廃棄し、組織断片を40 $\mu$mのセルストレーナーを用いて50 mLのコニカルチューブにろ過します。完全培地を用いてEDTAの残留物を洗い流します。次に、ろ過した組織片を、新鮮なRPMI 10およびコラゲナーゼを含む新しいフラスコに移し、37 °Cで消化します。マグネチックスターラーを用いて組織を激しく攪拌してください。1時間後、上清を100 µmのセルストレーナーを通して新しい50 mLコニカルチューブに注ぎ、ろ過した細胞懸濁液を氷上で保持します。元のフラスコに新鮮なコラゲナーゼ含有RPMI 10を加え、その都度新鮮な完全RPMI 10とコラゲナーゼを用いて、組織をさらに2回攪拌します。3回目の消化後には、溶液中に目に見える組織片が残っていない状態になります。次に、3つの消化液から得られた上清を合わせて回収します。細胞を410 G、4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。その後、細胞ペレットを新鮮な40% percoll溶液で再懸濁します。40% Percollを含む細胞懸濁液を勾配チューブに加え、その上に、調製したばかりの同量の70% Percollを慎重に重ねます。その後、ブレーキをオフにした状態で、室温で20分間、勾配サンプルを遠心分離します。遠心分離後、ペロール勾配の界面層にあるリンパ球を慎重に回収します。次に、回収した細胞をRPMI 1640で室温にて

isolation-of-lymphocytes-from-mouse-genital-tract-mucosa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ミルテニーMACのキットを用いてリンパ球の分離は、全体のリンパ組織のホモジネートから細胞を浄化するために信頼性の高い方法です。国内でのみ有効のシステムを使用して精製した細胞は通常、≥96パーセント純粋です。ここで、我々は、CD4 +...

CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

このビデオでは、採取したマウスのパイエルパッチからリンパ球が分離される様子を実演します。単離されたリンパ球は、さらなる分析に使用できます。...

マウスパイエルパッチからのリンパ球の単離

パイエル板の細胞の特定の亜集団（PPS）、腸管関連リンパ組織の主要な誘導部位の免疫学的機能を理解する上で関心が高まっている。ここでは、フローサイトメトリー解析と免疫染色のためのPPの凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルの概要を説明します。...

マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

他のT細胞サブセットとは異なるエフェクター機能を持つ、Th17細胞は、中央炎症性自己免疫に関与している。このインビトロのTh17分化プロトコルは、ナイーブCD4 + Tリンパ球は、Th17細胞に分化することができ、さらに自己免疫および宿主応答におけるそれらの役割を検討するかどうかを決定するための手段を提供する。...

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

リンパ節間質細胞の単離は、線維芽細胞網様体細胞、リンパ管および血液内皮細胞を得るための酵素消化と機械的脱凝集を含む多段階の手順です。記載された手順では、短時間の消化と自動機械的脱凝集を組み合わせて、生存リンパ節間質細胞の表面マーカーの劣化を最小限に抑えます。...

ネズミリンパ節間質細胞の単離

ここでは、マウスの皮膚から骨髄細胞を分離し、マラリア原虫のスポロゾイトの皮内注射後にリンパ節を排出するためのプロトコルについて説明します。採取した細胞のフローサイトメトリーは、寄生虫に対する皮膚およびリンパ節の炎症反応を特徴付けるための信頼性の高いアッセイを提供します。...

弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離<em&gt;マラリア原虫</em&gt;スポロゾイト

これらの細胞がさまざまな腸および全身の疾患において重要な役割を果たすという認識が高まっているため、腸リンパ球の定量的特性評価への関心が高まっています。このプロトコルでは、その後のフローサイトメトリー特性評価のために、異なる小腸コンパートメントから単一細胞集団を分離する方法について説明します。...

マウスの小腸リンパ球の単離およびフローサイトメトリーキャラクタリゼーション

リンパ球は、適応免疫応答の主要なプレーヤーです。ここでは、in vitroおよびin...

単離とマウスリンパ球の活性化

腸管関連リンパ組織パイエル排水腸間膜リンパ節など誘導サイトと粘膜を含むエフェクター...

マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

本研究で提案する小説とリンパ球の隔離のための効果的なプロトコル卵胞 T の流れフローサイトメトリーによる調査と同様に、体内と体外の機能アッセイにその後使用できますパイエル パッチ (PPs) からヘルパーおよび胚中心 B...

体液性免疫のキープレーヤーの解明: 高度なマウス Peyer のパッチからのリンパ球の隔離のプロトコルを最適化

この論文では、真皮リンパ管からマウス内皮細胞を磁気ビーズベースで単離する方法について説明しています。単離されたリンパ内皮細胞は、下流の in vitro 実験やタンパク質発現解析に使用できます。...

マウス真皮リンパ管内皮細胞の単離

学ぶマウス生殖管粘膜からリンパ球を単離する手法。コラゲナーゼ消化とPercoll密度勾配遠心法を用いて、組織特異的リンパ球の挙動を解析し、生殖疾患の診断・治療研究に応用可能です。

マウス生殖管粘膜からのリンパ球の単離

さらに動画を探す