3DNAを有する核酸構造の分析と構築

この手順の全体的な目標は、3D NAプログラムスイートを実験室の科学者などに提供し、最先端の計算ツールを使用してDNAとRNAの空間構成を調査することです。これは、最初に3D NAフォーラムからソフトウェアをダウンロードし、ローカルコンピューターにインストールすることで実現されます。第2のステップは、代表的なDNA構造を構成塩基対ステップのレベルで解析することです。

次に、同じDNA構造を塩基対ステップレベルで修飾し、新たに定義した塩基対ステップパラメータを用いて再構築します。次のステップは、関連する構造の大規模なアンサンブルの解析です。最後のステップは、関連するDNA構造のセットを共通の参照フレーム上にアラインメントして、構造の全体的な歪みを視覚化することです。

最終的に、3D NAツールを使用して、薬物やタンパク質に結合したステップを含む個々の塩基対ステップがDNAの全体的なフォールディングにどのように寄与しているかを調べ、大きな全球的な歪みの部位と方向を特定します。この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、ソフトウェアが堅牢で、さまざまな核酸含有構造に広く適用できることです。この方法は、ゲノムが3次元でどのように構成されているか、DNAがどのような変形を採用できるかなど、生化学および生物物理学の主要な質問に答えるのに役立ちます。

ソフトウェア・パッケージのインストールを開始するには、3つのDA website@xthreed.組織に接続し、フォーラム内の3D NAフォーラムへのリンクをクリックします。登録リンクを選択し、指示に従って新しいアカウントを作成します。

ユーザー名とパスワードを設定したら、フォーラムにログインし、ウェルカム セクションのダウンロード リンクを選択し、新しいページで 3D NA ダウンロードを選択します。tar gzファイルをダブルクリックして、3D NAソフトウェアを含むX 3D NA dash V2.1という名前のフォルダーを作成します。ターミナルアプリケーション (通常は Macintosh の utilities の下にあります) を開き、X 3D NA dash V 2.1 ディレクトリに移動します。

3D NA が正しく機能するために必要なセットアップ スクリプトを実行します。このビデオで使用されているすべてのコマンドは、テキストプロトコルで見つけることができます。次に、画面に印刷されて表示される2行のエクスポート設定をコピーします。

ユーザーがソフトウェアをアプリケーションディレクトリに配置した場合は、ここに示すように2行が表示されます。アプリケーションディレクトリにあるテキスト編集アプリケーションを開きます。書式メニューで、[プレーンテキストにする]を選択します。

BRCファイルが存在する場合は、テキストでファイルを開き、エクスポート設定を編集してファイルの最後に貼り付けます。いいえ、bash RCファイルが存在する場合は、エクスポート設定を空白のファイルに貼り付け、ホームディレクトリにbash RCというファイル名で保存します。新しい設定を利用できるようにするには、新しく保存したBashRCファイルをターミナルプログラム内で実行します。

このビデオでは、細菌Borrelia bergdorf eyeのHBBタンパク質に結合したDNAである代表的な核酸構造の分析を示しています。3D NA解析の最初のステップは、すべての対応塩基をリストアップしたファイルの作成です。これは、NP two, MP two pdb のファイルに格納されている原子構造に Find para プログラムを適用するコマンドを入力することによって行われます。

解析の次のステップは、構造を特徴付ける幾何学的パラメータを決定することです。コマンド analyze は、ベースペアファイルを入力として受け取り、作業ディレクトリに表示されるいくつかの出力ファイルを作成します。幾何学的値は、入力して計算し、2つのMPを2つのbpsで分析できます。

生成された出力ファイルには、計算されたパラメータの概要と、核酸構造の解析に加えて剛体パラメータのリストを含むbpcoステップparを含む2つのMP two outが含まれ、3D NAソフトウェアは、近似原子モデルを作成するためにrebuildコマンドを使用して剛体パラメータから構造モデルを構築する機能を提供します。 これには、バックボーン原子とベース原子の両方の座標が含まれます。テキストにリストされているコマンドを入力します。このコマンドは、剛体パラメータからのモデルの構築に標準のBDNAバックボーン確認を導入するように3D NAに指示します。

