蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング

この実験手法は、BRDUの取り込みと蛍光in situハイブリダイゼーションを組み合わせたもので、哺乳類染色体の複製タイミングを定量的に解析するために用いられます。まず、生存細胞にBRDUを取り込ませ、中期染色体を回収します。

次に、個々の複製染色体を特定するため、DNA FISHと連続的なBrdU抗体染色を組み合わせて実施します。続いて、顕微鏡を用いて、個々の有糸分裂像におけるFISHシグナルとBrdU取り込みの画像をキャプチャします。CytoVisionソフトウェアを使用して、各単離染色体上のBrdUまたはDAPIシグナルによって表されるピクセルの面積と強度を算出します。

この結果により、個々の再構成染色体およびそのホロセントロマーにおけるBRDU取り込み量を定量化し、比較することができます。本手法は個々の細胞を評価するため、近年開発されたハイスループットのマイクロアレイやDNAシーケンシングプロトコルと比較して、細胞集団の一部にのみ存在する染色体再構成における複製やタイミングの変化を検出することが可能です。また、本手法により、同一細胞内に存在する相同染色体間の直接的な比較が行えます。

また、染色体複製に影響を及ぼす染色体再編成を明確に同定する能力も備えています。本手順を実演する全染色体のタイミングは、私の研究室のリサーチアソシエイトであるLeslie Smithが担当します。細胞を150 mmの組織培養ディッシュに、およそ70%のコンフルエンスで播種し、適切な温度の細胞インキュベーター内で24時間培養してください。

回収前のポイント。10 µg/mLのBRDUを含む新鮮な完全培地で培地を補充します。BRDU含有培地で細胞を培養する期間は、細胞の種類や種によって異なります。

通常、G2期は2時間から5時間の間です。プレートから培地を除去し、10 mLを15 mLコニカルチューブに保存します。細胞を10 mLのPBSで洗浄し、残りのPBSを吸引除去します。

次に、0.25% trypsinを5 mL加え、細胞がプレートから剥離するまで室温でインキュベートします。細胞を回収し、懸濁液をあらかじめ用意しておいた10 mLの培地に移します。遠心分離により細胞をペレット化し、培地を0.5 mLだけ残してすべて吸引します。

パステールピペットを用いて細胞を十分に再懸濁し、細胞を浸透的に膨張させるために37°Cに温めた75 mMの塩化カリウムを3滴加え、パステールピペットで細胞懸濁液を混ぜ合わせます。次に、低張液をさらに0.5 mL加えます。低張液の総量を5 mLにし、ピペッティングにより混合します。

細胞の種類に応じて、細胞懸濁液を37°Cで20〜45分間インキュベートします。細胞を懸濁状態に保つため、チューブを傾けてインキュベートしてください。その後、400 ×gで10分間遠心分離します。

上清を0.5 mmまで除き、ペーストラーピペットを用いて細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。この時点では浸透圧により膨潤した細胞は脆弱であるため、細胞質膜を破壊しないよう注意してください。次に、カルノア固定液を3滴加え、穏かに混ぜ合わせます。

さらに0.5 millilitersの固定液を加えた後、固定液の全量を5 millilitersにし、ピペッティングして均一な細胞懸濁液にします。これらの固定済み細胞は、-20 °Cで遮光保存すれば数ヶ月間保存可能です。固定済み細胞を遠心分離で回収し、固定液を吸引除去した後、氷冷した顕微鏡下で、10倍量の固定液でペレットを再懸濁します。

スライドを約45度の角度に傾けます。細胞懸濁液を滴下し、広げます。固定液をスライド全体に十分に行き渡らせ、余剰分を排液します。

次に、スライドをペーパータオルの上に平らに置き、自然乾燥させます。倒立顕微鏡を用いて、サンプルに有糸分裂期の広がった細胞が存在するかを確認します。各スライドに 10 µg/mL の RNase A を含む 2X SSC を 2 µL 加え、37 °C で 1 時間インキュベートします。

室温で2 XSSC (pH 7.0) を用い、3分間の洗浄を3回行います。次に、室温でエタノール系列を用いてサンプルの脱水処理を3分間行います。その後、各サンプルを室温で風乾させ、冷却したマイクロ遠心チューブに移します。

ラベル化ヌクレオチド標識DNA基質 4 µg、10 X NIC転写バッファー、dNTPミックス、およびNIC転写酵素を加えます。反応液を 16 °C で一晩インキュベートし、70 °C で10分間加熱して反応を停止させます。その後、氷上で5分間冷却します。

次に、DNAをエタノール沈殿させるため、3 Mの酢酸ナトリウムを48 µL、0.25 µg/µLのcot-1 DNAを160 µL、および100%エタノールを1.2 mL加えます。サンプルを-80 °Cで10分間から一晩保存してDNAを沈殿させ、遠心分離を行い、ペレットを70%エタノールで洗浄します。風乾させたDNAプローブを40 µLの二回蒸留水に再懸濁し、back-SEP同時ハイブリダイゼーション用に、ラベル化されたback DNAの最終濃度を100 ng/µLにします。付属の原稿に詳述されている通り、cot-1 DNAを含むプローブカクテルを2種類個別に調製します。

プローブカクテルを75 °Cで10分間加熱し、変性させます。次に、37 °Cで30分間インキュベートし、cot 1DNAを反復配列に結合させます。その後、バックプローブとSプローブを3:2の比率で混合し、1サンプルあたり25 µLにします。

