ネイティブ、繊維状の長い間隔と分節ロング間隔コラーゲンのin vitro合成

これらの手順の全体的な目標は、コラーゲンモノマーを使用して、3種類の高次コラーゲン構造を再現性よく作製する方法を示すことです。天然コラーゲンは、コラーゲンモノマーの溶液のpHを上昇させることによって作られ、繊維状の長い間隔になります。コラーゲンは、コラーゲンモノマーとα1酸性糖タンパク質、およびセグメントの長い間隔を組み合わせて作られます。

コラーゲンは、TPにコラーゲンモノマーを混ぜて作られます。最終的に、原子間力顕微鏡は、形成された3つの異なるタイプのコラーゲン構造を特徴付けるために使用されます。これらのプロトコールが以前に発表された手順と比較した場合の主な利点は、目的のコラーゲン構造を形成するのがより簡単で、非常に再現性が高いことです。これらのプロトコルは、過去10年間にわたって私たちの研究室で開発され、コラーゲンモノマーの信頼できる商用ソースを出発点として、手順を示すのは、私の研究室の大学院生であるCalvin Changであり、明確な67ナノメートルのDBバンディングを持つ天然のコラーゲン繊維を作成するために開発されました。

ヒートブロックを摂氏37度に事前に温めることから始めます。次に、3ミリグラム/ミリリットルのコラーゲンモノマー溶液の4マイクロリットルでマイクロ遠心チューブに緩衝液を調製し、よく混合します。得られた溶液は透明で無色であるべきです。

混合物を摂氏37度の予熱ブロックに3〜4時間置き、天然のコラーゲン線維を形成します。最終的な溶液はわずかに濁っている必要があり、主に天然のコラーゲン線維を含み、繊維状の長い間隔のコラーゲンを調製します。まず、1ミリグラムあたり3ミリグラムのコラーゲンモノマー溶液を1ミリリットルから12〜14キロダルトンの分子量カットオフメンブレンに入れます。

次に、400ミリリットルの水に対して透析し、24時間で4回水を交換します。次に、透析したコラーゲンモノマー20マイクロリットルを超純水20マイクロリットルと3ミリグラム/ミリリットルの20マイクロリットルと組み合わせます。水中のα 1酸性糖タンパク質を一緒にマイクロ遠心チューブに入れて混合します。

線維性肺間隔コラーゲンを室温で30分間組み立てます。この間、解決策は晴れから曇りになり、病気の精神的に長い間隔を形成します。コラーゲン。まず、酸性緩衝液をマイクロ遠心チューブに調製します。

1ミリリットルあたり10ミリグラムの40マイクロリットル、TPを水で緩衝液に加え、混合します。さて、最後に、0.01にある3ミリグラム/ミリリットルのコラーゲンモノマー溶液の33マイクロリットルを追加します。通常の塩酸と混合して組み合わせます。

セグメント長間隔コラーゲンを室温で2時間かけて組み立てます。この調製物では、説明されている他の2つの形態のコラーゲンとは異なり、最終的な溶液は明確になります。原子間力顕微鏡やFM用のきれいな平面を得るには、MICA製のA FM基板に粘着テープを貼り付け、少なくとも1つの層を剥がします。

テープをチェックして、レイヤー全体が除去されたことを確認します。適切な表面が得られたら、20マイクロリットルのコラーゲンFI溶液をマイカ基板に塗布し、5分間放置します。5分後、MICA基質の端に水を加え、サンプル上を10〜15秒間流して、余分なフィブリルを洗い流します。

サンプル領域に直接水を加えないでください。次に、基板の一方の端から窒素ガスを穏やかに流して表面を乾燥させます。ストリームをサンプルの中心に向けないように注意してください。

光学顕微鏡でサンプルを200倍の倍率で、天然の繊維状の長い間隔でチェックします。コラーゲンサンプルは線維の塊を示していますが、セグメントの長い間隔のコラーゲンは見えません。さまざまなコラーゲンのユニークな特性が最もよく観察されます。

A FMを使用して、最初の100 x 100マイクロメートル四方のスキャンを実行し、次にズームインして10 x 10マイクロメートル四方のスキャンサイズに拡大し、最後に2 x 2マイクロメートル四方のスキャンを実行します。天然および線維性肺の間隔のバンディング周期性を観察すること。コラーゲンは、分節肺間隔コラーゲンのより細かい特徴でした。

天然コラーゲンfisについては、シリコンa FMプローブを使用して原子間力顕微鏡を間欠接触モードで実行し、繊維状の長い間隔とセグメント的な長い間隔を実現します。コラーゲンfiは、原子間力顕微鏡を接触モードで実行し、最良の結果を得るために亜硝酸ケイ素とFMプローブを使用します。コラーゲンサンプル上の少なくとも他の2つの領域をチェックして、最初のスキャンが代表的なものであることを確認します。

FMの高い空間分解能は、このビデオで説明されているコラーゲンのさまざまな調製物を特徴付けるのに理想的です。天然のコラーゲン繊維、繊維状の長間隔コラーゲン、分節長間隔コラーゲンの光学顕微鏡技術である微分干渉コントラスト顕微鏡法は、FISを示しますが、ナノメートルスケールの特徴を示すことはできません。これらの方法で調製された3種類のコラーゲンを区別します。一般的なサンプルでは、FMによる100 x 100マイクロメートル四方のランダムスキャンにより、5〜50ミクロンの長さの少なくともいくつかのフィブリルが分離された個体が見られます。

コラーゲンフィスは、この段階で簡単に識別することができ、10マイクロメートル四方のスキャンサイズで参加するためにズームインすると、すべてのフィがバンド状であることがわかります。バンディングの周期性を正確に測定するには、2 x 2マイクロメートル四方のスキャンサイズにズームインするのが最善です。10 x 10 マイクロメートル四方のスキャンサイズにズームインすると、すべてのフィブリルがバンド状になっていることがわかります。

バンディングの周期性を正確に測定するには、2 x 2マイクロメートル四方のスキャンサイズにズームインするのが最善です。コラーゲンをロングスペーシングコラーゲンの手順に従って調製すると、バンディング期間が長くなり、繊維長に沿って270ナノメートルのリピートが生成されます。一般的なサンプルでは、FMによる100×100マイクロメートル四方のランダムスキャンにより、少なくともいくつかのフィブリルが見られます。

バンディングの周期性は、10 x 10 マイクロメートル四方のスキャンにズームインすると確認でき、2 x 2 マイクロメートル四方のスキャンで簡単に測定できます。最後に、セグメントの長い間隔のコラーゲンは、繊維をまったく形成せず、個々のセグメントを形成します。一般的なサンプルでは、FMによる100 x 100マイクロメートル四方のランダムスキャンにより、多くの個々のドットが表示されます。

10 x 10 マイクロメートル四方のスキャンでは、いくつかの SLS クリスタライトが示され、2 x 2 マイクロメートルの正方形スキャンでは、SLS クリスタル ライトのより細かい構造が示されています。このビデオを見れば、市販のコラーゲンモノマーから均一な成熟した天然FLSおよびSLSコラーゲンコンストラクトを作る方法についてよく理解できるはずです。コラーゲンは生体適合性のある材料であり、細胞や組織を成長させるための基質または足場として有用です。

この手順により、これらのアプリケーションや他のアプリケーションに適したコラーゲン構造から始めることができます。