H-B-B-D-N-A構造にある剛体パラメータを持つ二重らせんモデルは、適切なコマンドを入力することで構築できます。bpco step par ファイルを編集して、変更された構造を生成できます。ここでは、最大の曲げの2つのサイトで形成される極端なロール角度が変更されます。

その後、変更されたステップパラメータのセットを入力ファイルとして構造体が構築されます。この2つのモデルは、単一の核酸を含む構造の分析とは対照的に、標準的な分子ビューアで表示できます。ビデオのこの部分では、MD アンダースコア セット 1 PDB という名前から始まり、数字で終わる、一連のファイル内の構造の大規模なアンサンブルを分析する方法を示します。

分析の最初のステップは、以前と同様にペア検索プログラムを実行して得られたペアのベースを特定することです。構造のセット全体が同じベースペアスキームを共有しているため、ここで代表的なファイルに対してペアを一度実行する必要があります。ファイルは1001で終わります。これにより、基本ペアリング情報が生成され、設定された 1 BPS PS のファイル MD に格納されます。次の手順では、Command X 3D ncore アンサンブルを使用して、ストラクチャーのセット全体の幾何学的パラメーターを見つけます。分析する。次に、セット1アウトでオーバービュー出力ファイルMDから目的の剛体パラメータを抽出できます。

これは、Command X three DCO ensemble extractを使用して実行されます。ロール角度が抽出され、ロール角度のコンマ区切りテキストファイルが作成されます。このファイルは、他のプログラムに読み込んで、さらに分析やプロットを行うことができます。

最新バージョンの3D NAには、ユーザーが共通の視点から複数の構造を見ることができる新機能があります。X three DCO ensemble reorient コマンドは、以前のプロトコルと同様に、共通のベース ペアまたはベース ペア ステップに関連する構造体のコレクションを重ね合わせます。最初のステップは、DNAの塩基対をfind pairプログラムで計算することです。

この場合、入力ファイルは、CIA大腸菌の10個の構造を含むファイルである2 KEK pdbであり、LACリプレッサータンパク質のヘッドピースに結合したO 3D NAオペレーターである。Command X three DCO ensemble reorientは、マルチモデル構造内の個々のモデルを共通の参照フレーム上に位置合わせします。このコマンドには、PDB ファイルと前の手順の基本ペア ファイルの両方を入力として必要とします。

また、このコマンドには、すべての構造体が整列するベースペアステップのIDも含まれます。W 3D NA Webインターフェースには、3D NAソフトウェアパッケージの一般的な機能がいくつか含まれています。ビデオのこの部分では、Webサーバーを使用してタンパク質で装飾されたDNAの3次元モデルを構築する機能に注目しています。

タンパク質で装飾されたDNAモデルを構築するための最初のステップは、W 3D NAのWebサイト(W three d.rutgers.edu)にアクセスすることです。ページの左上にあるメニューから再構築を選択すると、オンラインモデル構築機能がアクティブになります。次のステップは、新しいページの中央にある薄い影付きのボックスにある結合タンパク質DNAテンプレートリンクを選択することです。

この選択により、プルダウンメニューがアクティブになり、ユーザーは結合したタンパク質の数を指定できます。結合タンパク質の数を選択することで、新しい仕様ページに移動します。その後、ユーザーは目的の順序で入力または貼り付けることができます。

テキストボックスでは、新しいページの中央に、DNAの未結合領域のらせん状の確認を選択するためのプルダウンメニューがあります。仕様ページの下部近くには、結合したタンパク質の結合位置とファイル名を入力するためのテキストボックスがあります。結合位置は、DNA配列上のタンパク質結合フラグメントの中心の位置を指定します。