スライドを移動させ、サンプルを変性させます。スライドを70% フォームアミド含有 2X SSCに浸し、72 °Cで3分間インキュベートします。直ちに、4 °Cで3分間、エタノール系列を用いてサンプルの脱水を行います。

プローブ調製の完了前、室温で約10分間、各サンプルの風乾を行います。スライドウォーマーを用いてスライドを45 °Cで平衡化させます。その後、back Sプローブミックスを25 µL添加します。

各スライドにカバーガラスを静かに載せ、ハイブリダイゼーションステップのため、ゴムセメントですべての縁を密封します。サンプルを加湿したチャンバー内で37 °Cで一晩インキュベートします。38～40 °Cにて、50% IDE 2 XSSC pH 7.0を用いて、3分間のポストハイブリダイゼーション洗浄を3回行います。

洗浄液の最適温度はプローブによって異なります。バックグラウンドのハイブリダイゼーションが高い場合は、洗浄温度を上げてください。逆に、プローブのシグナルが弱くバックグラウンドがない場合は、洗浄温度を下げてください。

室温でPNバッファーを用いて3分間、1回洗浄します。BRDU検出のため、各スライドに200 µLのPNMブロッキングバッファーを加えます。室温・暗所内で10分間インキュベートし、ペーパータオルでスライドの液を拭き取ります。

次に、50 µg/mL の anti B-R-D-U-F-E 結合抗体を 100 µL 加え、37 °C で 30 分間インキュベートします。室温で PN バッファーを用いて 3 分間の洗浄を 3 回行います。各スライド上の余分な PN バッファーを取り除きます。

次に、dappy Antifa封入剤を20 µL加えます。スライドをペーパータオルで覆い、カバーガラスを押し下げて、気泡と過剰な封入剤を押し出します。CCDカメラを装着した蛍光顕微鏡を用いて、画像をキャプチャします。

100倍の対物レンズ、自動フィルターホイール、およびCytoVisionソフトウェアを使用し、Fitz filterを用いてBRDUを、サイド三色またはTexas Redフィルターを用いて染色体ペイント、バックエンド、およびセントロメアプローブをキャプチャします。また、核染色のためにDAPIフィルターを使用します。CytoVisionソフトウェア上で、BAC EPまたは染色体特異的ペイントプローブを用いて、目的の個々の染色体を同定します。

メタフェーズ（分裂期）の中期像から、目的の染色体をそれぞれ切り出します。DPIおよびFITZYの染色体画像を新しいウィンドウにコピー＆ペーストしてください。ツールメニューにあるグラフアイコンを選択すると、個々の染色体におけるFitzおよびdappy染色の領域と強さを表すグラフが生成されます。

これは、短腕から長腕にかけて染色体の長さに沿って線を描くことで行われます。ツールメニューでデータアイコンを選択し、ZIおよびdpiの算出面積と強度を表示するテーブルを生成します。次に、対象となる染色体のZIおよびDPI信号を選択します。

次に、テーブルアイコンにある強度（intensity）と面積（area）のボタンをクリックします。ソフトウェアが、各シグナルの1平方インチあたりのピクセル数の数値測定値を生成します。続いて、各染色体の平均ピクセル強度に、それらのピクセルが占める面積を乗じます。

染色体の最新の複製領域を可視化するための総ピクセル数を取得するには、染色体のアクティブな複製領域におけるBRDU取り込みのバンドパターンを評価します。次に、BRDUバンディングパターンの違いに基づき、染色体ペア間の複製タイミングの差を算出します。哺乳類細胞の染色体は時間的なプログラムに従って複製され、S期の開始時と終了時にそれぞれ早期複製と後期複製が起こります。

哺乳類細胞における典型的なS期は8〜10時間であり、G2期は通常2〜5時間です。この実験系では、BRDUを段階的に長い時間添加することで、複製される染色体の最終部分を標識します。これらの細胞は、6q16.1に位置するヒトASAR6遺伝子の欠失を有しています。BRDUで5時間処理した後、有糸分裂期の細胞を回収し、BRDUの取り込みおよび染色体6番ペイントプローブを用いた蛍光in situハイブリダイゼーション処理を行いました。その結果、2本の6番染色体に3つの蛍光標識が認められました。

BRDUのバンディングパターンの顕著な違いは、2本の6番染色体のうち1本の複製タイミングが2時間以上遅延していることと一致しています。Cyto visionソフトウェアに表示された2本の6番染色体におけるDPIとBRDUの信号強度プロファイルの差は、非同期複製を示しています。さらに、DPI染色の同様の解析と比較して、BRDUの取り込み総量に有意な差が認められます。

ヒトAR six遺伝子を含むバックプローブを導入することで、この細胞において長腕に欠失を持つ単一の6番染色体が強調されます。興味深いことに、非EDの6番染色体よりも、BrdUの取り込みがより強く、またBrdU取り込みのバンドパターンがより広範囲に及んでいます。7つの異なる細胞からの分裂期転展製剤を処理し、2本の6番染色体間における複製タイミングの差を定量化しました。

BRDUレベルは、欠失のある第6染色体と非EDの第6染色体の総ピクセル値の間で2倍以上の差を示しています。習得すれば、この手法は3日間で適切に実施することが可能です。これにより、同一細胞内に存在する相同染色体の複製タイミングの測定方法と、複製の変化と相関する染色体再編を明確に特定する方法について、十分な理解を得られたことと思います。

全染色体のタイミング。