仕様ページの下部には、ユーザーがタンパク質結合DNAのプレビューを生成できるボックスがあります。この場合、そのボックスがオンになり、[続行]ボタンがクリックされます。このアクションにより、選択したパラメーターと、選択したバインディング サイトの重複から発生したエラーを一覧表示するレビュー ページが生成されます。

ユーザーは、変更を加える必要がある場合は戻るボタンを選択するか、ビルド ボタンを選択して続行できます。次のページには、DNAタンパク質複合体の最も拡張された配置の静止画像が表示され、Webを介したオンラインのインタラクティブな視覚化が可能になります。ユーザーは、原子座標を含むファイルをダウンロードすることもできます。

3D NAソフトウェアツールは、核酸構造の解析に日常的に使用されています。剛体パラメータの値は、ステップ13と22で見つかる大きな正のロール角を持つ主要な溝に曲がる極端なDNAの2つのサイトなど、3次元構造の歪みを明らかにします。DNAとボレリアバーグドルフ、RHBBタンパク質との結晶複合体。

これらの量から構造を再構築するソフトウェアの機能により、個々の塩基ステップと塩基対ステップが全体的な分子フォールドにどのように寄与しているかを判断することができます。ここに示すように、HBBによって誘発されるDNAの全体的な曲げは、上記の2つの極端な役割の歪み以上のものを反映しています。DNAは、これらの塩基対のステップをまっすぐにして再構築しても、大きく湾曲したままです。

これは、ロールの 2 つの最大値が 0 に設定されている場合です。3D NAでは、多数の関連構造を調べる新機能により、シミュレートされたDNAおよびRNA分子の空間配置の配列依存パターンと時間依存パターンの両方を抽出することが可能になりました。例えば、シミュレートされたDNA構造の2つの大きなセットにおける連続する塩基対間のロール角の黄色のコーティングは、ペルム紀のプリン塩基対ステップにおけるこれらの分子の優先的な曲げを明らかにしている。

赤で描かれたロールの値が高く、DNAの末端に短時間持続することは、二重らせん構造の局所的な融解と再ひざまずきを示唆しています。補完的なベース間の角度や距離など、他の剛体パラメータの変分パターンは、正確な構造歪みを解読するのに役立ちます。3D NAソフトウェアが共通の参照フレーム内の関連分子の向きを変更する機能により、タンパク質データバンクに保存されている多くのファイルに隠された全体構造の特徴が明らかになります。

例えば、対応する原子の二乗平均平方根近似に基づく関連構造の従来の整列は、ここで互いに大まかに重ね合わせる一連の類似した空間経路を生成し、大腸菌の10 NMRベースのモデルは、LACリプレッサータンパク質のヘッドピースに結合したO 3D NAオペレーターであり、 各二本鎖の5つの素数末端基底対上の共通の座標フレーム上の同じ構造の重ね合わせは、分子がかなり異なる方向に曲がるグローバル構造のかなりの歪みを明らかにします。構造変動性は、CIA大腸菌LACリプレッサータンパク質がO 3に結合し、LAC操作でO 3と順次離れたオペレーターとの間のループを誘導する容易さに影響を与える可能性があります。ここに示すように、Borrelia burgdorferi由来のHBBのような構造タンパク質の正確な配置は、DNAの全体的なフォールディングに劇的な影響を与える可能性があります。

既知の高分解能構造の2つのコピーが43塩基対(81塩基対)で区切られている場合、DNAフラグメントは密集したほぼ円形の構成に閉じます。2つのタンパク質がさらに5塩基対で分離されている場合、DNAは開いた蛇行経路をたどります。タンパク質の非常に異なる配置は、構造タンパク質の間隔がDNAの環化またはループにどのように影響するかを示しています その発達後。

この技術は、核酸構造生物学の分野の研究者が、DNAタンパク質の相互作用、RNA、フォールディング、ナノ粒子の設計を探求し、発生障害やがんなどの疾患をより深く理解し、新しい治療法を設計するための道を開きました。